田琳琳，沈磊，薛錦鋒，劉明明，梁麗軍

（嘉興市公安局刑警支隊，浙江嘉興 314000）

血液中乙醇檢驗全自動體系的建立

田琳琳，沈磊，薛錦鋒，劉明明，梁麗軍

（嘉興市公安局刑警支隊，浙江嘉興 314000）

目的建立血液中乙醇含量檢驗的自動化體系。方法采用自動化工作站提取-頂空氣相色譜檢驗。在自動化工作站提取中，對負壓采血、頂空瓶密封時間、取樣針進行考察優(yōu)化，并對自動取樣和手工取樣進行比較。結(jié)果乙醇的自動化工作站提取-頂空氣相色譜檢驗的定量分析數(shù)據(jù)穩(wěn)定，兩份平行樣品相對相差小于5%，優(yōu)于手工提取。乙醇含量在0.1～3.0mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r≥0.999），重現(xiàn)性好。結(jié)論該方法具有操作簡單快捷、實驗流程更加規(guī)范、實驗數(shù)據(jù)更加準確、消除人工操作誤差、重現(xiàn)性好等特點，可廣泛應用于血液中乙醇定性定量的檢驗鑒定。

法醫(yī)毒理學；乙醇；血液；頂空氣相色譜法；自動化工作站

2011年《刑事訴訟法修正案（八）》實施以來，醉駕入刑一直是社會關(guān)注的焦點。認定酒后駕車交通違法行為，血液中乙醇含量檢驗已成為量刑的重要證據(jù)。隨著社會的發(fā)展和人們法制意識的不斷提高，乙醇檢驗的準確率和規(guī)范化也受到人們的關(guān)注。如何體現(xiàn)檢驗的公平公正性，如何提高檢驗的時間和效率，已成為目前我國司法鑒定機構(gòu)急需解決的問題。針對乙醇檢驗案件多、檢驗周期短、檢驗人員少、人為干擾等困局，建立一套快速、標準化、自動化的乙醇檢驗體系，已成為現(xiàn)代法庭科學研究的主要方向之一[1-3]。目前，關(guān)于乙醇檢測的樣品前處理過程以人工提取為主[4-6]。本研究通過優(yōu)化血液樣品的自動化提取過程，改良設(shè)備，建立一套全自動乙醇檢驗體系，統(tǒng)一標準化流程。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

交警部門送檢的涉嫌酒駕人員的血液樣品，每批實驗10份。血樣置于添加抗凝劑的真空采血管。

質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、3.0mg/mL的乙醇標準品均購自美國Cerilliant公司。叔丁醇（分析純）購自國藥集團化學試劑有限公司。超純水，由Element A10超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）制得。20mL頂空瓶購自上海安譜科學儀器有限公司。

內(nèi)標液的配制：配制40、10mg/mL叔丁醇儲備液后，用超純水稀釋，制得0.4、0.01 mg/mL叔丁醇工作液，置于冰箱冷藏保存。

1.2 儀器及條件

LA-520自動化液體工作站（上海LABHANDS公司）。456-GC氣相色譜儀［布魯克（北京）科技有限公司）］；色譜柱為DB-ALC1毛細柱（30 m×0.32 mm，1.8 μm）；進樣口溫度為150℃；柱溫為恒溫40℃（6 min）；檢測器為FID；檢測器溫度為250℃；載氣（N2）流量為2mL/min；自動進樣；進樣量為1mL；分流比為20∶1。

1.3 樣品制備

自動化工作站取樣：取0.4mg/mL叔丁醇工作液100μL，加血液樣品200μL，加超純水3.9mL，混合后密封，制成待測樣品。加血液樣品前加空氣100μL，加水前加空氣200μL。洗針次數(shù)：運行前6次，運行中3次，運行結(jié)束3次。每個樣品平行操作兩次，得到兩個平行樣品，并計算相對相差（relative deviation，RD）。兩個平行樣品的RD若不超過10%，定量數(shù)據(jù)可靠[5]。

手工取樣：取待測血液200μL，加入叔丁醇工作液（0.01 mg/mL）4 000 μL，置于頂空瓶中，密封后待測。每個樣品平行操作兩次，并計算RD。

1.4 方法

1.4.1 負壓采血對實驗的影響

采血管常規(guī)為負壓采血，因此，自動化工作站在提取血樣時，程序設(shè)置取樣同時加入一定量的氣體，使其在一定的壓力下取樣。其他條件不變，對負壓采血（瓶蓋未打開）與常壓采血（瓶蓋打開）進行實驗。

1.4.2 頂空瓶密封步驟的優(yōu)化

頂空瓶的加蓋密封，是自動化工作站取樣的一個步驟。其他條件不變，對空白頂空瓶先加蓋密封放入樣品區(qū)進行取樣與空白頂空瓶先放入樣品區(qū)取樣完成后再密封待檢進行實驗。

1.4.3 取樣針的優(yōu)化

取樣的準確性是整個自動化設(shè)備的關(guān)鍵點，取樣針作為設(shè)備固有配件，其設(shè)計尤為重要，本研究小組與廠家共同設(shè)計新型的取樣針。

1.4.4 自動化工作站取樣與手工取樣的比較

按照優(yōu)化好的方法對自動化工作站制備的樣品與手工制備的樣品進行實驗。

1.4.5 自動化工作站提取-頂空氣相檢測的線性方程、檢出限、定量限和平行性

取0.1～3.0mg/mL各質(zhì)量濃度點的乙醇標準品放入采血管中，按照本研究的方法，利用自動化工作站提取-頂空氣相色譜檢驗，以進樣質(zhì)量濃度為自變量（x），乙醇與內(nèi)標峰面積比值為因變量（y），繪制標準曲線，并按信噪比（S/N=3）計算檢出限，信噪比（S/N= 10）計算定量限。取同一個血液樣品用本方法做8次平行試驗，計算相對標準偏差（RSD）。

2 結(jié)果

2.1 負壓采血與常壓采血的對比

結(jié)果表明，兩種采血方式定量數(shù)據(jù)偏差不大，兩個平行樣品的RD均小于5%，結(jié)果見表1。采血管的負壓對自動化工作站的取樣沒有影響。

表1 負壓采血與常壓采血的定量結(jié)果對比（mg/mL）

2.2 頂空瓶不同密封步驟的對比

結(jié)果表明，空白頂空瓶先加蓋密封的樣品數(shù)據(jù)偏差較大，RD較大，有的超過10%，定量數(shù)據(jù)不可靠。而后密封的樣品數(shù)據(jù)較穩(wěn)定，RD也在合理范圍之內(nèi)，都小于5%，數(shù)據(jù)可靠，數(shù)據(jù)結(jié)果見表2。因此，頂空樣品瓶先加液后密封的方法較為合理。

再次按照先密封后取樣的方法制備一批樣品，但在上氣相色譜儀檢測前更換了新的瓶蓋，定量結(jié)果數(shù)據(jù)穩(wěn)定，RD小于5%，數(shù)據(jù)可靠。頂空瓶密封后再取樣，頂空瓶蓋的硅橡膠墊已經(jīng)被針穿透，頂空瓶在自動進樣器上加熱震蕩平衡時，所測乙醇濃度受到了影響。

表2 頂空瓶密封步驟不同的定量結(jié)果對比（mg/mL）

2.3 取樣針的改進

針對普通取樣針（圖1A）取血樣穿過采血管的橡膠蓋時，因為管壁較薄，穿透力不強；正面單孔穿過橡膠蓋容易造成血凝塊堵塞取樣針等問題，經(jīng)過多次試驗，與廠家共同設(shè)計出一種新型的取樣針（圖1B），其特征為實心刺穿頭，可以有效刺穿橡膠塞，并且減小對瓶塞的損傷，不會堵塞針尖。外孔設(shè)于側(cè)壁，且開有三個外孔，內(nèi)部中空與外孔相通，降低了血凝塊堵塞取樣針的可能性，便于高效、準確、無堵塞地轉(zhuǎn)移血液。

圖1 取樣針圖示

2.4 優(yōu)化好的自動化工作站與手工取樣的比較

經(jīng)過多次試驗，結(jié)果表明，自動化工作站提取和手工提取數(shù)據(jù)有一定差距，自動化提取的定量數(shù)據(jù)更加穩(wěn)定，RD均小于5%，優(yōu)于手工提取（表3）。

表3 自動化取樣與手工取樣定量數(shù)據(jù)的比較（mg/mL）

2.3 線性方程、檢出限、定量限和平行性

乙醇含量在0.1～3.0mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r≥0.999），檢出限為0.01mg/mL，定量限為0.05mg/mL。一個樣品取樣8次，做平行性實驗，RSD為0.95%，重現(xiàn)性好。

3 討論

本研究應用自動化工作站提取-頂空氣相色譜對血液中乙醇進行定性定量分析，建立了血液中乙醇的自動化檢驗體系。該方法統(tǒng)一了標準化流程，改良了設(shè)備，代替手工操作，幾乎消除了手工操作誤差，避免了人為干擾，提高了實驗結(jié)果的穩(wěn)定性和準確性。在自動化前處理過程中考慮了采血管負壓操作、頂空瓶密封時間、取樣針設(shè)計等對實驗結(jié)果的影響。本研究表明，采血管的負壓對操作沒有影響，頂空瓶采用先加液后密封的方法數(shù)據(jù)更穩(wěn)定，取樣針經(jīng)過改良，能夠更高效、準確、無堵塞地轉(zhuǎn)移血液。該自動化檢驗體系與手工提取進行了比較，自動化定量數(shù)據(jù)更加穩(wěn)定，RD均小于5%，優(yōu)于手工提取。乙醇在0.1～3.0mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好（r≥0.999），重現(xiàn)性好。自動化檢驗體系使整個檢驗更加標準化、準確化、規(guī)范化和自動化，體現(xiàn)了司法鑒定的公平性、公正性和嚴謹性，可廣泛應用于血液中乙醇定性定量的檢驗鑒定。

[1]王威，倪春芳，張潤生，等.頂空氣相色譜內(nèi)標法測定人血中乙醇含量的不確定度評定[J].刑事技術(shù)，2009，（3）：24-27.

[2]陳渝，廖林川，顏有儀，等.血液樣品中乙醇穩(wěn)定性的實驗研究[J].刑事技術(shù)，2007，（2）：12-14.

[3]劉冬嫻，賀江南.采血管中添加劑對血樣中乙醇含量的影響[J].法醫(yī)學雜志，2014，30（6）：452-455.

[4]中華人民共和國公安部.生物樣品血液、尿液中乙醇、甲醇、正丙醇、乙醛、丙酮、異丙醇和正丁醇的頂空-氣相色譜檢驗方法：GA/T 1073—2013[S].北京：中國標準出版社，2013.

[5]劉文衛(wèi)，凌霞，周閏，等.自動頂空氣相色譜法測定血液中的乙醇[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2012，22（7）：1502-1503，1506.

[6]唐潔，楊瀟，芮光偉，等.頂空氣相色譜法測定血液中乙醇含量的研究[J].現(xiàn)代科學儀器，2014，（1）：139-142.

Establishment of Automation System for Detection of Alcohol in Blood

TIAN Lin-lin,SHEN Lei,XUE Jin-feng,LIU Ming-ming,LIANG Li-jun
（Criminal Police Branch,Jiaxing Public Security Bureau,Jiaxing 314000,China）

ObjectiveTo establish an automation system for detection of alcohol content in blood.MethodsThe determination was performed by automated workstation of extraction-headspace gas chromatography（HS-GC）.The blood collection with negative pressure,sealing time of headspace bottle and sample needle were checked and optimized in the abstraction of automation system.The automatic sampling was compared with the manual sampling.ResultsThe quantitative data obtained by the automated workstation of extraction-HS-GC for alcohol was stable.The relative differences of two parallel samples were less than 5%.The automated extraction was superior to the manual extraction.A good linear relationship was obtained at the alcohol concentration range of 0.1-3.0 mg/mL（r≥0.999）with good repeatability.ConclusionThe method is simple and quick,with more standard experiment process and accurate experimental data.It eliminates the error from the experimenter and has good repeatability,which can be applied to the qualitative and quantitative detections of alcohol in blood.

forensic toxicology;ethanol;blood;headspace gas chromatography;automation system

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2017.01.006

1004-5619（2017）01-0025-03

2015-07-24）

（本文編輯：嚴慧）

田琳琳（1979—），女，工程師，主要從事毒品毒物的分析；E-mail：349113089@qq.com