謝月英，李成龍,2，韋誠，朱麗娟，周才瓊*

1(西南大學 食品科學學院,重慶,400715) 2(重慶啤酒股份有限公司,重慶,400715)

發(fā)酵酸肉膽酸鹽結(jié)合肽的分離純化及初步鑒定

謝月英1，李成龍1,2，韋誠1，朱麗娟1，周才瓊1*

1(西南大學 食品科學學院,重慶,400715) 2(重慶啤酒股份有限公司,重慶,400715)

以傳統(tǒng)發(fā)酵酸肉為原料，制備膽酸鹽結(jié)合肽并進行初步鑒定。結(jié)果表明：磷酸鹽緩沖液溶解法提取發(fā)酵20 d酸肉粗肽含量較高且膽酸鹽結(jié)合能力較好。通過不同極性大孔樹脂篩選，發(fā)現(xiàn)DA201-C對酸肉粗肽樣品的吸附和解吸效果最好，純化酸肉粗肽最佳工藝條件為上樣質(zhì)量濃度5 mg/mL、上樣流速1.5 mL/min、洗脫流速3 mL/min、洗脫體積3.5 BV、洗脫劑體積分數(shù)75%乙醇(V/V)。進一步采用葡聚糖凝膠層析分離得到F1和F2兩組分，F(xiàn)2組分膽酸鹽結(jié)合能力較好，是由分子質(zhì)量范圍在265 Da～1.4 kDa的混合小肽組成，F(xiàn)2有高含量的疏水性和芳香族氨基酸。這可能是F2組分具有膽酸鹽結(jié)合效果的原因，苯丙氨酸可能是其具有膽酸鹽結(jié)合活性的關(guān)鍵組分。

發(fā)酵酸肉；膽酸鹽結(jié)合肽；分離純化；初步鑒定

傳統(tǒng)發(fā)酵酸肉是以新鮮豬肉為原料，配以米粉、鹽及香辛料，在自然條件下厭氧發(fā)酵而成的一種發(fā)酵肉制品[1]，由于微生物的生長，在微生物胞外酶和自身存在酶系作用下，原料基質(zhì)中蛋白質(zhì)、脂類、糖類等大分子降解，賦予發(fā)酵食品獨特的風味和營養(yǎng)特性[2]。微生物胞外蛋白酶可降解蛋白質(zhì)產(chǎn)生活性肽類，如ACE抑制肽、抗血栓肽、酪蛋白磷酸肽和細胞生長調(diào)節(jié)肽等[3-5]。目前的研究顯示發(fā)酵酸肉蛋白質(zhì)、脂肪及膽固醇降解，并有輔助調(diào)降血脂效果，一些食物蛋白含有降血脂小肽[6-7]。為此，擬以膽酸鹽結(jié)合能力為指標，采用系列提取和分離純化方法從發(fā)酵酸肉中制備膽酸鹽結(jié)合肽并進行初步鑒定，為傳統(tǒng)發(fā)酵食品的功能化開發(fā)提供有關(guān)降血脂的基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料及處理

新鮮后腿豬肉，加碘食鹽及大米：重慶北碚永輝超市。大米淘洗后炒至微黃，磨粉過20目篩，備用。發(fā)酵酸肉制備：原料肉→清洗→切成厚度約4 mm片狀→加調(diào)味料(鹽、米粉等)→揉制裝壇→密封(水封)→發(fā)酵(10～20 ℃)→成品。

1.2 主要試劑

K3PO4、酒石酸鉀鈉、NaH2PO4、Na2HPO4，茚三酮等，均為分析純，成都市科龍化工試劑廠；氧化型谷胱甘肽、還原型谷胱甘肽、牛磺膽酸鈉(STC)，北京Solarbio公司；甘氨膽酸鈉(SGC)、膽酸鈉(SC)，damas-beta試劑公司；乳鏈菌肽、桿菌肽，阿達瑪斯試劑有限公司；考來烯胺,上海永葉生物科技有限公司。

D101大孔樹脂、NKA-9極性大孔樹脂，成都市科龍化工試劑廠；AB-8大孔樹脂、DA201-C大孔樹脂，上海摩速科學器材有限公司；SephadexG-25凝膠，Pharmacia公司；乙腈色譜純，上海泰坦科技有限公司。

1.3 主要儀器設(shè)備

DZF-6020真空干燥箱，上海齊欣科學儀器有限公司；Avanti J-30I貝克曼冷凍離心機，美國貝克曼庫爾特公司；ALPHA1-4LSC真空冷凍干燥機，德國Christ公司；UV-2450紫外分光光度計，日本島津公司；DBS-100電腦全自動部分收集器，上海滬西分析儀器廠有限公司；日立L-8800氨基酸全自動分析儀，日本HITACH公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 肽提取及膽酸鹽結(jié)合能力分析

1.4.1.1 鹽酸溶解法[8]提取肽

取不同發(fā)酵時段酸肉，剔除可見脂肪和筋膜，生理鹽水去脂后切碎，稱取50 g入三角瓶中，加入200 mL 0.01 mol/L HCl溶液，高速勻漿6次(15 000 r/min，每次15 s，間隔10 s)，然后置冷凍離心機(4 ℃，8 000 r/min)離心25 min，離心后取上清液過濾，加入約3倍體積40%(V/V)乙醇，4 ℃放置12 h，再次離心(4 ℃，8 000 r/min，20 min)，取上清液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中真空濃縮，濃縮干燥后溶于去離子水，經(jīng)真空冷凍干燥48 h制成干粉，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.1.2 磷酸鹽緩沖液溶解法[9]提取肽

取不同發(fā)酵時段酸肉，剔除可見脂肪和筋膜，生理鹽水洗去脂肪后切碎，稱取50 g入三角瓶，加入150 mL 0.2 mol/L pH=7.2磷酸鹽緩沖液，高速勻漿4次(18 000 r/min，每次10 s，間隔10 s)，靜置20 min后，4 ℃，8 000 r/min，離心25 min，離心后取上清液過濾，加入約3倍體積40%(V/V)乙醇，4 ℃放置12 h，再次離心(4 ℃，8 000 r/min，20 min)，取上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空濃縮后經(jīng)真空冷凍干燥48 h制成干粉，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.1.3 結(jié)合膽酸鹽能力分析

根據(jù)參考文獻[10]略作修改。粗肽樣品用純水配成5 mg/mL溶液，取1 mL于10 mL具塞試管中；各試管加入1 mL 0.01 mol/L HCl模擬人體胃酸性環(huán)境，37 ℃恒溫振蕩消化1 h；以0.1 mol/L NaOH調(diào)至pH 6.3，分別加入配制好的膽酸鹽標準液5 mL，恒溫振蕩1 h；然后轉(zhuǎn)入離心管(4 000 r/min)離心20 min；取上清液2.5 mL，加入7.5 mL質(zhì)量分數(shù)為60%的硫酸溶液，70 ℃水浴30 min，取出，冰浴5 min，在386 nm測定各樣品吸光度，通過標準曲線計算單位質(zhì)量粗肽樣品結(jié)合膽酸鹽能力。

1.4.2 膽酸鹽結(jié)合肽的分離純化

1.4.2.1 大孔樹脂預(yù)處理及篩選[11-12]

選擇不同極性大孔樹脂DA201-C、AB-8、NKA-9和D101。95%乙醇浸泡24 h使充分溶脹。棄掉乙醇，蒸餾水沖洗樹脂至無乙醇味，然后用2～3倍體積4%的NaOH浸泡3～5 h，用蒸餾水洗至中性，再用2～3倍體積4%的HCl浸泡3～5 h，用蒸餾水洗至中性，蒸餾水浸泡備用。

以吸附率及解吸率為指標，比較4種大孔樹脂對酸肉粗肽的吸附與解析效果。分別稱取5 g預(yù)處理好的大孔樹脂(濕重)，置100 mL錐形瓶中，加入20 mL質(zhì)量濃度為5 mg/mL的酸肉粗肽溶液，于25 ℃，150 r/min搖床振蕩12 h，使大孔樹脂充分吸附，測定吸附前后溶液酸肉粗肽含量變化。同理，將充分吸附后的大孔樹脂用濾紙吸取表面溶液，置于100 mL干燥錐形瓶中，加入20 mL 70%的乙醇解吸，在25 ℃(150 r/min)恒溫搖床中振蕩12 h。按公式(1)和(2)分別計算吸附率與解吸率。

(1)

式中：Q，吸附率，%；C0，多肽初始濃度，mg/mL；Ce，吸附后的溶液多肽質(zhì)量濃度，mg/mL。

(2)

式中：R，解吸率，%；V1，解吸液的體積，mL；V0，原液體積，mL；C1，解吸后的多肽質(zhì)量濃度，mg/mL。

1.4.2.2 DA201-C大孔樹脂吸附與解吸[13]

(1)靜態(tài)吸附與解吸

稱取5 g DA201-C大孔樹脂于100 mL干燥錐形瓶中，加入20 mL 5 mg/mL粗肽溶液，于25 ℃，150 r/min搖床中振蕩5 h，每30 min取樣1次，測定多肽含量，計算吸附率，繪制靜態(tài)吸附曲線。稱取5 g吸附充分的大孔樹脂，用濾紙吸干表面溶液，置100 mL干燥錐形瓶中，加入20 mL 70%乙醇，于25 ℃，150 r/min搖床中振蕩5 h，每30 min取樣1次，測定多肽濃度，以時間為橫坐標，解吸量為縱坐標繪制解吸曲線。

(2)動態(tài)吸附與解吸

a.上樣濃度: 將不同濃度粗肽溶液以1 mL/min速度上樣，待吸附4 h后，分別取吸附后的溶液測吸附率，確定最佳上樣濃度。

b.上樣流速: 將質(zhì)量濃度為5 mg/mL粗肽液10 mL以不同上樣流速進樣，待吸附4 h后，取吸附后溶液測定多肽吸附率，以確定最佳上樣流速。

c.洗脫劑濃度: 在徑高1.6 cm×100 cm層析柱中裝入預(yù)處理的DA201-C大孔樹脂，濕法上柱，讓其自然沉降得柱高約80 cm，柱床體積(BV)約160 mL樹脂固定床?？刂坪懔鞅靡?.5 mL/min上樣速度進樣濃度為5 mg/mL的樣品溶液10 mL，待樹脂吸附飽和后，分別用25%、50%、75%、100%體積分數(shù)乙醇以2 mL/min流速進行洗脫，測定不同體積分數(shù)乙醇洗脫液解吸量，確定最佳洗脫液體積分數(shù)，并測定各體積分數(shù)乙醇洗脫液解吸物質(zhì)的膽酸鹽結(jié)合能力。

d.洗脫流速: 將質(zhì)量濃度為5 mg/mL粗肽液10 mL以1.5 mL/min上樣流速進樣，待樹脂吸附飽和，用體積分數(shù)75%乙醇以不同流速進行洗脫，確定最佳洗脫流速。

e.洗脫體積：在徑高1.6 cm×100 cm層析柱中裝入預(yù)處理的大孔樹脂，濕法上柱，讓其自然沉降得柱高約80 cm，柱床體積約160 mL樹脂固定床?？刂坪懔鞅靡?.5 mL/min進樣速度上樣5 mg/mL的樣品液10 mL，待樹脂吸附飽和后用75%乙醇以3 mL/min流速進行洗脫，直到不再有多肽析出，確定最佳洗脫液體積。

1.4.2.3 葡聚糖凝膠Sephadex G-25分離純化

取適量葡聚糖凝膠，用約5倍體積超純水浸泡24 h，棄上層懸浮物，沸水浴1 h，使其充分溶脹后除去上層細小顆粒，用超純水洗滌2～3次，真空泵除氣泡備用。取預(yù)處理好的葡聚糖凝膠，加入適量超純水，邊攪拌邊將均勻的凝膠液倒入層析柱中，打開出水口，使其自然沉降，待凝膠柱高約60 cm時，停止裝柱，關(guān)閉出水口。將經(jīng)DA201-C大孔樹脂純化組分用超純水配成5 mg/mL溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后，取5 mL上樣進行分離，洗脫流速0.5 mL/min，洗脫組分分管收集，每管收集6 min，220 nm檢測。重復(fù)上樣，相應(yīng)組分峰各試管洗脫組分合并，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和真空冷凍干燥制成干粉，測定各組分峰洗脫物質(zhì)膽酸鹽結(jié)合效果。

1.4.2.4 肽濃度的測定

雙縮脲法[14]。以Gly-Gly-Tyr-Arg四肽標品繪制標準曲線，經(jīng)擬合回歸方程為：y=0.354 2x+0.000 6，R2=0.996 1。

1.4.3 膽酸鹽結(jié)合肽初步鑒定

1.4.3.1 分子量[15]

將已知分子量的氧化型谷胱甘肽GSSG(M612)、還原型谷胱甘肽GSH(M307)、乳鏈菌肽(M3510)、桿菌肽(M1422)分別溶于超純水，配成濃度為5 mg/mL標準品溶液，將4種標準品混合均勻，取5 mL上樣分離，洗脫流速0.5 mL/min，每管收集6 min，220 nm檢測。以標準品的分子量對數(shù)為縱坐標，以保留時間為橫坐標繪制標準曲線。

1.4.3.2 反相高效液相色譜(RP-HPLC)分析

用超純水將膽酸鹽結(jié)合肽配成5 mg/mL溶液，利用RP-HPLC分析。色譜條件：檢測波長：220 nm；色譜柱：Kromasil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL；流動相：A:超純水(過0.45 μm濾膜)B：乙腈(過0.45 μm濾膜)；洗脫流速：1 mL/min；洗脫條件：0～5 min，0%～10% B，5～10 min，10%～20% B，10～15 min，20%～40% B，15～20 min，40%～20% B，20～25 min，20%～10% B，25～30 min，10%～0% B。

1.4.3.3 氨基酸組成分析

(1)水解樣品前處理：準確稱取樣品0.110 0 g于15 mm×150 mm試管中，向試管中加入10 mL濃度為6 mol/L的HCl，振蕩混勻。用酒精噴燈把該試管口下1/3處拉細到4～6 mm，抽真空10 min后密封試管。將處理過的試管置于110±1 ℃恒溫烘箱中沙浴水解22 h，取出冷卻至室溫，搖勻后過濾，取1 mL濾液于50 mL燒杯中，60 ℃恒溫水浴蒸干，用0.02 mol/L HCl將其稀釋4倍，用0.22 μm濾膜過濾，上機分析。

(2)未水解樣品前處理：準確取樣品0.180 0 g于5 mL塑料離心管中，加入4 mL 4%磺基水楊酸溶液，超聲30 min，冰箱靜置過夜，15 000 r/min離心4 min，稀釋8倍后用0.22 μm濾膜過濾上機分析。

(3)全自動氨基酸分析條件：分離柱(4.6 mm×60 mm)：洗脫液流速0.4 mL/min，柱溫70 ℃，柱壓11.627 MPa ；反應(yīng)柱：茚三酮及茚三酮緩沖液流速0.35 mL/min，柱溫135 ℃，柱壓1.078 MPa。

1.5 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵時段粗肽提取

如圖1，2種提取方法均以發(fā)酵20 d酸肉粗肽得率最高，以磷酸鹽緩沖液法最高為2.28%，是鹽酸溶解法的1.56倍。經(jīng)對所得粗肽純度進行測定，磷酸鹽緩沖液提取法所得粗肽純度40.1%，稍高于鹽酸溶解法的38.2%。后續(xù)研究選擇磷酸鹽緩沖液提取酸肉粗肽。

圖1 不同發(fā)酵時段酸肉粗肽得率Fig.1 The crude peptide yield of sour meat in different fermentation time

2.2 不同發(fā)酵時段粗肽膽酸鹽結(jié)合能力

如圖2，發(fā)酵20～40 d酸肉粗肽對3種膽酸鹽吸附量明顯高于其他發(fā)酵時段(P<0.05)。各發(fā)酵時段粗肽對甘氨膽酸鈉和膽酸鈉結(jié)合效果優(yōu)于對牛磺膽酸鈉結(jié)合效果。發(fā)酵20 d粗肽膽酸鈉、?；悄懰徕c和甘氨膽酸鈉吸附能力分別是其他發(fā)酵時段的1.1～4.6倍、1.1～2.1倍和1.2～1.9倍。后續(xù)采用發(fā)酵20 d酸肉進行分離純化和肽的初步鑒定。

圖2 不同發(fā)酵時段酸肉粗肽膽酸鹽結(jié)合能力Fig.2 The binding capacity of crude peptide from different fermentation time sour meat on bile acid salt

2.3 膽酸鹽結(jié)合肽的分離純化

2.3.1 大孔樹脂的篩選

按1.4.2.1處理樹脂，吸附與解吸效果如表1，非極性及弱極性的3種大孔樹脂吸附及解吸效果均明顯好于極性的NKA-9，說明酸肉粗肽樣品疏水性較高。其中DA201-C解吸與吸附效果均最好。后續(xù)實驗選擇DA201-C大孔樹脂作為粗肽進一步分離純化材料。

表1 不同樹脂對酸肉粗肽的吸附解吸效果

2.3.2 DA201-C大孔樹脂的靜態(tài)吸附與解吸

如圖3，DA201-C大孔樹脂在0～4 h內(nèi)對樣品吸附率較快，隨時間延長快速增加，約4 h時對樣品吸附趨緩而接近平衡，選擇4 h為適宜的靜態(tài)吸附時間。相對于吸附率變化來說，DA201-C大孔樹脂樣品解吸速率較快，1.5 h時解吸趨于完全，3.5 h后解吸達到平衡,如圖4，選擇3.5 h為合適的解吸時間。

圖3 吸附時間對吸附率的影響Fig.3 The effect of absorption time on adsorption

圖4 解吸時間對解吸率的影響Fig.4 The effect of desorption time on desorption

2.3.3 DA201-C大孔樹脂的動態(tài)吸附與解析

2.3.3.1 動態(tài)吸附

如圖5，多肽吸附率隨粗肽濃度升高快速增加后趨緩，考慮到大孔樹脂利用率及后續(xù)的解吸和樹脂再生等，選擇5 mg/mL為適宜上樣濃度。如圖6，樹脂對樣品吸附率隨上樣流速增加逐漸降低，綜合考慮選擇1.5 mL/min為合適上樣流速。

圖5 上樣質(zhì)量濃度對吸附率的影響Fig.5 The effect of concentration of crude peptide on adsorption

圖6 流速對吸附率的影響Fig.6 The effect of sample flow velocity on adsorption

2.3.3.2 動態(tài)解吸

如圖7，隨乙醇體積分數(shù)增加，多肽解吸率快速增加后略降，體積分數(shù)75%的乙醇效果最好。洗脫流速對解吸率的影響顯示洗脫流速2～3 mL/min解析效果較好，選擇3 mL/min為最佳洗脫流速，如圖8。進一步以體積分數(shù)75%乙醇進行洗脫體積實驗，其解吸效果與用量成正比，隨洗脫劑用量增加解吸率越大，當洗脫劑用量為3.5 BV時，解吸率趨于平衡，從節(jié)省試劑角度考慮，選擇3.5 BV為最佳洗脫劑用量，如圖9。

圖7 乙醇體積分數(shù)對解吸率的影響Fig.7 The effect of ethanol concentration on desorption

圖8 洗脫流速對解吸率的影響Fig.8 The effect of concentration of elution velocity on desorption

圖9 洗脫體積對解吸率的影響Fig.9 The effect of elution volume on desorption

將經(jīng)上述實驗優(yōu)化后收集的不同乙醇濃度洗脫組分經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和真空冷凍干燥制成干粉。將多肽干粉用純水配成5 mg/mL溶液，按1.4.1.3方法測定膽酸鹽結(jié)合能力。結(jié)果如圖10。75%乙醇洗脫組分對膽酸鹽結(jié)合效果顯著高于其他處理(P<0.05)，其對膽酸鈉、?；悄懰徕c、甘氨膽酸鈉吸附能力分別是粗肽的1.4、1.6和1.3倍。

圖10 不同體積分數(shù)乙醇洗脫組分的膽酸鹽結(jié)合效果Fig.10 The binding effect of elution component through different volume fraction ethanol on bile acid salt

2.3.4 葡聚糖凝膠Sephadex G-25分離純化

DA201-C大孔樹脂75%乙醇洗脫組分經(jīng)SephadexG-25葡聚糖凝膠層析后，洗脫得2個組分，分別為F1和F2(圖11)。收集各組分，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和真空冷凍干燥制成干粉，測定各組分肽含量及膽酸鹽結(jié)合能力。結(jié)果如表2。F2膽酸鹽結(jié)合能力增加，是F1結(jié)合能力的1.7倍，相當于考來烯胺結(jié)合量的28.07%。表明具有高膽酸鹽結(jié)合活性的肽主要集中于F2組分中。

圖11 膽酸鹽結(jié)合肽的Sephadex G-25層析分離結(jié)果Fig.11 Sephadex G-25 chromatography results of bile acid salt binding peptide

Table 2 The binding effect of chromatography separation component on bile acid salt

2.4 膽酸鹽結(jié)合肽初步分析

經(jīng)分析F2組分分子量范圍265 Da～1.4 kDa，表明為小肽。進一步進行RP-HPLC分析，主要出現(xiàn)6個峰(圖12)，說明F2組分是由幾種小肽組成的混合物，有待進一步純化。

圖12 RP-HPLC分離F2組分圖譜Fig.12 The RP-HPLC map of component F2

經(jīng)對F2水解前和水解后氨基酸組成進行分析，結(jié)果如表3，F(xiàn)2中肽占比為75.7%，含少量游離氨基酸，占比24.3%；游離氨基酸和肽中疏水值較高的苯丙氨酸和亮氨酸，合計含量分別為2.93 g/100 g和8.40 g/100 g。組成肽的含量較高的氨基酸有組氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、纈氨酸和亮氨酸，占比53.8%。含量和疏水值較高的有苯丙氨酸、亮氨酸、酪氨酸和纈氨酸，占比35.3%，表明F2的膽酸鹽結(jié)合能力主要受肽的影響。這與報道的疏水性和芳香族氨基酸肽段有較強膽酸鹽結(jié)合能力及NAGAOKA等[16]報道的膽酸鹽結(jié)合肽富酪氨酸吻合?？紤]苯丙氨酸疏水性及含量，可能是F2有膽酸鹽結(jié)合活性的關(guān)鍵組分。

表3 F2組分氨基酸組成與含量分析

注：F2多肽氨基酸組成=F2水解后氨基酸組成-F2水解前氨基酸組成

3 結(jié)論

在不同發(fā)酵時段和不同提取方法研究中，以磷酸鹽緩沖液溶解法提取發(fā)酵20 d酸肉得率最高，膽酸鹽結(jié)合能力較好，其中對?；悄懰徕c結(jié)合能力相對較弱。后續(xù)在膽酸鹽結(jié)合肽分離純化中，以膽酸鹽結(jié)合能力為指標對發(fā)酵20 d酸肉中粗肽進行分離純化。

通過不同極性大孔樹脂篩選，發(fā)現(xiàn)DA201-C對酸肉粗肽樣品的吸附和解吸效果最好，選擇作為初步純化膽酸鹽結(jié)合肽的材料。通過靜態(tài)吸附-解吸和動態(tài)吸附-解吸實驗確定了DA201-C大孔樹脂純化酸肉粗肽最佳工藝條件：上樣濃度5 mg/mL、上樣流速1.5 mL/min、洗脫流速3 mL/min、洗脫體積3.5 BV、洗脫劑體積分數(shù)75%乙醇(V/V)。經(jīng)DA201-C大孔樹脂純化后，酸肉粗肽體外膽酸結(jié)合相比粗肽，其對膽酸鈉、?；悄懰徕c、甘氨膽酸鈉吸附能力分別是粗肽的1.4、1.6和1.3倍。

進一步采用葡聚糖凝膠層析分離得到F1和F2兩組分，F(xiàn)2組分膽酸鹽結(jié)合能力較好。經(jīng)對其分子量、RP-HPLC和氨基酸組成分析顯示，F(xiàn)2是由分子量范圍在265 Da～1.4kDa的幾個小肽組成的混合肽，有待進一步純化。氨基酸分析顯示F2含少量游離氨基酸，肽的氨基酸含量占比75.7%，其中含量和疏水值較高的有苯丙氨酸、亮氨酸、酪氨酸和纈氨酸。通過與相關(guān)文獻比較，高含量的疏水性和芳香族氨基酸，可能是F2組分具有膽酸鹽結(jié)合效果的原因，具體到氨基酸，苯丙氨酸可能是其具有膽酸鹽結(jié)合活性的關(guān)鍵組分。

[1] 李宗軍,江漢湖,李紅瓊.中國傳統(tǒng)酸肉生產(chǎn)工藝探討[J].湖南農(nóng)業(yè)大學學報, 2001(4): 31-34.

[2] 李里特,馬艷莉.發(fā)酵食品釀造過程中組分和營養(yǎng)功能因子的變化和調(diào)控[J].中國食品學報, 2011, 11(9):82-92.

[3] CHOI J W. Bioactive peptides in dairy products[J].International Journal of Dairy Technology,2012,65(1):1-12.

[5] NIELSENM S, MARTINUSSEN T, FLAMBARD B, et al.Peptide profiles and angiotensin-I-converting enzyme inhibitory activity of fermented milk products: Effects of bacterial strain, fermentation pH, and storage time[J].International Dairy Journal, 2009(19):155-165.

[6] 衛(wèi)飛.不同發(fā)酵時段酸肉對實驗小鼠血脂的影響研究[D].重慶:西南大學,2012.

[7].陳東華.酸腌肉的營養(yǎng)及安全性研究[D].重慶:西南大學,2008.

[8] 胡亞亞,邢路娟,周光宏,等.不同提取方法對金華火腿粗肽液抗氧化活性的影響[J].食品工業(yè)科技, 2015, 36(14):115-118.

[9] 邢路娟,胡亞亞,周光宏,等.宣威火腿中粗肽的提取與抗氧化活性鑒定[J].南京農(nóng)業(yè)大學學報, 2015, 38(4):661-666.

[10] 陳雅蕙,余瑞元.生物化學實驗原理和方法[M].第2版.北京:北京大學出版社,2005: 262-267.

[11] 宋倩,趙聲蘭,劉芳,等.大孔吸附樹脂分離純化核桃殼總黃酮[J].食品與發(fā)酵工業(yè), 2012,38(12):180-184.

[12] 趙芳春,趙兵,黃云祥.大孔吸附樹脂純化蘆筍皂苷工藝優(yōu)化[J].食品工業(yè)科技,2012,33(18):248-252.

[13] 楊曉艷,馬驥,彭飛,等.大孔樹脂法分離純化莢果蕨總?cè)芠J].食品工業(yè)科技, 2015,36(2):238-242.

[14] 馮雅蓉,馬儷珍,李黎. SephadexG-25對羊骨膠原降血壓肽的分離純化效果研究[J].肉類研究, 2011(6):30-33.

[15] 于娜.卵黃多肽的分離純化及降血脂活性研究[D].沈陽:沈陽農(nóng)業(yè)大學, 2012.

[16] NAGAOKA S, NAKAMURA A, SHIBATA H,et al. A novel bile acid-binding peptide, decreased micellar solubility and inhibited cholesterol absorption in rats[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 2010, 74(8):1 738-1 741.

[17] 張曉梅,鐘芳,麻建國.大豆降膽固醇活性肽的初步分離純化[J].食品與機械,2006(2):33-37.

Purification and preliminary identification of bile acid salt binding peptide from fermented sour meat

XIE Yue-yin1， LI Cheng-long1,2， WEI Cheng1， ZHU Li-juan1， ZHOU Cai-qiong1*

1(Food Science College, Southwest University, Chongqing 400715,China)2(Chongqing Beer,Chongqing 400715,China)

The cholate binding peptides was prepared and preliminarily identified by using traditional fermented sour meat as raw material. Results showed that the extraction rate of phosphate buffer solution was the highest, the content of crude polypeptide was higher and the binding ability of cholate was better after fermentation for 20 d. It was found that the effect of DA201-C on the adsorption and desorption of acidic crude peptide was the best through screening of different polar macroporous resins. The optimal conditions for the purification of acidic crude peptide with DA201-C macroporous resin were as follows:sample concentration of 5 mg/mL, sample flow rate of 1.5 mL/min, elution flow rate of 3 mL/min, elution volume of 3.5 BV, elution volume fraction of 75% ethanol (V/V). Two components F1 and F2 were obtained through further separation using dextran gel chromatography, wherein the binding capacity of F2 group was better, F2 group was composed of small peptides with molecular weights ranged from 265 Da to 1.4 kDa and had a high content of hydrophobic and aromatic amino acids. This may be the reason for the binding of F2, and Phenylalanine may be a key component for its binding activity.

fermented sour meat; cholate binding peptides; separation and purification; preliminary identification

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201702009

碩士研究生(周才瓊教授為通訊作者，E-mail：zhoucaiqiong@swu.edu.cn)。

重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心能力提升項目(cstc2014pt-gc8001)

2016-06-07，改回日期：2016-08-06