茅國峰，駱振剛

·論著·

·臨床用藥分析·

社區(qū)獲得性尿道致病性大腸埃希菌毒力基因檢測(cè)及其與預(yù)后的相關(guān)性研究

茅國峰1*，駱振剛2

目的 了解社區(qū)獲得性尿道致病性大腸埃希菌(UPEC)的毒力基因及耐藥性，探討毒力基因與疾病預(yù)后的相關(guān)性。方法 收集2013—2014年于紹興市人民醫(yī)院治療的尿路感染(UTI)患者56株社區(qū)獲得性UPEC，采用紙片擴(kuò)散法(K-B法)和微量稀釋法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，按照美國臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)制定的藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)(2014年版)判讀藥敏試驗(yàn)結(jié)果。PCR法檢測(cè)P菌毛亞單位A(papA)、細(xì)胞毒素壞死因子1(cnf1)、細(xì)胞毒素壞死因子2(cnf2)、定植因子抗原B(cfaB)、侵襲質(zhì)粒抗原B(ipaB)、hofQ、ompT毒力基因，并結(jié)合臨床資料分析患者的疾病進(jìn)展和轉(zhuǎn)歸情況。結(jié)果 56株社區(qū)獲得性UPEC共檢測(cè)到ompT毒力基因陽性菌株20株(35.7%)，papA毒力基因陽性菌株4株(7.1%)，未檢測(cè)到其他毒力基因。ompT毒力基因陽性和陰性菌株均未發(fā)現(xiàn)對(duì)哌拉西林/他唑巴坦、美洛培南、丁胺卡那霉素、厄他培南、亞胺培南和替加環(huán)素存在耐藥性。ompT毒力基因陽性菌株對(duì)頭孢他啶的耐藥率高于陰性菌株，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。藥物治療后1周，20例ompT毒力基因陽性患者未治愈15例(75.0%)，出現(xiàn)復(fù)發(fā)癥狀者11例(55.0%)；36例ompT毒力基因陰性患者未治愈10例(27.8%)，出現(xiàn)復(fù)發(fā)癥狀者6例(16.7%)。ompT毒力基因陽性與陰性患者未治愈及復(fù)發(fā)患者比例比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.601、8.936，P<0.05)。結(jié)論 社區(qū)獲得性攜帶ompT毒力基因的UPEC可能與其對(duì)頭孢他啶的耐藥性有關(guān)，菌株毒力強(qiáng)，易反復(fù)感染。

尿路致病性大腸埃希菌；社區(qū)獲得性感染；毒力；耐藥性

茅國峰，駱振剛.社區(qū)獲得性尿道致病性大腸埃希菌毒力基因檢測(cè)及其與預(yù)后的相關(guān)性研究[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2017，20(8)：984-987.[www.chinagp.net]

MAO G F，LUO Z G.Virulence genes in community-acquired uropathogenic escherichia coli and its correlation with the prognosis of the disease[J].Chinese General Practice，2017，20(8)：984-987.

臨床90%以上無并發(fā)癥的尿路感染(UTI)患者由尿道致病性大腸埃希菌(UPEC)引起[1]，而毒力基因可加強(qiáng)UPEC的致病力和侵襲力。為了解本地區(qū)社區(qū)獲得性女性急性膀胱炎患者UPEC毒力基因的存在情況及其與疾病預(yù)后的相關(guān)性，本研究檢測(cè)收集到的56株UPEC P菌毛亞單位A(papA)、細(xì)胞毒素壞死因子1(cnf1)、細(xì)胞毒素壞死因子2( cnf2)、定植因子抗原B(cfaB)、侵襲質(zhì)?？乖瑽(ipaB)、hofQ、ompT毒力基因，并比較毒力基因陽性菌株與陰性菌株感染患者治療效果和復(fù)發(fā)情況，探討其相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集2013—2014年于紹興市人民醫(yī)院治療的UTI患者56株社區(qū)獲得性UPEC，患者均為女性急性膀胱炎患者，入院48 h內(nèi)分離出UPEC，且患者1年內(nèi)無住院史，無長(zhǎng)期留置導(dǎo)尿管或侵入性器械操作史。

1.2 方法

1.2.1 菌株鑒定及藥敏試驗(yàn) 菌株鑒定采用法國生物梅里埃公司生產(chǎn)的Vitek-2細(xì)菌鑒定儀鑒定，藥敏紙片為英國OXOID公司產(chǎn)品，M-H培養(yǎng)基采用法國生物梅里埃公司產(chǎn)品。藥敏試驗(yàn)采用紙片擴(kuò)散法(K-B法)和微量稀釋法，質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC70060，均購自原衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心，按照美國臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)制定的藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)(2014年版)[2]判讀藥敏試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.2 PCR法檢測(cè)毒力基因 PCR法檢測(cè)papA、cnf1、cnf2、cfaB、ipaB、hofQ、ompT毒力基因。煮沸法提取DNA模板，擴(kuò)增引物序列參考文獻(xiàn)[3]，PCR反應(yīng)體系25 μl，其中10×Buffer 2 μl，dNTP 2 μl，引物各1 μl，DNA聚合酶0.25 μl，DNA模板2 μl，剩余體積用無菌雙蒸餾水補(bǔ)足。PCR反應(yīng)條件：93 ℃預(yù)變性2 min；93 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸1 min。PCR產(chǎn)物置于2%瓊脂糖凝膠中(含0.5 μg/ml溴化乙啶)，電壓120 V，電泳40 min，采用凝膠成像儀觀察結(jié)果，出現(xiàn)與陽性對(duì)照分子相當(dāng)?shù)哪康臈l帶為陽性。

1.2.3 治愈和復(fù)發(fā)的判定標(biāo)準(zhǔn) 急性膀胱炎癥狀為尿頻、尿急和排尿不適。采用三日療法治療，3 d后追蹤1周，若癥狀消失則為治愈。在治愈后的6周內(nèi)再次出現(xiàn)同一細(xì)菌的感染則為復(fù)發(fā)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料的分析進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 毒力基因檢測(cè) 56株社區(qū)獲得性UPEC共檢測(cè)到ompT毒力基因陽性菌株20株(35.7%)，目標(biāo)產(chǎn)物長(zhǎng)度為373 bp； papA毒力基因陽性菌株4株(7.1%)，目標(biāo)產(chǎn)物長(zhǎng)度為430 bp，未檢測(cè)到其他毒力基因，電泳結(jié)果見圖1、2。

注：M為DNA標(biāo)準(zhǔn)帶，P為陽性對(duì)照，S1、S2為陽性標(biāo)本，N為陰性對(duì)照

注：M為DNA標(biāo)準(zhǔn)帶，P為陽性對(duì)照，S1、S2為陽性標(biāo)本，N為陰性對(duì)照

2.2 藥敏試驗(yàn) ompT毒力基因陽性和陰性菌株均未發(fā)現(xiàn)對(duì)哌拉西林/他唑巴坦、美洛培南、丁胺卡那霉素、厄他培南、亞胺培南和替加環(huán)素存在耐藥性。ompT毒力基因陽性菌株對(duì)頭孢他啶的耐藥率高于陰性菌株，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。ompT毒力基因陽性和陰性菌株對(duì)余抗菌藥物的耐藥率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表1)。

2.3 毒力基因與疾病預(yù)后的關(guān)系 藥物治療后1周，20例ompT毒力基因陽性患者未治愈15例(75.0%)，出現(xiàn)復(fù)發(fā)癥狀者11例(55.0%)；36例ompT毒力基因陰性患者未治愈10例(27.8%)，出現(xiàn)復(fù)發(fā)癥狀者6例(16.7%)。ompT毒力基因陽性與陰性患者未治愈及復(fù)發(fā)患者比例比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.601、8.936，P<0.05)。4例papA毒力基因陽性患者均未治愈。

3 討論

病原性細(xì)菌致病能力的強(qiáng)弱程度稱為毒力，侵襲力和毒素構(gòu)成細(xì)菌毒力，其物質(zhì)基礎(chǔ)是細(xì)菌的菌體結(jié)構(gòu)和代謝產(chǎn)物。菌體結(jié)構(gòu)包括菌體表面的黏附結(jié)構(gòu)，如纖毛、外膜、水解酶等；毒性代謝產(chǎn)物包括脂多糖、蛋白等。UPEC具有多種毒力基因，包括papA、cnf1、cnf2、cfaB、ipaB、hofQ、ompT等，由位于染色體上的致病島基因編碼[3]。80%以上的UPEC具有P菌毛，P菌毛可與人泌尿道黏膜上皮細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，促使細(xì)胞黏附定植，是UPEC致病的首要條件。而外膜蛋白o(hù)mpT是革蘭陰性桿菌，尤其是大腸埃希菌的重要防御分子，屬于omptins蛋白家族的原型，位于大腸埃希菌外膜，是一種絲氨酸蛋白酶。有研究表明，ompT在UTI的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了重要作用，包括增加細(xì)菌的黏附和侵襲、促進(jìn)胞內(nèi)菌落的形成和上調(diào)促炎細(xì)胞因子等[4]。另外，cfaB基因?qū)儆陴じ剿?，是主要菌毛亞單位；cnf1是一種皮膚壞死毒素；cnf2是一種導(dǎo)致腹瀉和敗血癥的壞死毒素；ipaB基因?qū)儆谇忠u素，常導(dǎo)致細(xì)菌性痢疾；hofQ基因是一種菌毛轉(zhuǎn)運(yùn)體，屬于外膜蛋白。

本研究顯示，社區(qū)獲得性UPEC papA毒力基因陽性率為7.1%，ompT毒力基因陽性率為35.7%，而汪一萍等[5]對(duì)31株多重耐藥UPEC檢測(cè)ompT毒力基因陽性率為48.4%，結(jié)果差異可能與菌株構(gòu)成不同有關(guān)。同時(shí)本研究還比較了OmpT毒力基因陽性菌株與陰性菌株的耐藥率，兩種菌株對(duì)大部分抗菌藥物均顯示了較低的耐藥率，除2株(10.0%)ompT陽性菌株出現(xiàn)對(duì)呋喃妥因耐藥性外，余未發(fā)現(xiàn)UPEC對(duì)丁胺卡那霉素和呋喃妥因存在耐藥性，是治療UTI有效的抗菌藥物[6]，且未發(fā)現(xiàn)對(duì)碳青霉烯類和替加環(huán)素有耐藥菌株，與國外報(bào)道相似[7]，對(duì)含酶抑制劑的β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的耐藥率低于陳中舉等[8]報(bào)道的結(jié)果，可能與地區(qū)差異有關(guān)。復(fù)方磺胺甲噁唑和喹諾酮類藥物是治療女性急性膀胱炎的經(jīng)驗(yàn)用藥[9]，但本研究顯示，兩種菌株對(duì)上述藥物均有較高的耐藥率，對(duì)環(huán)丙沙星和左氧氟沙星的耐藥率均超過50.0%，說明在本地區(qū)上述藥物并不一定是UTI的首選用藥。除頭孢他啶外，ompT毒力基因陽性菌株和陰性菌株對(duì)抗菌藥物的耐藥率無差異，提示UPEC毒力基因與耐藥率可能無相關(guān)性。

為了解毒力基因與疾病預(yù)后的相關(guān)性，本研究對(duì)分離到菌株的患者治療效果和復(fù)發(fā)情況進(jìn)行了分析。ompT毒力基因陽性菌株的治愈率低于陰性菌株，而復(fù)發(fā)率高于陰性菌株。4例papA毒力基因陽性患者均未治愈。

本研究也存在一定的局限性，性別、年齡、合并其他基礎(chǔ)疾病、預(yù)防性使用抗菌藥物等均是患者UTI治療效果的影響因素，其治療效果也可能是多種因素共同作用的結(jié)果[10-11]。今后將通過多中心、大樣本的單因素和多因素Logistic回歸分析，探究影響UTI預(yù)后的相關(guān)因素。

作者貢獻(xiàn)：茅國峰、駱振剛進(jìn)行課題設(shè)計(jì)與實(shí)施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對(duì)文章負(fù)責(zé)；茅國峰進(jìn)行質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。

表1 ompT毒力基因陽性菌株和陰性菌株對(duì)抗菌藥物的耐藥率比較〔n(%)〕

注：-未進(jìn)行假設(shè)檢驗(yàn)

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(本文編輯：吳立波)

Virulence Genes in Community-acquired Uropathogenic Escherichia coli and Its Correlation with the Prognosis of the Disease

MAOGuo-feng1*，LUOZhen-gang2

1.DepartmentofClinicalLaboratory,ShaoxingPeople′sHospital,Shaoxing312000,China2.DepartmentofUrologySurgery,ShaoxingPeople′sHospital,Shaoxing312000,China

*Correspondingauthor：MAOGuo-feng，Seniortechnologist；E-mail：gfmaomao@126.com

Objective To understand the virulence gene and drug tolerance of community-acquired UPEC and explore the correlation between virulence gene and the prognosis of the disease.Methods We collected 56 strains of community-acquired UPEC from patients with urinary tract infection(UTI) who received treatment in Shaoxing People′s Hospital from 2013 to 2014.We conducted drug sensitive test by K-B method and microdilution method.The results of the drug sensitive test were determined according to CLSI 2014 drug sensitive test standard.Virulence genes were detected by using PCR，including papA，cnf1，cnf2，cfaB，ipaB，hofQ and ompT.Analysis of disease development and relapse was performed based on clinical data.Results Among the 56 strains of UPEC，we found 20(35.7%) ompT-positive strains and 4(7.1%) papA-positive strains;no other virulence genes were found.ompT-positive strains and ompT-negative strains had no drug resistance to piperacillin/tazobactam，meropenem，amikacin，ertapenem，imipenem and tigecycline.ompT-positive strains had higher drug resistance rate to ceftazidime than ompT-negative strains(P<0.05).One-week after medication，15(75.0%) patients did not cure and 11(55.0%) patients had relapse among 20 patients with ompT-positive strains;10(27.8%) patients did not cure and 6(16.7%) patients had relapse among 36 patients with ompT-negative strains.There were significant differences in the rate of not being cured and relapse between patients with ompT-positive strains or papA-negative strains(χ2=11.601，8.936;P<0.05).Conclusion Community-acquired UPEC carrying ompT may be related to its resistance to ceftazidime，and the strains have strong virulence，and usually cause repeated infections.

Uropathogenic escherichia coli；Community-acquired infections；Virulence；Drug resistance

浙江省科技廳公益技術(shù)應(yīng)用研究項(xiàng)目(2014C33255)

R 378.21

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.08.y05

2016-04-11；

2016-12-21)

1.312000浙江省紹興市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科

2.312000浙江省紹興市人民醫(yī)院泌尿外科

*通信作者：茅國峰，主任技師；E-mail：gfmaomao@126.com