辛珊，李榕，謝全亮，寇偉，李鴻彬,2*

（1石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 石河子，832003；2石河子大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832003）

棉纖維細(xì)胞色素單加氧酶基因GhCYP714A1促進(jìn)活性氧的累積

辛珊1，李榕1，謝全亮1，寇偉1，李鴻彬1,2*

（1石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 石河子，832003；2石河子大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832003）

本研究利用RT-PCR技術(shù)從陸地棉纖維組織中克隆得到了1個(gè)棉花細(xì)胞色素P450基因（Cytochrome P450 714A1）的全長(zhǎng)cDNA序列，將該基因命名為GhCYP714A1。序列分析發(fā)現(xiàn)，該cDNA包含1563 bp的完整開放讀碼框，編碼521個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，理論分子質(zhì)量為57.31 kDa；氨基酸序列生物信息學(xué)分析顯示，GhCYP714A1蛋白具有跨膜結(jié)構(gòu)域和多個(gè)蛋白結(jié)合位點(diǎn)；進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，棉花GhCYP714A1與禾草SiCYP714B1在進(jìn)化上親緣關(guān)系上較近；半定量RT-PCR的組織表達(dá)特異性分析表明GhCYP714A1基因與纖維突起形成發(fā)育有關(guān)。本研究構(gòu)建了 pET28a-GhCYP714A1原核表達(dá)載體并進(jìn)行體外誘導(dǎo)表達(dá)，獲得分子質(zhì)量約為 57.31 kDa的重組蛋白。將GhCYP714A1基因轉(zhuǎn)化煙草驗(yàn)證其參與活性氧產(chǎn)生的功能，與非轉(zhuǎn)基因的野生型煙草相比，轉(zhuǎn)基因煙草葉片中具有較高的H2O2累積。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為深入研究該基因在棉纖維發(fā)育中的作用奠定了基礎(chǔ)。

棉花纖維發(fā)育；細(xì)胞色素P450基因；細(xì)胞伸長(zhǎng)；活性氧

棉花是世界上最重要的經(jīng)濟(jì)作物。棉纖維作為優(yōu)良的天然纖維，是重要的紡織工業(yè)原料[1]。由于傳統(tǒng)遺傳育種基礎(chǔ)狹窄、產(chǎn)量和品質(zhì)存在負(fù)相關(guān)等原因，細(xì)胞的伸長(zhǎng)或膨大發(fā)育與纖維的品質(zhì)密切相關(guān)[2]。因此，利用基因工程技術(shù)改良棉花纖維產(chǎn)量和品質(zhì)成為目前研究的新策略和熱點(diǎn)。

激素顯著影響植物組織器官發(fā)育和細(xì)胞的極性生長(zhǎng)[3-5]。細(xì)胞色素P450基因（CYP450）是細(xì)胞色素單加氧酶的家族成員，與植物活性氧(ROS)的產(chǎn)生密切相關(guān)，ROS的水平對(duì)纖維的發(fā)育影響重大[6]。赤霉素GA是一類廣泛存在于植物等生物中的二萜類化合物，GA能夠通過影響細(xì)胞內(nèi)活性氧（Reactive oxygen species,ROS）促進(jìn)纖維的發(fā)育[7]，通過超量或抑制GA代謝酶基因的表達(dá)可調(diào)節(jié)植物內(nèi)源GA活性，進(jìn)而控制植物的生長(zhǎng)和發(fā)育[8]。CYP450是GA失活酶類的一種，能夠通過抑制細(xì)胞內(nèi)GA含量而影響細(xì)胞發(fā)育。水稻中的細(xì)胞色素P450單加氧酶EUI (CYP714D1)是GA失活酶類的一種，可以催化非-13-羥基赤霉素(GA12,GA9和 GA4)的氧化[9]；水稻中P450基因的過表達(dá)會(huì)造成GA缺失而使植株嚴(yán)重矮化[9]。擬南芥中有2個(gè)CYP714成員，CYP714A1和CYP714A2，已有報(bào)道研究表明CYP714A1或者CYP714A2過表達(dá)植株的擬南芥會(huì)表現(xiàn)出嚴(yán)重的矮化表型[9]。

本研究從棉花纖維組織中克隆得到了細(xì)胞色素P450基因GhCYP714A1，并對(duì)其編碼的蛋白進(jìn)行序列功能結(jié)構(gòu)域分析，構(gòu)建原核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，研究其在活性氧產(chǎn)生過程中的作用，以期為深入探研究該基因參與棉花纖維發(fā)育的重要功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

植物材料為陸地棉品種徐州142棉花，纖維細(xì)胞經(jīng)液氮速凍后于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌菌株Top10及原核表達(dá)載體為pET28a由本實(shí)驗(yàn)室保存；克隆載體為大連寶生物pGEM-T vector。

1.1.3 酶及生化試劑

RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaKaRa LA Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、BamHⅠ、XhoⅠ等相關(guān)酶購自大連寶生物公司；DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取微量試劑盒購自TIANGEN公司；其他相關(guān)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，購自上海生工生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 棉花總RNA的提取

采用改良的CTAB法提取棉花胚珠總RNA[10]。所使用的研缽經(jīng)高溫烘烤數(shù)小時(shí)，其他器皿均用

DEPC水浸泡后滅菌。

1.2.2 GhCYP714A1基因的克隆

利用 GenBankEST數(shù)據(jù)庫拼接獲得的完整cDNA序列，利用Primer Premier 5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。用Prime-ScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒以總RNA為模板合成cDNA[11]，通過PCR擴(kuò)增獲得GhCYP714A1全長(zhǎng)的cDNA基因。設(shè)計(jì)引物是在上下游引物的兩端添加BamHⅠ和XhoⅠ的酶切位點(diǎn) (下劃線)和保護(hù)性堿基:正向引物：5'CGCGGATCCATGGACAAG TCCCATATTTTGTC3'；反向引物：5'CCGCTCGAGGATGTTTTGAATTAGAATATGTACACC3'。PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min，95℃變性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min；4℃存放。

1.2.3 蛋白質(zhì)序列比對(duì)和結(jié)構(gòu)域分析

蛋白質(zhì)序列比對(duì)利用Clustalx1.81軟件和Predict Protein網(wǎng)站在線完成，采用MEGA軟件構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.2.4 pET28a-GhCYP714A1原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

將克隆得到GhCYP714A1基因cDNA的PCR產(chǎn)物經(jīng)過回收后連接到pGEM-T19載體上，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞，菌落PCR鑒定后挑取陽性單克隆，搖菌做穿刺管后送至華大基因公司測(cè)序。將經(jīng)測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pGEM-T-Gh-CYP714A1和pET28a原核表達(dá)載體同時(shí)用BamHⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切，回收目的基因小片段和原核表達(dá)載體大片段，并將回收好的大小片段按一定體系用T4-DNA連接酶4℃過夜連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞，涂布于50 mg/L卡那霉素抗性固體LB培養(yǎng)基37℃恒溫箱中培養(yǎng)12 h，挑取單克隆進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定。

1.2.5 GhCYP714A1重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE鑒定

將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pET28a-GhCYP714A1和空質(zhì)粒pET28a轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)PCR鑒定后挑取陽性單克隆菌落接種于10 mL含50 mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜。各取上述過夜菌1ml轉(zhuǎn)接入50 mL含50 mg/L卡那霉素的LB中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.4-0.6時(shí)，各取10 mL菌液記為0 h(作為對(duì)照)，加入IPTG至終濃度為2 mmol/L，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，分別取加入 IPTG后 2、4及 6 h菌液 10 mL，4℃，6000 r/min離心10 min收集菌體，然后加入冰預(yù)冷PBS磷酸緩沖液懸浮菌體后再加入5×SDS，100℃水浴5 min，涼至室溫后12000 r/min離心5 min，吸取上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳(5%濃縮膠，12%分離膠)，凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色。

1.2.6 H2O2組織化學(xué)分析

用打空器鉆取約30個(gè)葉圓片，放入小燒杯中，加入適量1 mg/mL的DAB溶液，真空滲入10 min左右，黑暗條件放置8 h以上，期間要經(jīng)常振蕩，葉圓片要分散開。拿出培養(yǎng)皿光照約1h，至紅棕色斑點(diǎn)出現(xiàn)(自然光即可)，用蒸餾水沖洗葉圓片。加入適量脫色液（75%乙醇+5%甘油），在80℃水浴中進(jìn)行脫色，至葉片不含葉綠素后進(jìn)行觀察或保存。

1.2.7 H2O2定量測(cè)定

H2O2含量測(cè)定參考Bellincampi等[11]的方法。1 mL細(xì)胞培養(yǎng)物10000 g離心20 s，收集上清液測(cè)定H2O2的含量。上清液中加入反應(yīng)試劑至總體積500 μL（反應(yīng)試劑包括：500 μmol/L硫酸亞鐵銨、50 mmol/L H2SO4、200 μmol/L的二甲酚橙和200 mmol/L山梨醇），H2O2介導(dǎo)的氧化反應(yīng)將Fe2+氧化成Fe3+，溫育45 min后在560 nm處測(cè)定的Fe3+-二甲酚橙復(fù)合物吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉花GhCYP714基因克隆

采用改良的CTAB法提取棉花纖維組織的總量RNA(圖1A)并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以反轉(zhuǎn)錄獲得的棉花纖維cDNA作為模板，經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到特異性條帶(圖1B)，經(jīng)測(cè)序正確后獲得GhCYP714A1基因的全長(zhǎng)cDNA，包含1563個(gè)堿基對(duì)的核苷酸，編碼含有521個(gè)氨基酸殘基的多肽。

圖1 GhCYP714A1基因的克隆Fig.1 Cloning of GhCYP714A1 cDNA

2.2 序列比對(duì)與進(jìn)化樹構(gòu)建

將GhCYP714A1基因的cDNA序列翻譯為氨基酸序列，將該序列與擬南芥和可可樹CYP714基因的氨基酸序列進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果（圖2）顯示：植物中GhCYP714蛋白質(zhì)在序列相似性較高。GhCYP714A1蛋白是1個(gè)疏水性蛋白，定位于核外，具有跨膜結(jié)構(gòu)域（圖2A,線框表示）、β-折疊結(jié)構(gòu)（圖2A,虛線表示）、VHP、WSC結(jié)構(gòu)域（圖2A,實(shí)線表示）。進(jìn)化樹分析的結(jié)果表明：棉花GhCYP714A1與可可樹TcCYP714A1在進(jìn)化上親緣關(guān)系較近(圖2B)。

圖2 GhCYP714A1的氨基酸序列比對(duì)與進(jìn)化樹分析Fig.2 Amino acid sequence alignment and phylogenetic tree construction of GhCYP714A1 genes

2.3 重組GhCYP714A1蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將構(gòu)建的pET28a-GhCYP714A1重組子轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株BL21(DE3)中，經(jīng)PCR篩選鑒定后，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)后提取蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，獲得了大小約為57.13 kDa的重組GhCYP714A1蛋白(圖3，箭頭所示)。

圖3 GhCYP714A1重組蛋白的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of GhCYP714A1 recombinant protein

2.4 GhCYP714A1基因參與纖維發(fā)育的表達(dá)分析

以棉花的Ubiquitin7（UBQ7）為內(nèi)參，通過半定量RT-PCR分析GhCYP714A1基因在棉花開花前-3、0 d和開花后3、5、10 d胚珠和纖維組織中的表達(dá)特征。由圖4可見，GhCYP714A1基因在野生型棉花-3、0、3 dpa的胚珠和纖維組織中的表達(dá)較高，在相應(yīng)時(shí)期的突變體組織中表達(dá)量較低，表明GhCYP714A1基因的表達(dá)可能與棉花纖維起始發(fā)育相關(guān)。

圖4 GhCYP714A1參與纖維發(fā)育的表達(dá)分析Fig.4 Expression pattern analysis of GhCYP714A1 during cotton fiber development

2.5 轉(zhuǎn)GhCYP 714A1基因煙草H2O2含量分析

為分析GhCYP714A1基因參與活性氧產(chǎn)生的功能，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法將GhCYP714A1基因轉(zhuǎn)化煙草，定性和定量檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草葉片中的H2O2含量。由圖5可見，與野生型相比，轉(zhuǎn)GhCYP714A1基因煙草葉片細(xì)胞具有較高的H2O2積累。

圖5 轉(zhuǎn)GhCYP714A1基因煙草葉片中H2O2測(cè)定Fig.5 Detection of H2O2in GhCYP714A1 tobacco transgenic leaves and wild type

3 討論

GA調(diào)控的ROS產(chǎn)生對(duì)于在植物的生長(zhǎng)發(fā)育如根的伸長(zhǎng)、葉的延伸等過程發(fā)揮重要作用[8-12]。水稻和擬南芥中細(xì)胞色素P450可以介導(dǎo)GA信號(hào)參與植物發(fā)育[9]。本研究從棉花纖維材料中克隆得到棉花GhCYP714A1基因，為首次在棉花中的報(bào)道。GhCYP714A1蛋白屬于細(xì)胞色素單加氧酶家族，是1個(gè)疏水性蛋白，定位于核外，具跨膜結(jié)構(gòu)域和蛋白結(jié)合位點(diǎn)，暗示了GhCYP714A1可能在細(xì)胞信息傳遞過程發(fā)揮功能。本研究獲得了重組GhCYP714A1蛋白，為進(jìn)一步驗(yàn)證其功能奠定基礎(chǔ)。

ROS在棉花纖維發(fā)育的整個(gè)過程中的作用十分重要。在纖維發(fā)育起始期ROS含量急劇升高并在整個(gè)發(fā)育過程中一直維持在較高水平，抑制ROS的產(chǎn)生對(duì)纖維伸長(zhǎng)具有顯著的阻遏作用。本研究發(fā)現(xiàn)GhCYP714A1基因在野生型棉花開花前-3 d至開花后3 d的胚珠和纖維組織中表達(dá)量較高，這一段時(shí)期是棉纖維的發(fā)育起始時(shí)期，暗示GhCYP714A1基因可能與纖維的起始發(fā)育有關(guān)。ROS與細(xì)胞伸長(zhǎng)發(fā)育緊密相關(guān)，可以通過誘導(dǎo)expansin基因的表達(dá)以及對(duì)細(xì)胞壁多糖的切割使細(xì)胞壁膨脹疏松，還參與許多的信號(hào)通路如：MAPK、Ca2+及乙烯等激素信號(hào)調(diào)控細(xì)胞的伸長(zhǎng)發(fā)育[13-15]。本研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)GhCYP 714A1基因煙草葉片中具有較高的H2O2累積，暗示GhCYP714A1可能通過誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生進(jìn)一步參與細(xì)胞發(fā)育調(diào)控。

4 結(jié)論

本研究從棉花纖維組織中克隆得到GhCYP714A1基因，構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET28a-GhCYP714A1，體外誘導(dǎo)表達(dá)獲得了大小約為57.31 kDa的GhCYP714A1重組蛋白。GhCYP714A1基因在野生型棉花開花前3 d至后3 d的胚珠和纖維組織中表達(dá)量較高。轉(zhuǎn)GhCYP714A1基因煙草葉片中活性氧的含量顯著增加。這些結(jié)果表明GhCYP714A1基因可能通過促進(jìn)活性氧的累積進(jìn)一步參與棉花纖維起始發(fā)育。

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Overexpression of a GhCYP714A1 gene encoding cytochrome P450 gene promotes the H2O2accumulation in transgenic tobacco plant

Xin Shan1,Xin Quanliang1,Li Rong1,Kou Wei1,Li Hongbin1,2*
(1 College of life sciences of Shihezi Universtiy,Shihezi,Xinjiang 832003,China; 2 Key laboratory of Agrobiotechnology of Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832003,China)

The full-length cDNA of a cytochrome P450 gene(Cytochrome P450 714A1,GhCYP714A1)was cloned from Upland cotton fiber tissues through RT-PCR method.Sequence analysis showed that the GhCYP714A1 cDNA contains a 1563 bp open reading frame (ORF),which coding a putative protein with theoretical molecular weight of 57.31 kDa and 521 amino acid residues.Bioinformatics analys is demonstrated that GhCYP714A1 protein contains seve ralprotein binding sites and a transmembrane functional domain.Phylogenetic tree analysis showed that GhCYP714A1 has close relationship with SiCYP714B1 protein.Tissue-specific expression patterns assay by semi-quantitative RT-PCR showed that GhCYP714A1 was expressed during the initiation and elongation stages of fiber development. The prokaryotic expression vector pET28a-GhCYP714A1 was constructed and transformed intoE.colito induce expression.As a result,a 57.31 kDa recombinant protein was obtained. GhCYP714A1 gene was transformed into tobacco to explore its function in ROS generation.Compared with wild-type tobacco, the transgenic tobacco plants displayed a higher H2O2accumulation in leaves.These results suggested that GhCYP714A1 may be involved in fiber development by promoting the production of ROS.

cotton fiber development;cytochrome P450 gene;cell elongation;ROS

S562

A

10.13880/j.cnki.65-1174/n.2017.01.011

1007-7383(2017)01-0065-05

2016-05-30

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31260339)，新疆兵團(tuán)杰青項(xiàng)目（2014CD003），新疆兵團(tuán)種質(zhì)資源創(chuàng)新專項(xiàng)（2012BB050），新疆研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目

辛珊(1991-),女,碩士研究生,專業(yè)方向?yàn)橹参锓肿由飳W(xué)，e-mail:cynthiaxs@hotmail.com。

*通信作者：李鴻彬(1980-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，從事植物分子生物學(xué)與基因工程研究，e-mail:lihb@shzu.edu.cn。