李志剛，王 昶

（東北師范大學(xué)體育學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130024）

運(yùn)動(dòng)性疲勞是指機(jī)體在生理過程中不斷繼續(xù)在特定水平上進(jìn)行或整個(gè)機(jī)體不能維持預(yù)定的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度[1]。研究表明[2]：長(zhǎng)期的耐力訓(xùn)練能夠誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)性疲勞。關(guān)于運(yùn)動(dòng)性疲勞產(chǎn)生機(jī)制以及如何促進(jìn)運(yùn)動(dòng)性疲勞的恢復(fù)是當(dāng)前體育科學(xué)領(lǐng)域面對(duì)的重大課題。耐力訓(xùn)練導(dǎo)致的運(yùn)動(dòng)性疲勞的生理機(jī)制是一個(gè)極其復(fù)雜的問題，眾多學(xué)者對(duì)運(yùn)動(dòng)性疲勞產(chǎn)生的原因以及其中的相關(guān)機(jī)制的研究存在諸多爭(zhēng)議，形成了較多的假說。其中較為共識(shí)的一種說法是：在進(jìn)行長(zhǎng)期的大強(qiáng)度耐力訓(xùn)練時(shí)，體內(nèi)自由基產(chǎn)生就會(huì)增多，導(dǎo)致體內(nèi)原有的自由基產(chǎn)生與清除之間的平衡被破壞，結(jié)果自由基濃度超過了傷害的“閾值”，進(jìn)而引起了大量的細(xì)胞和組織損傷并導(dǎo)致多種疾病與絮亂[3]。因此，有必要在運(yùn)動(dòng)員耐力訓(xùn)練后，及時(shí)對(duì)機(jī)體自由基進(jìn)行清理，避免耐力訓(xùn)練打破身體氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)之間的平衡?；钚宰杂苫姆e累使機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，攻擊大分子和細(xì)胞器官，給身體造成傷害。關(guān)于對(duì)機(jī)體自由基進(jìn)行清理的研究，有研究者認(rèn)為[4]：肌肉細(xì)胞含有復(fù)雜的內(nèi)源性細(xì)胞防御機(jī)制來清除活性氧（如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和過氧化氫酶（CAT））及抵抗其他運(yùn)動(dòng)性氧化應(yīng)激損傷。而有學(xué)者質(zhì)疑：僅憑肌肉細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)源性細(xì)胞防御機(jī)制來清除自由基并不能起到抗疲勞的效果。但有研究發(fā)現(xiàn)[5]：外源性膳食抗氧化劑還可以減少運(yùn)動(dòng)性氧化應(yīng)激的影響并提高動(dòng)物的生理狀態(tài)。原因可能是外源性抗氧化劑可以與內(nèi)源性抗氧化劑相互作用或促進(jìn)，形成抗氧化細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)。然而，其機(jī)制尚未完全闡明。關(guān)于外源性膳食抗氧化劑的提取，眾多研究者都做了相關(guān)的研究，在一些植物中，諸如：紅曲米、雪蓮組織培養(yǎng)提取物、錫蘭發(fā)柄花中都發(fā)現(xiàn)含有內(nèi)源性抗氧化劑的存在。耿進(jìn)霞等人發(fā)現(xiàn)[6]：雪蓮可能具有增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)耐力、抗疲勞、抗體力性疲勞和消除疲勞的作用，但是雪蓮中的內(nèi)源性抗氧化劑含量極少，只有通過大劑量的雪蓮才能起到抗疲勞的作用。但是這一發(fā)現(xiàn)，促進(jìn)了更多學(xué)者去探索某種飲食對(duì)抗疲勞的作用及效果，以便去提取更多的天然抗氧化成分，既可以減少氧化損傷和對(duì)抗疲勞，又沒有其他抗疲勞藥物產(chǎn)生的副作用。

隨著研究的不斷深入和發(fā)展，眾多研究表明[7]：林蛙油可以有效促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成，抑制氨基酸和蛋白質(zhì)分解，提高運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練大鼠血紅蛋白和糖原的儲(chǔ)備。林蛙油來自于曬干的雌林蛙輸卵管，也稱為蛤蟆油。更早的研究已表明林蛙油主要由蛋白質(zhì)構(gòu)成，占50%或更多，主要分布在中國(guó)東北。作為最有名及價(jià)值極高的東方食品和藥物，中醫(yī)認(rèn)為蛤蟆油能滋陰、潤(rùn)肺和補(bǔ)腎精。林蛙油雖然對(duì)機(jī)體運(yùn)動(dòng)性疲勞具有較好的恢復(fù)效果，但是始終未能清晰林蛙油抗疲勞和抗氧化的生理機(jī)制?；诖耍狙芯吭噲D探討林蛙油水解產(chǎn)物（ORPH）的抗氧化和抗疲勞作用，通過3種蛋白水解酶來制備ORPH，通過觀察ORPH對(duì)機(jī)體生理指標(biāo)的影響及變化，總結(jié)ORPH對(duì)運(yùn)動(dòng)性疲勞恢復(fù)的生理機(jī)制，為藥物臨床研究提供有力支持。

1 材料與方法

1.1 材料 林蛙油來源于中國(guó)棕色成熟期雌蛙（中國(guó)吉林省白頭山中國(guó)林蛙養(yǎng)殖場(chǎng)）。中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶購自上海凱陽生物技術(shù)有限公司。肝糖原（LG）、腓腸肌糖原（MG）、血漿乳酸（BLA）、血尿素氮（BUN）等試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 ORPH提取方法

1.2.1.1 林蛙油預(yù)處理 去除林蛙筋膜，壓碎、40目篩過濾得林蛙油粉。將林蛙油粉倒入石油醚，脫脂3次。室溫蒸發(fā)溶劑，在烘箱中于35℃干燥林蛙油。

1.2.1.2 ORPH的提取 1）分離林蛙油蛋白粉。將林蛙油剪碎，與PBS（0.01mol/L）緩沖液按照1∶10的比例混合，利用超聲波破碎細(xì)胞15min，將破碎的細(xì)胞液置于冰浴下間歇冷卻（30s∶30s），再將破碎的細(xì)胞液置于4℃的氣溫下，按照8000r/min離心20min后，吸取上清液，將固體硫酸銨緩慢加入上清液，至其飽和度達(dá)到95%。再將其置于4℃的氣溫下，按照8000r/min離心20min后，收集沉淀，透析真空，冷凍干燥[8]。2）采用中性蛋白酶、堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶消化林蛙油蛋白。使用攪拌器將林蛙油蛋白粉與水（1∶10m/v）混合。將混合物置于恒溫水浴10h，使用NaOH（0.05mol/L）調(diào)節(jié)pH，接著將混合物加熱到100℃，保持10min，使酶失活。3種混合物冷卻至室溫后，將pH值調(diào)節(jié)為中性。3種混合物按照8000r/min離心20min，收集清澈上清液。然后，根據(jù)自由基清除能力選擇最合適的蛋白酶。

1.2.1.3 ORPH的制備 采用軟件設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，然后根據(jù)對(duì)自由基的清除能力選擇最佳的水解條件。

表1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（L9（34））

1.2.2 ORPH抗氧化性的測(cè)定 由于用于抗氧化能力評(píng)估的自由基系統(tǒng)可能顯著影響結(jié)果，普遍提倡使用不同的自由基系統(tǒng)來評(píng)估這種能力[9]。蛋白水解產(chǎn)物的抗氧化性是通過對(duì)羥基自由基和DPPH自由基的清除能力來確定的。具體做法是通過添加不同劑量的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物（2、4、6、8、10mg/ml）測(cè)定其清除能力，進(jìn)而評(píng)價(jià)蛋白水解產(chǎn)物的抗氧化性。

ORPH屬于蛋白水解產(chǎn)物，對(duì)ORPH抗氧化性的測(cè)定采取不同自由基系統(tǒng)來評(píng)估，為了能最大效度地發(fā)揮ORPH抗氧化性，通過木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶和中性蛋白酶3種蛋白酶制備了3種ORPH，并分別對(duì)3種ORPH進(jìn)行測(cè)定，選擇對(duì)自由基清除能力最強(qiáng)的ORPH水解條件。1.2.2.1 對(duì)羥基自由基清除能力的測(cè)定 測(cè)定羥基自由基清除能力[10]，將2.0ml FeSO4（9.0mmol/L）、2.0ml水楊酸-乙醇溶液（9.0mmol/L）混合物與不同濃度的樣品溶液混合。然后加入2.0mlH2O2（0.01%）混勻。混合物在37℃孵育30min，測(cè)510nm處吸光度（UV754，中國(guó)上海先健科學(xué)儀器有限公司），采用2.0ml蒸餾水作為對(duì)照，重復(fù)3次。

采用如下公式：

羥基自由基清除能力（%）=[（A0-A1）/A0]×100%A0：使用蒸餾水的空白溶液吸光度；A1：樣品吸光度。

1.2.2.2 對(duì)DPPH自由基清除能力的測(cè)定 測(cè)定DPPH自由基清除能力[11]。2.0ml不同濃度的樣品溶液與2.0ml含有0.10mmol/L DPPH-純乙醇的溶液混合。使用攪拌器（QT-1攪拌器，中國(guó)上海天辰科技有限公司）用力振搖混合物，置陰暗處30min。測(cè)定最終溶液在517nm處的吸光度。采用2.0ml蒸餾水作為對(duì)照，重復(fù)3次。

采用如下公式計(jì)算清除能力：

對(duì)DPPH自由基的清除能力（%）＝[（A2－A1）/A0]×100%

A0：混合有蒸餾水DPPH吸光度；A1：混合有純乙醇樣品溶液吸光度；A2：混合有DPPH-純乙醇樣品溶液吸光度。

1.2.2.3 對(duì)超氧陰離子清除能力的測(cè)定 測(cè)定超氧陰離子清除能力[12]。4.0mlTris-HCl（pH8.2，50.0mM）與2.0ml不同濃度的樣品溶液混合物與1.0ml焦棓酚（25.0mM）混合，25℃培養(yǎng)20min。加50μl濃煙酸（10M）終止反應(yīng)。測(cè)定最終溶液在420nm處的吸光度。采用2.0ml蒸餾水作為對(duì)照。重復(fù)3次。

采用如下公式計(jì)算清除能力：超氧陰離子清除能力（%）=[1-（A2-A1）/A0]×100 %A0：無樣品的焦酚吸光度.A1：無焦酚的樣品吸光度A2：有樣品的焦酚吸光度。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.3.1 動(dòng)物和飲食 5周大雄性昆明小鼠購自中國(guó)吉林大學(xué)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)中心。小鼠按下列條件飼養(yǎng)：環(huán)境溫度23±1℃、相對(duì)濕度55±10%、換氣速率每小時(shí)10次、12：12h明暗周期。動(dòng)物任意攝取市售標(biāo)準(zhǔn)小鼠飲食和水。所有實(shí)驗(yàn)均獲得批準(zhǔn)，并按照《動(dòng)物護(hù)理和使用指南》（中國(guó)動(dòng)物倫理委員會(huì)，根據(jù)美國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)AIN-93）實(shí)施，食物和水任意供給。1周適應(yīng)期后，40只體重為20±2g的小鼠隨機(jī)分為5個(gè)實(shí)驗(yàn)組：對(duì)照組和ORPH 50、100、500、1000mg/kg劑量組，每天游泳訓(xùn)練前下午3：00灌胃給藥，持續(xù)4周。

1.2.3.2 訓(xùn)練計(jì)劃 采用專門游泳訓(xùn)練模型。小鼠置于游泳水槽（50cm×40cm×40cm），水深30cm，灌胃給予ORPH后，在25±1℃水溫下進(jìn)行游泳訓(xùn)練，訓(xùn)練持續(xù)4周。在第1周，小鼠每天游泳10min。從第2至第4周，小鼠分別游泳15、20、25min。

1.2.3.3 力竭游泳測(cè)試 本研究采用力竭游泳測(cè)試（力竭時(shí)間定義為小鼠7s后不能浮出水面呼吸的時(shí)間[13]）評(píng)估ORPH抗疲勞作用。4周后，每組取8只小鼠進(jìn)行測(cè)試。簡(jiǎn)單來說，最后一次使用ORPH或蒸餾水治療后，小鼠分開放置于游泳水槽（50cm×40cm×40cm），注水至水深30cm，水溫控制在25±1℃。每只小鼠尾根部系上鉛錘（體重的10%）。力竭定義為小鼠在10s內(nèi)不能浮出水面。立即記錄游泳時(shí)間。將小鼠從泳池取出，用紙巾擦干，放回原來的籠子。每個(gè)環(huán)節(jié)完畢后更換池水。

1.2.3.4 測(cè)量疲勞相關(guān)的生化指標(biāo) 游泳能力測(cè)試結(jié)束后，力竭動(dòng)物用10%水合氯醛（3.5ml/kg體重，腹腔注射）立即麻醉。采用肝素化管從腹主動(dòng)脈收集血液樣品。于4℃200×g分離血清10min，保存在-80℃深凍冰箱待分析?？焖偾虚_肝和腓腸肌肌肉，用冰冷的鹽溶液清洗。然后將樣品冷凍在-80℃的液氮中，直到分析糖原含量。使用購買的試劑盒，用比色法測(cè)定生化指標(biāo)，包括肝糖原（LG）、腓腸肌肌糖原（MG）、血漿乳酸（BLA）。使用蒽酮試劑在620nm處測(cè)定LG和MG含量。采用氯化硝基四氮唑藍(lán)試劑在530nm處測(cè)定BLA。采用谷氨酸脫氫酶耦合酶方法通過尿素酶評(píng)估BUN。

1.2.3.5 脂質(zhì)過氧化測(cè)定 通過硫代巴比妥酸反應(yīng)產(chǎn)物（TBARS）水平測(cè)定脂質(zhì)過氧化[14]。采用分光光度法，通過TBARS濃度測(cè)定肝臟和腓腸肌丙二醛（MDA）。TBARS結(jié)果表示為nmol/mg蛋白質(zhì)。每組樣品在10mmol/L冰冷磷酸緩沖液中勻漿，然后與8.1%十二烷基硫酸鈉、20%乙酸和0.75%2-硫代巴比妥酸溶液完全混勻?；旌先芤河?5°C烘箱加熱30min。冷卻后，3 500rpm離心15min去除凝絮。采用分光光度計(jì)在532nm處測(cè)定上層吸光度，并與制備好的1，1，3，3-四甲氧基丙烷標(biāo)準(zhǔn)曲線比較。根據(jù)Lowry的方法使用牛血清作為標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定樣品蛋白含量[15]。

1.2.3.6 SOD活性試驗(yàn) 采用SOD活性試劑盒-WST（日本熊本同仁化學(xué)實(shí)驗(yàn)室）測(cè)定總SOD活性。簡(jiǎn)單而言，樣品進(jìn)行勻漿，使用Bradford方法[16]分析上清液的蛋白濃度。上清液采用黃嘌呤、黃嘌呤氧化酶和水溶性四唑鹽WST-1的分析試劑培養(yǎng)。在黃嘌呤氧化酶作用下，由黃嘌呤底物生成的超氧化自由基將WST-1還原成WST-1二甲，在450nm處吸光度最大。胚胎中的SOD抑制WST-1還原，因?yàn)樗纱呋趸x子的歧化作用，生成分子氧和過氧化氫。采用分光光度計(jì)在450nm處測(cè)定WST-1的還原。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n=8）表示。使用方差分析與Tukey’s HSD事后檢驗(yàn)測(cè)定平均值差異，用Spss20.0分析。P＜0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ORPH抗氧化能力的測(cè)定結(jié)果

2.1.1 對(duì)羥基自由基清除能力的測(cè)定 如圖1所示，所有蛋白酶均顯示有清除羥基自由基的能力，其中中性蛋白酶水解產(chǎn)物和木瓜蛋白酶水解產(chǎn)物活性最大。水解產(chǎn)物的羥基自由基清除能力范圍為14.82%～39.33%。中性蛋白酶水解產(chǎn)物的羥基自由基清除率比木瓜蛋白酶水解產(chǎn)物稍高。中性蛋白酶水解產(chǎn)物的清除率顯著高于與堿性蛋白酶水解產(chǎn)物。3種蛋白酶水解產(chǎn)物的羥基自由基清除率隨著濃度增加而增加。當(dāng)?shù)鞍姿猱a(chǎn)物濃度為10mg/ml，清除率達(dá)39.33%。考慮到自由基的生物學(xué)影響，這些結(jié)果具有生理學(xué)意義。

圖1 羥基自由基清除能力

2.1.2 對(duì)DPPH自由基清除能力的測(cè)定 如圖2所示，所有水解產(chǎn)物均能清除DPPH自由基。水解產(chǎn)物清除DPPH自由基的能力范圍為23.86%～47.00%。3種酶中，中性蛋白酶作用的水解產(chǎn)物清除DPPH自由基的能力最高，清除率可達(dá)到47%。堿性蛋白酶作用下的蛋白水解產(chǎn)物隨著濃度增加，清除自由基的能力稍微增加，該變化太小而難以看出，可能是由于堿性蛋白酶需要的堿性環(huán)境影響或破壞林蛙油的抗氧化劑。

圖2 清除DPPH自由基的能力

2.1.3 對(duì)超氧陰離子清除能力的測(cè)定 如圖3顯示，由3種酶水解的蛋白水解產(chǎn)物中，由中性蛋白酶制備的蛋白水解產(chǎn)物清除超氧化陰離子的能力最強(qiáng)。3種蛋白酶水解產(chǎn)物清除超氧化陰離子的能力隨著濃度增加而增加。當(dāng)?shù)鞍姿猱a(chǎn)物濃度為10mg/ml，清除率可達(dá)到32.61%。

圖3 不同林蛙油蛋白水解產(chǎn)物對(duì)O2的清除能力

采用3種蛋白酶制備蛋白水解產(chǎn)物。根據(jù)這些結(jié)果，由中性蛋白酶制備的蛋白水解產(chǎn)物清除羥基自由基、超氧化陰離子、DPPH自由基的清除率均非常高。因此，后面實(shí)驗(yàn)選擇中性蛋白酶。

2.1.4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 從正交結(jié)果來看，A2B2C2D2是最佳的水解組合。溫度（A）為50℃，pH值（B）為7.5，酶劑量（C）為4%，水解時(shí)間（D）為10h。C的極值R意味著水解酶劑量是影響水解的主要因素。D、B、A依次下降表示水解影響因素的程度大小排列為：C＞D＞B＞A?？紤]到成本，C2是最佳選擇。A2的平均值高于A1和A3，因此A2是最佳水解水平。同樣地，B2和D2是最佳水平。因此A2B2C2D2確定為最佳水解條件。我們另外進(jìn)行實(shí)驗(yàn)證實(shí)正交結(jié)果，水解產(chǎn)物的羥基自由基清除率達(dá)到39.35%，高于最大正交清除測(cè)試組，表明正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果是真實(shí)的。

2.2 ORPH對(duì)小鼠游泳能力的影響 力竭游泳的測(cè)定可直接客觀地反映個(gè)體的抗疲勞能力。表3顯示，與對(duì)照組相比，蛋白水解產(chǎn)物中，高及最高劑量組的小鼠游泳時(shí)間顯著增加。中劑量組和對(duì)照組之間有顯著差異（P＜0.05），高和最高劑量組與對(duì)照組相比均有非常顯著的差異（P＜0.01）。但低劑量組和對(duì)照組之間無顯著差異（P＜0.05）。證實(shí)蛋白水解產(chǎn)物可顯著提高小鼠游泳時(shí)間，結(jié)果提示蛋白水解產(chǎn)物有明顯的抗疲勞作用。

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

表3 林蛙油酶解水解產(chǎn)物對(duì)游泳時(shí)間的影響

2.3 ORPH對(duì)小鼠疲勞相關(guān)生化指標(biāo)的影響

2.3.1 ORPH對(duì)小鼠LG和MG的影響 隨著運(yùn)動(dòng)負(fù)荷量的增加，脂肪酸代謝增大，肝糖原（LG）和肌糖原（MG）比率減少。肝糖原和肌糖原是影響疲勞形成的重要因素。表4（見下頁）顯示，林蛙油蛋白治療組運(yùn)動(dòng)后肝糖原和肌糖原含量比對(duì)照組高。這些數(shù)據(jù)表明林蛙油蛋白治療顯著增加小鼠游泳后肝糖原和肌糖原的水平（P＜0.05）。

2.3.2 ORPH對(duì)小鼠BLA和BUN的影響 血漿乳酸（BLA）和血尿素氮（BUN）是判斷疲勞程度的重要指標(biāo)。表5顯示（見下頁），游泳練習(xí)后，林蛙油蛋白治療組的乳酸和血尿素氮水平低于對(duì)照組。林蛙油蛋白治療組的乳酸水平分別下降8%、20%、39%和42%。此外，林蛙油蛋白治療組的血尿素氮水平分別下降13%、18%、34%和45%。與對(duì)照組相比，林蛙油蛋白治療組顯著減少血漿乳酸和血尿素氮水平，并呈劑量依賴性（P＜0.05）。

表4 林蛙油蛋白對(duì)小鼠LG和MG的影響

表5 林蛙油蛋白對(duì)BLA和BUN的影響

2.4 ORPH對(duì)肝臟MDA含量和SOD活性的影響 丙二醛水平（MDA）是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物。表6顯示，50、100、500、1000mg/kg林蛙油蛋白治療組的MDA濃度與對(duì)照組相比分別下降4%、5%、17%和22%。500、1000mg/kg治療組與對(duì)照組相比肝臟內(nèi)MDA濃度顯著降低（P＜0.05）。

表6 林蛙油蛋白對(duì)肝臟MDA含量和SOD活性的影響

肝蛋白（SOD）屬于生命體的活性物質(zhì)。表6顯示，對(duì)照組SOD活性為9.5±0.59。林蛙油蛋白治療組SOD活性分別為10.1±0.76、10.9±0.64、12.5±0.72和11.6±0.98單位/mg蛋白。林蛙油蛋白治療組肝臟內(nèi)SOD活性與對(duì)照組相比顯著增加（P＜0.05）。此外，50和100mg/kg林蛙油蛋白治療組與對(duì)照組相比無顯著差異。

2.5 ORPH對(duì)腓腸肌內(nèi)MDA含量和SOD活性的影響 表7顯示，50、100、500、1000mg/kg林蛙油蛋白治療組的MDA濃度與對(duì)照組相比分別下降10%、26%、19%和31%。500、1000mg/kg治療組與對(duì)照組相比腓腸肌內(nèi)MDA濃度顯著降低（P＜0.05）。

表7 林蛙油蛋白對(duì)腓腸肌內(nèi)SOD活性和MDA含量的影響

表7顯示，對(duì)照組SOD活性為5.9±0.25。林蛙油蛋白治療組SOD活性分別為6.3±1.25、7.4±0.24、7.9±0.72和9.2±0.98單位/mg蛋白。林蛙油蛋白治療組腓腸肌的SOD活性與對(duì)照組相比顯著增加（P＜0.05）。此外，50和100mg/kg林蛙油蛋白治療組與對(duì)照組相比無顯著差異。

3 討論與分析

運(yùn)動(dòng)性疲勞指高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后機(jī)體運(yùn)動(dòng)能力暫時(shí)性抑制[17]。在充足的休息和調(diào)節(jié)后，身體恢復(fù)作業(yè)能力。如果運(yùn)動(dòng)員在上次疲勞完全恢復(fù)之前誘發(fā)新的疲勞，累積疲勞最終會(huì)導(dǎo)致過度疲勞。過度疲勞會(huì)影響一個(gè)人的整體健康和運(yùn)動(dòng)能力。如果采取干涉措施消除或減少疲勞并促進(jìn)體力全面恢復(fù)，可持續(xù)滿足機(jī)體的能量需求，且可保持甚至增加鍛煉強(qiáng)度，具有明確的運(yùn)動(dòng)益處。在高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)中，能量損耗和肌肉疲勞可能限制運(yùn)動(dòng)能力。通過注射蛋白或氨基酸來補(bǔ)充運(yùn)動(dòng)后的營(yíng)養(yǎng)是加快疲勞恢復(fù)的關(guān)鍵[18]。與蛋白質(zhì)相比，蛋白水解產(chǎn)物可快速輕松地被吸收。通過羥基自由基清除能力測(cè)定、DPPH自由基清除能力測(cè)定以及超氧化陰離子清除能力測(cè)定證明ORPH的抗氧化作用。

本研究證實(shí)蛋白水解產(chǎn)物可顯著增加小鼠游泳時(shí)間，結(jié)果說明蛋白水解產(chǎn)物具有明顯的抗疲勞作用。本文探討了從林蛙油提取的蛋白水解產(chǎn)物是否能改善運(yùn)動(dòng)性疲勞。為評(píng)估林蛙油蛋白水解產(chǎn)物可能的作用機(jī)制，通過分析及測(cè)定小鼠的肝臟和血尿素氮（BUN）及乳酸水平，評(píng)估疲勞小鼠的肝臟和肌糖原。結(jié)果顯示由中性蛋白酶消化制備的蛋白水解產(chǎn)物不僅在體外有抗氧化作用，而且在小鼠體內(nèi)有抗氧化作用。本研究結(jié)果顯示，大量運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，但林蛙油蛋白水解產(chǎn)物可通過抗氧化作用緩解疲勞。目前正在進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)可更深入地了解保健產(chǎn)品對(duì)預(yù)防小鼠因大量運(yùn)動(dòng)引起的氧化應(yīng)激損傷的有用性、安全性及有效性，但未來仍需進(jìn)行更多的研究。

4 結(jié) 論

中性蛋白酶制備ORPH最佳水解條件為:溫度為50℃，pH值為7.5，酶劑量為4%，水解時(shí)間為10h。ORPH對(duì)游泳耐力訓(xùn)練大鼠運(yùn)動(dòng)性疲勞的恢復(fù)具有良好的作用，ORPH通過增加SOD活性改善酶抗氧化系統(tǒng)，從而達(dá)到抗疲勞、延長(zhǎng)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練時(shí)間的作用，其生理機(jī)制可能是通過補(bǔ)充肝糖原和肌糖原，消除血乳酸、血尿素氮和肝臟、腓腸肌丙二醛，以及增強(qiáng)抗氧化酶的活性來實(shí)現(xiàn)的。

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