白明輝，劉海潮

（鄭州大學(xué)附屬洛陽(yáng)中心醫(yī)院 肝膽?zhàn)尥饪贫^(qū)，河南 洛陽(yáng) 471009）

膽囊癌（gallbladder carcinoma，GBC）是最常見(jiàn)的膽道系統(tǒng)惡性腫瘤，占膽道惡性腫瘤的80%～95%[1-2]，且在我國(guó)有增高的趨勢(shì)[3]。其5年生存率＜5%[4]，平均中位生存期＜6個(gè)月[5]。主要原因是其早期診斷困難，手術(shù)切除率低，因此預(yù)后極差[6-7]。膽囊癌早期缺乏特異的癥狀及體征，而生物標(biāo)志物能夠客觀的測(cè)量和評(píng)價(jià)生物過(guò)程、病理過(guò)程及治療反應(yīng)，因此人們對(duì)于膽囊癌的生物標(biāo)志物進(jìn)行了大量的研究，希望能為膽囊癌的早期診斷及治療提供相應(yīng)的幫助[8]。配對(duì)相關(guān)同源框-1蛋白（paired-related homeobox 1，Prrx-1）已被證實(shí)在多種惡性腫瘤中起著作用[9-10]。但目前鮮見(jiàn)有Prrx-1與膽囊癌關(guān)系的研究。本研究通過(guò)免疫組化的方法測(cè)定Prrx-1在膽囊癌中的表達(dá)，并探討其與膽囊癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。

1　資料與方法

1.1　一般材料

選取鄭州大學(xué)附屬洛陽(yáng)中心醫(yī)院病理科2010年10月—2015年12月存檔的蠟塊，經(jīng)病理證實(shí)膽囊癌組45例，男20例，女25例；年齡32～84歲，平均56.7歲。Nevein分期：I期4例，II期6例，III期12例，IV期15例，V期8例。組織學(xué)類型分類：腺癌38例，鱗癌7例。據(jù)病理分級(jí)：高分化癌8例，中分化癌26例，低分化癌11例。所有入選的膽囊癌患者術(shù)前均未接受放療、化療及生物治療等，均可以找到完整的臨床病例資料。同時(shí)隨機(jī)選取我院同期膽囊良性病變（慢性膽囊炎及膽囊腺瘤樣息肉）35例作為對(duì)照組。兔抗人Prrx-1單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，PBS緩沖液，S-P試劑盒，DAB顯色試劑盒及抗原修復(fù)液均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。其他試劑及設(shè)備由鄭州大學(xué)附屬洛陽(yáng)中心醫(yī)院病理科及中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2　免疫組化SP法及結(jié)果判定

將蠟塊制成4 μm厚度的切片，常規(guī)脫蠟脫水，PBS洗滌5 min；3%H2O2阻斷滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，室溫孵育30 min，PBS溶液洗滌3次；修復(fù)抗原，自然冷卻至室溫，PBS溶液洗滌3次；10%山羊血清封閉抗原，37 ℃孵育90 min；加入適量一抗（濃度1:100），4 ℃過(guò)夜，PBS洗滌洗滌3次；加生物素化二抗，37 ℃反應(yīng)30 min，PBS洗滌3次；加入S-A-HRP工作液置于濕盒，37 ℃反應(yīng)40 min，PBS洗滌3次；DAB顯色，PBS洗滌3次，終止顯色；蘇木素染核1 min，PBS洗滌3次，封片。顯微鏡下閱片。每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞左右，在相同放大倍數(shù)（×400）及相同光強(qiáng)度等條件下由2名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師閱片判定評(píng)分。參照方帆等[11]對(duì)Prrx1陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果進(jìn)行判定。染色強(qiáng)度的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：不著色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，黃褐色3分。顯微鏡下陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)所占百分比的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞0分，≤10%為1分，10%～50%為2分，50%～75%為3分，＞75%為4分。將染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)和陽(yáng)性細(xì)胞百分比的分?jǐn)?shù)相乘的結(jié)果作為最后評(píng)分，其中≤2分為陰性，＞2分為陽(yáng)性。

1.3　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。采用χ2檢驗(yàn)分析計(jì)數(shù)資料，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1　Prrx-1在膽囊癌組織及膽囊良性病變組織中的表達(dá)

Prrx-1陽(yáng)性顆粒為棕褐色，位于細(xì)胞核中（圖1）。Prrx-1在膽囊癌組織中的表達(dá)比在膽囊良性病變中強(qiáng)。Prrx-1在45例膽囊癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率為55.6%（25/45），35例膽囊良性病變組織中Prrx-1的陽(yáng)性率為5.7%（2/35），Prrx-1在膽囊癌組織中的表達(dá)明顯高于膽囊良性病變組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=21.87，P＜0.05）（表1）。

2.2　Prrx-1表達(dá)與膽囊癌臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

膽囊癌Nevein分期I、II期Prrx-1陽(yáng)性表達(dá)率20%（2/10），III、IV、V期Prrx-1陽(yáng)性表達(dá)率65.7%（23/35）；兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.58，P＜0.05）。Prrx-1在中低分化癌中的陽(yáng)性表達(dá)為64.9%（24/37），在高分化腺癌中的陽(yáng)性表達(dá)為12.5%（1/8）；兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.31，P＜0.05）。而在膽囊癌患者的年齡、性別及膽囊癌組織學(xué)類型分組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）（表2）。

圖1　免疫組化檢測(cè)Prrx-1的表達(dá)（×400）　A：Prrx-1在膽囊癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)；B：Prrx-1在膽囊腺瘤樣息肉組織中的陽(yáng)性表達(dá)；C：Prrx-1在慢性膽囊炎組織中的陽(yáng)性表達(dá)Figure 1　Immunohistochemical staining for Prrx-1 expression (×400)　A: Prrx-1 positive expression in gallbladder cancer tissue; B: Prrx-1 positive expression in tissue of gallbladder adenomatous polyps; C: Prrx-1 positive expression in tissue of chronic cholecystitis

表1　Prrx-1在膽囊癌組織及膽囊良性病變組織中的表達(dá)比較[n（%）,n=45]Table 1　Comparison of Prrx-1 expressions between gallbladder cancer tissues and gallbladder tissues with benign diseases [n (%),n=45]

表2　Prrx-1表達(dá)與膽囊癌臨床病理指標(biāo)的關(guān)系[n（%）]Table 2　Relations of Prrx-1 expression with clinicopathologic variables of gallbladder cancer [n (%)]

3　討　論

研究[12]表明，Prrx-1是一種DNA相關(guān)的蛋白，其功能是轉(zhuǎn)錄共激活，通過(guò)增加血清反應(yīng)因子的DNA結(jié)合活性轉(zhuǎn)錄活化Prrx-1通過(guò)調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞分化進(jìn)而參與肌腱蛋白-C表達(dá)與肺血管形成過(guò)程。Prrx-1作為轉(zhuǎn)錄因子可調(diào)控多種基因的表達(dá)[13]，在成人大腦中Prrx-1在成人神經(jīng)干細(xì)胞的自我更新中起著重要的作用[14]。近年來(lái)關(guān)于Prrx-1與腫瘤關(guān)系的研究越來(lái)越被人們重視[15-18]。但Prrx-1與膽囊癌的研究國(guó)內(nèi)外少見(jiàn)有報(bào)道。

本研究結(jié)果顯示，Prrx-1在膽囊癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率為55.6%（25/45），高于在膽囊良性病變組織中的表達(dá)5.7%（2/35），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示Prrx-1在膽囊癌的發(fā)生過(guò)程中起著一定的作用。Prrx-1在不同臨床分期及不同病理分級(jí)中的表達(dá)差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示Prrx-1可能與膽囊癌的惡性生物學(xué)行為有關(guān)，可能促進(jìn)了膽囊癌的侵襲能力。范鈺等[19]研究顯示Prrx-1可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力，其機(jī)制可能與促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）有關(guān)。因此，筆者推測(cè)Prrx-1可能促進(jìn)EMT，進(jìn)而促進(jìn)了膽囊癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，導(dǎo)致了膽囊癌的發(fā)生，發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移等。通過(guò)本研究的觀察，本研究發(fā)現(xiàn)Prrx-1的表達(dá)與膽囊癌的分化程度，臨床分期等有關(guān)，因此其可以作為分析膽囊癌預(yù)后的重要生物學(xué)指標(biāo)。Prrx-1是最近發(fā)現(xiàn)的EMT調(diào)節(jié)劑和誘導(dǎo)劑[20-22]。而研究[20-21,23-24]已經(jīng)表明在人類腫瘤細(xì)胞中，如細(xì)胞發(fā)生EMT可以引起輻射抵抗，因此如果能阻斷Prrx-1在膽囊癌中的表達(dá)就可以增強(qiáng)膽囊癌細(xì)胞對(duì)于放療的敏感性，為膽囊癌的治療提供新的思路。而Prrx-1在膽囊癌組織中的表達(dá)與膽囊癌患者的年齡，性別等無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，Prrx-1與膽囊癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。其具體作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

[1]Hundal R,Shaffer EA.Gallbladder cancer: epidemiology and outcome[J].Clin Epidemiol,2014,6:99–109.doi: 10.2147/CLEP.S37357.

[2]Lazcano-Ponce EC,Miquel JF,Mu?oz N,et al.Epidemiology and molecular pathology of gallbladder cancer[J].CA Cancer J Clin,2001,51(6):349–364.

[3]張明迪,龔偉,鄭瑩,等.上海市膽囊癌流行狀況和趨勢(shì)分析[J].中國(guó)實(shí)用外科雜志,2013,33(8):691–694.Zhang MD,Gong W,Zheng Y,et al.Prevalence and temporal trend of gallbladder cancer in Shanghai[J].Chinese Journal of Practical Surgery,2013,33(8):691–694.

[4]Duffy A,Capanu M,Abou-Alfa GK,et al.Gallbladder cancer(GBC): 10-year experience at Memorial Sloan-Kettering Cancer Centre (MSKCC)[J].J Surg Oncol,2008,98(7):485–489.doi:10.1002/jso.21141.

[5]Lai CH,Lau WY.Gallbladder cancer--a comprehensive review[J].Surgeon,2008,6(2):101–110.

[6]Li M,Zhang Z,Li X,et a1.Whole-exome and targeted gene sequencing of gallbladder carcinoma identifies recurrent mutations in the ErbB pathway[J].Nat Genet,2014,46(8):872–876.doi:10.1038/ng.3030.

[7]Shu YJ,Weng H,Bao RF,et a1.Clinical and prognostic significance of preoperative plasma hyperfibrinogenemia in gallbladder cancer patients following surgical resection: a retrospective and in vitro study [J].BMC Cancer,2014,14:566.doi: 10.1186/1471–2407–14–566.

[8]張華洋,孔棣,馬波.膽囊癌生物學(xué)標(biāo)志物研究進(jìn)展[J].中國(guó)普通外科雜志,2014,23(8):1112–1115.doi: 10.7659/j.issn.1005–6947.2014.08.020.Zhang HY,Kong D,Ma B.Advances in biomarkers of gallbladder carcinoma[J].Chinese Journal of General Surgery,2014,23(8):1112–1115.doi: 10.7659/j.issn.1005–6947.2014.08.020.

[9]Hirata H,Sugimachi K,Takahashi Y,et a1.Downregulation of PRRX1 Confers Cancer Stem Cell-Like Properties and Predicts Poor Prognosis in Hepatocellular Carcinoma[J].Ann Surg Oncol,2015,22(Suppl 3):S1402–1409.doi: 10.1245/s10434–014–4242–0.

[10]Sugiyama M,Hasegawa H,Ito S,et a1.Paired related homeobox1 is associated with the invasive properties of glioblastoma cells[J].Oncol Rep,2015,33(3):1123–1130.doi: 10.3892/or.2014.3681.

[11]方帆,鄧亞平,李晶,等.PRRX1蛋白在乳腺癌中的表達(dá)及其臨床意義[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2015,15(3):467–470.doi:10.13241/j.cnki.pmb.2015.03.016.Fang F,Deng YP,Li J,et al.Expression and Clinicopathological Significance of PRRX1 in the Breast Cancer[J].Progress in Modern Biomedicine,2015,15(3):467–470.doi:10.13241/j.cnki.pmb.2015.03.016.

[12]Takimoto A,Mohri H,Kokubu C,et a1.Pax1 acts as a negative regulator of chondrocyte maturation[J].Exp Cell Res,2013,319(20):3128–3139.doi: 10.1016/j.yexcr.2013.09.015.

[13]Lu X,Beck GR Jr,Gilberl LC,et a1.Identifieation of the homeobox protein Prxl(MHox，Prrx-1) as a regulator of ostedx expression and mediator of tumor necrosis factor αaction in osteoblast ditierentiation[J].J Bone Miner Res,201l,26(1):209–219.doi:10.1002/jbmr.203.

[14]Shimozaki K,Clemenson GD Jr,Gage FH.Paired related homeobox protein l is a regulator of stemness in adult neural stem/progenitor cells[J].J Neumsci,2013,33(9):4066–4075.doi:10.1523/JNEUROSCI.4586–12.2013.

[15]Takahashi Y,Sawada G,Kurashige J,et a1.Paired related homoeobox l,a new EMT inducer,is involved in metastasis and poor prognosis in colorectal cancer[J].Br J Cancer,2013,109(2):307–311.doi: 10.1038/bjc.2013.339.

[16]Regadas I,Matos MR,Monteiro FA,et a1.Several cis-regulatory elements control mRNA stability,translation efficiency,and expression pattern of Prrxl1 (paired related homeobox protein-like 1)[J].J Biol Chem,2013,288(51):36285–36301.doi: 10.1074/jbc.M113.491993.

[17]Zhang Y,Zheng L,Huang J,et a1.MiR-124 Radiosensitizes human colorectal cancer cells by targeting PRRX1[J],PLoS One,2014,9(4):e93917.doi: 10.1371/journal.pone.0093917.

[18]Takano S,Reichert M,Bakir B,et a1.Prrx1 isoform switching regulates pancreatic cancer invasion and metastatic colonization[J].Genes Dev,2016,30(2):233–247.doi: 10.1101/gad.263327.115.

[19]范鈺,蔣孟林,滿昌峰,等.配對(duì)相關(guān)同源框-1基因過(guò)表達(dá)對(duì)人胰腺癌細(xì)胞侵襲及上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2016,33(7):1789–1791.doi:10.3760/cma.j.issn.1001–9030.2016.07.026.Fan Y,Jiang ML,Man CF,et al.Effects of overexpression of pairedrelated homeobox 1 gene on invasion and epithelial mesenchymal transition of human pancreatic cancer cells[J].Chinese Journal of Experimental Surgery 2016,33(7):1789–1791.doi:10.3760/cma.j.issn.1001–9030.2016.07.026.

[20]Ansieau S.EMT in breast cancer stem cell generation[J].Cancer Lett,2013,338(1):63–68.doi: 10.1016/j.canlet.2012.05.014.

[21]Theys J,Jutten B,Habets R,et al.E-Cadherin loss associated with EMT promotes radioresistance in human tumor cells[J].Radiother Oncol,2011,99(3):392–397.doi: 10.1016/j.radonc.2011.05.044.

[22]Mani SA,Guo W,Liao MJ,et al.The epithelial- mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells[J].Cell,2008,133(4):704–715.doi: 10.1016/j.cell.2008.03.027.

[23]Guo J,Wang B,Fu Z,et al.Hypoxic Microenvironment Induces EMT and Upgrades Stem-Like Properties of Gastric Cancer Cells[J].Technol Cancer Res Treat,2016,15(1):60–68.doi:10.1177/1533034614566413.

[24]Marie- Egyptienne DT,Lohse I,Hill RP.Cancer stem cells,the epithelial to mesenchymal transition (EMT) and radioresistance:potential role of hypoxia[J].Cancer Lett,2013,341(1):63–72.doi: 10.1016/j.canlet.2012.11.019.