龔倩, 郗存顯, 聶福平, 曹淑瑞, 王國民, 陳冬東, 母昭德*

1(重慶醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，重慶，400016)2(重慶出入境檢驗(yàn)檢疫局 重慶市進(jìn)出口食品安全工程技術(shù)研究中心，重慶，400020)3(重慶市生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶，400016)4(中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京，100123)

水產(chǎn)品中孔雀石綠AlphaLISA檢測方法的建立

龔倩1,3, 郗存顯2, 聶福平2, 曹淑瑞2, 王國民2, 陳冬東4, 母昭德1,3*

1(重慶醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，重慶，400016)2(重慶出入境檢驗(yàn)檢疫局 重慶市進(jìn)出口食品安全工程技術(shù)研究中心，重慶，400020)3(重慶市生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶，400016)4(中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京，100123)

建立孔雀石綠(malachite green，MG)的光激化學(xué)發(fā)光納米均相時(shí)間分辨熒光免疫法(AlphaLISA)分析方法。 將待測物，生物素化-MG-BSA，抗體加入到孔板中，再加入供體微珠和受體微珠。生物素化-MG-BSA和游離的待測物對抗體的競爭使得信號值減小，從而優(yōu)化檢測條件并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。結(jié)果表明：該方法特異性良好，與無色孔雀石綠，無色結(jié)晶紫無交叉反應(yīng)，靈敏度為0.42 ng/mL，MG在2種魚樣品中的回收率在81.0%～105.0%和84.0%～90.8%之間，批內(nèi)精密度RSD<9.5%，批間精密度 RSD<16.0%。MG-AlphaLISA方法可以簡單、快速的對魚類進(jìn)行MG測定，具有特異性強(qiáng)、靈敏性高、穩(wěn)定等特點(diǎn)。

AlphaLISA；孔雀石綠；水產(chǎn)品；檢測方法

孔雀石綠(malachite green，MG)是人工合成的有毒的三苯甲烷類化學(xué)物，分子式為C23H25ClN2。因其價(jià)格低廉，常用作水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的殺蟲劑和殺菌劑和紡織工業(yè)中的絲綢、羊毛、皮革和紙張的染色劑[1]，但很多研究表明MG特別是其代謝產(chǎn)物在水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)有明顯的高殘留及高毒性，可產(chǎn)生致畸、致癌、致突變等副作用[2-4]。鑒于MG及其代謝產(chǎn)物的嚴(yán)重危害性，美國、日本和中國等國家都將MG列為水產(chǎn)品中不得檢出藥物。

目前，MG 的檢測方法主要有固相萃取-高效液相色譜-熒光檢測法[5]、高效液相色譜[6]、高效液相色譜法-質(zhì)譜聯(lián)用法[7]、分子印跡固相萃取-高效液相色譜法[8]、酶聯(lián)免疫法[9-10]等。色譜法具有靈敏度高，測定精密、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，但其設(shè)備過于昂貴，操作步驟較為繁瑣，操作人員需要專業(yè)培訓(xùn)，給使用帶來一定困難。酶聯(lián)免疫法方便快捷，靈敏度高，操作較為簡單，卻又存在假陽性問題。而AlphaLISA法在食品安全領(lǐng)域的應(yīng)用較為少見。AlphaLISA法具有快速、 穩(wěn)定、 高靈敏、免洗、無放射污染以及操作簡單等特點(diǎn)，技術(shù)核心是當(dāng)生物反應(yīng)使供體微珠和受體微珠相互接近時(shí)，在680 nm激光照射下，供體微珠上的光敏劑將周圍環(huán)境中的氧氣轉(zhuǎn)化為更為活躍的單體氧。單體氧擴(kuò)散至受體微珠，發(fā)射波長為615 nm的光，即供體微珠和受體微珠的相互作用[11-13]。本研究建立的AlphaLISA法分析魚肉中 MG 的測定方法，該方法操作簡便、通用性強(qiáng)、免洗、檢測時(shí)間短，方法的準(zhǔn)確性和靈敏度均能滿足分析測試的需要。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

孔雀石綠(MG)、無色孔雀石綠(leucomalachite green，LMG)、結(jié)晶紫(crystal violet ，CV)、無色結(jié)晶紫(leucomalachite crystal violet ，LCV),均來自德國Dr. Ehre-nstorfer GmbH公司。MG-BSA抗原、MG單克隆抗體，購自北京中檢維康生物技術(shù)有限公司。生物素，購于Solulink公司。鏈霉素供體微珠、受體微珠、緩沖液Buffer、384孔板，購于美國PerkinElmer公司。乙腈(色譜純)，購于Tedia公司。其他的試劑(分析純)購買于Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

多標(biāo)記微孔板檢測儀( AlphaLISA儀，EnSpire 2300)，美國PerkinElmer公司；氮吹儀(N-EVAP 116)，Organomation公司；振蕩器(SR-2DS)，日本TAITEC公司；離心機(jī)(3-30K)，Sigma公司；烘箱，美墨爾特公司；分析天平(BS224S)，Satorius公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品的配制

準(zhǔn)確稱取MG 10 mg，溶解在10 mL的乙腈溶液中，配制成濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品母液，置于-20 ℃冰箱中儲存。取母液用乙腈配置為濃度1 μg/mL溶液10 mL，保存在4 ℃冰箱中，作為日常使用。用Buffer緩沖液將MG母液倍比稀釋，制成 0.5、1、2、5、10 μg/L MG 標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2 受體微珠和供體微珠的配制

將10×Buffer按照說明書的方法配制成1×Buffer，用1×Buffer將受體微珠和供體微珠稀釋為0.1 mg /mL溶液。

1.3.3 生物素-MG-BSA的制備

生物素-MG-BSA通過生物素化方法得到[14]。取MG-BSA抗原20 μL置于200 μL EP管中，再加入2 μL生物素，震蕩混勻，室溫放置90 min，放在4 ℃冰箱中備用。

1.3.4 樣品預(yù)處理

準(zhǔn)確稱取樣品5.0 g(精確到 0.01 g)于50 mL離心管中，加入11 mL乙腈，振蕩20 min，7 000 r/min離心3 min，上清液轉(zhuǎn)移至25 mL比色管中，重復(fù)提取一次后將上清液合并，并用乙腈定容至25 mL。將中性氧化鋁小柱固定，用5 mL乙腈活化萃取小柱，取5 mL樣品溶液加到已活化的中性氧化鋁小柱中過柱，待樣液全部流出后，再加入4 mL乙腈洗滌中性氧化鋁柱。收集全部洗脫液，40 ℃氮?dú)獯蹈?，殘留液用Buffer定容至1 mL，過0.22 μm濾膜，供檢測用。

1.3.5 檢測

在384孔板中加入5 μL生物素化抗原(2 mg/mL)，5 μL的抗體(7.8 mg/mL)和5 μL待測樣品或者標(biāo)準(zhǔn)品，振蕩離心后，25 ℃避光孵育60 min。依次加入IgG受體微珠(100 μg/mL)，鏈霉素供體微珠(100 μg/mL)，振蕩離心后，25 ℃避光孵育45 min。在AlphaLISA檢測儀上測定待測孔的信號強(qiáng)度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測物中MG濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 生物素化抗原和抗體的濃度優(yōu)化

采用棋盤法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件。用Buffer將生物素化抗原分別稀釋：1∶100、 1∶200、 1∶500、 1∶1 000、 1∶2 000、 1∶5 000、 1∶10 000。 抗體做一系列稀釋：1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶9 600、 1∶12 800、1∶19 200、 1∶25 600。每種濃度加到孔板中，其中最后一個(gè)孔只加Buffer作空白對照。按照 1.3.5 的檢測步驟進(jìn)行檢測，將待測樣品替換成Buffer。各個(gè)濃度的信號強(qiáng)度值如表1所示。從表1中可以看出，生物素化抗原濃度在1∶2 000～1∶5 000倍稀釋，抗體在1∶6 400～1∶12 800倍稀釋時(shí)，信號強(qiáng)度值較高。在此濃度范圍內(nèi)，通過信號強(qiáng)度值和抗原抗體的成本，用量角度考慮，選擇生物素化抗原濃度1∶2 000，抗體濃度1∶6 400作為實(shí)驗(yàn)的最適條件。

表1 生物素化-MG-BSA和MG抗體濃度優(yōu)化

2.2 微珠濃度優(yōu)化

供體微珠和受體微珠用Buffer分別稀釋到：10、30 、50、100、120、200 μg/mL。按照 1.3.5 的檢測步驟進(jìn)行檢測。結(jié)果見表2。由表2中結(jié)果可知，隨著微珠濃度的增大，信號值也不斷增大。當(dāng)微珠濃度在100 μg/mL時(shí)，信號值出現(xiàn)較大增加。因?yàn)榭紤]到供體微珠和受體微珠價(jià)格昂貴，在實(shí)驗(yàn)過程中，不適宜的濃度不僅影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，還會(huì)造成浪費(fèi)，所以一個(gè)合適的實(shí)驗(yàn)濃度就顯得尤為重要，故選擇微珠濃度為100 μg/mL。

表2 供體微珠和受體微珠濃度優(yōu)化

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及靈敏度

在最佳條件下，繪制MG標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為0.5 、1、2 、5 、10 ng/mL。結(jié)果以MG 溶液質(zhì)量濃度對數(shù)值為橫坐標(biāo)(x)、抑制率(B/B0，即樣品熒光值與陰性熒光值之比)為縱坐標(biāo)(y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)曲如圖1所示。 MG-AlphaLISA的靈敏度則是計(jì)算 10 組標(biāo)準(zhǔn)曲線零濃度點(diǎn)的平均值(X)和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，以X的數(shù)值減 2 倍 SD 所得的數(shù)值從標(biāo)準(zhǔn)曲線中找到對應(yīng)濃度即為檢測靈敏度[15]。建立的 AlphaLISA 方法檢測靈敏性為0.42 ng/mL。

圖1 孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of MG

2.4 特異性

將MG與無色孔雀石綠、結(jié)晶紫、無色結(jié)晶紫這3種 MG 的結(jié)構(gòu)類似物分別配制成0.5～10 ng/mL 的待測溶液， 用已建立的MG-AlphaLISA 方法進(jìn)行檢測，測定 IC50值。結(jié)果見表3。由表3中可知，MG與結(jié)晶紫的交叉率>100.00%，與無色孔雀石綠、無色結(jié)晶紫均無交叉反應(yīng)。

2.5 樣品測定

將已知濃度的MG標(biāo)準(zhǔn)品(1 、2 、5 μg/L)分別添加到2種魚樣品中，樣品經(jīng)預(yù)處理后采用已建立的 MG-AlphaLISA 方法進(jìn)行檢測，每個(gè)濃度重復(fù)檢測 3 次。再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各個(gè)濃度添加的回收率。如表4所示。MG在2種魚樣中的回收率分別在81.0%～105.0% 和 84.0%～90.8%之間。方法精密度則是選擇鰱魚樣品，分別添加不同濃度的MG標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)濃度做3個(gè)平行樣品。計(jì)算各濃度的平均測定值(X)、標(biāo)準(zhǔn)差(SD) 以及精密度(RSD)。結(jié)果見表5。該方法批內(nèi)精密度在5.61%～9.22%，批間精密度在9.72% ～15.90%。采用常規(guī)的ELISA方法對2種魚樣進(jìn)行測定，MG在2種魚樣中的回收率在74.6%～112.0%之間，精密度< 19.6%。對所采集的實(shí)際魚樣樣品進(jìn)行測定，結(jié)果表明，在市場購買的草魚中均未檢測出MG，在購買的促銷鰱魚中均檢測出MG殘留。將建立的 MG-AlphaLISA 方法與常規(guī)ELISA方法進(jìn)行比較(表6)，AlphaLISA 方法具有免洗，時(shí)間短，試劑、樣品用量少等優(yōu)點(diǎn)。

表3 孔雀石綠及其類似物交叉率

表4 加標(biāo)回收率測定結(jié)果

表5 精密度測定結(jié)果

表6 MG-AlphaLISA 方法與常規(guī)ELISA方法的比較

3 結(jié)論

隨著人們對動(dòng)物源食品由需求型向質(zhì)量型轉(zhuǎn)變，動(dòng)物源食品安全問題已逐漸成為全世界關(guān)注的一個(gè)焦點(diǎn)。盡管我國在2002年就將MG作為禁用獸藥，但是一直禁而不止，很多養(yǎng)殖戶仍在使用，導(dǎo)致了由MG引起的食品安全問題時(shí)有發(fā)生。在現(xiàn)有的檢測孔雀石綠殘留的方法中，常用的液質(zhì)聯(lián)用法檢測周期長、儀器昂貴。ELISA方法無法滿足越來越高的檢測靈敏度，在實(shí)際應(yīng)用中受到一定限制。

本實(shí)驗(yàn)中采用的AlphaLISA方法于2008年問世。該方法只需要極少量的實(shí)驗(yàn)試劑，與ELISA方法相比，用量大大減少，節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本[16]。又因?yàn)椴恍枰礈爝^程，進(jìn)而得到較好的靈敏度和精密度。本方法批內(nèi)精密度和批間精密度分別 <9.5%和 <16.0%。AlphaLISA檢測的時(shí)間大大縮短，只需要2～3h。由此可見，AlphaLISA方法進(jìn)行快速、高靈敏度的檢測的能力極強(qiáng)，有望成為常規(guī) ELISA 方法的替代方法。

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Quantitative determination of malachite green in aquatic products using amplified luminescent proximity homogeneous assay

GONG Qian1,3, XI Cun-xian2, NIE Fu-ping2, CAO Shu-rui2,WANG Guo-min2, CHEN Dong-dong4, MU Zhao-de1,3*

1(College of Pharmacy, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China)2(Chongqing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Chongqing Engineering TechnologyResearch Center of Import and Export Food Safety, Chongqing 400020, China)3(Chongqing Key Laboratory of Biochemistry and Molecular Pharmacology, Chongqing 400016, China)4(Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100123, China)

A new method was established for analyzing malachite green (MG) by amplified luminescent proximity homogeneous assay (AlphaLISA). Samples, botinylated MG-BSA and MG antibody were added to a 384-well microplate, then donor beads and acceptor beads were added. Antibody competition between Biotinylated -MG-BSA and disassociate sample substances caused signal value decrease, thus optimized the test condition and analytical performance. The cross-reactivity of the MG-AlphaLISA with Leucomalachite green and Leucomalachite crystal violet were 11.74% and 7.24%, respectively; the sensitivity was 0.42 ng/mL; the recoveries of the determination for MG in two kinds of fish samples were 81.0%-105.0% and 84.0%-90.8%, respectively; the RSD of intra-day and inter-assay were <9.5% and <16.0%, respectively; the MG-AlphaLISA method is excellent in specificity, sensitivity, and stability. It can be widely used in rapid and simple screening for MG contamination in fish.

AlphaLISA; malachite green; aquatic product; detection method

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201702035

碩士研究生(母昭德教授為通訊作者,E-mail：mdz2008@tom.com)。

質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項(xiàng)項(xiàng)目(201210086)；國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015IK333)

2016-03-23，改回日期：2016-09-14