百茹峰，呂小嬌，鄂曉霏，于天水，劉冉，張海東

（1.2011司法文明協(xié)同創(chuàng)新中心，北京 100088；2.中國政法大學(xué)證據(jù)科學(xué)教育部重點實驗室，北京 100088）

·論著·

不同高度鈍力打擊致大鼠皮膚與骨骼肌挫傷的對比

百茹峰1，2，呂小嬌1，2，鄂曉霏1，2，于天水1，2，劉冉1，2，張海東1，2

（1.2011司法文明協(xié)同創(chuàng)新中心，北京 100088；2.中國政法大學(xué)證據(jù)科學(xué)教育部重點實驗室，北京 100088）

目的探討不同高度鈍力打擊下，皮膚與骨骼肌挫傷后的修復(fù)過程差異。方法采用自主設(shè)計的自由落體打擊裝置，以打擊高度為主要損傷程度考量因素，將自由落體從15、30、50cm高度打擊造成SD大鼠下肢三種不同程度的挫傷。采用組織形態(tài)學(xué)方法觀察損傷后6h、24h、3d、7d、13d皮膚及肌肉的修復(fù)過程。結(jié)果三個打擊高度引起實驗大鼠下肢挫傷，基本都可形成皮下組織和（或）肌肉內(nèi)的出血，在傷后24h內(nèi)修復(fù)的過程基本類似，但表現(xiàn)程度隨打擊高度增加而明顯；15cm挫傷組在3d時出血區(qū)紅細胞已基本融解消散，而30cm挫傷組則延遲至7d；傷后13d時，15cm和30cm挫傷組表現(xiàn)基本類似，但50cm挫傷組則仍處于增生旺盛期。結(jié)論隨著打擊高度的增加，皮膚及肌肉同時出血的比例明顯增加，挫傷后組織修復(fù)的炎癥反應(yīng)、增生反應(yīng)表現(xiàn)逐漸加重，修復(fù)的過程也出現(xiàn)相應(yīng)的延長。綜合法醫(yī)學(xué)實踐應(yīng)用以及本研究結(jié)果，推薦以50cm高度所致挫傷（2.58J/cm2）作為今后挫傷損傷時間研究的實驗動物參考模型。

法醫(yī)病理學(xué)；皮膚；挫傷；肌，骨骼；大鼠；損傷時間

在機械性損傷的法醫(yī)學(xué)鑒定中，尤其是對于在一定時間段內(nèi)受到多次損傷的案例，損傷時間的判定是需要重點關(guān)注的內(nèi)容。在日常法醫(yī)學(xué)實踐檢案中，挫傷是一種常見的損傷類型，其損傷時間的準確推斷也是法醫(yī)病理學(xué)研究熱點之一。在既往研究中，建立動物挫傷實驗?zāi)Ｐ偷姆椒ú⒉煌耆恢拢缰寡Q鉗夾法、不同高度自由落體打擊等[1-3]，并且未能對使用不同方法所致挫傷的損傷情況、挫傷后的組織修復(fù)基本過程如炎癥階段、增生階段等進行詳細報道，使得應(yīng)用這些實驗?zāi)Ｐ偷玫降膶嶒灲Y(jié)果缺乏可比性；同時，在法醫(yī)學(xué)實踐中，亦需要針對不同程度挫傷情況采用相應(yīng)的損傷時間推斷數(shù)學(xué)模型。鑒于此，本研究采用自由落體打擊方法，對比不同打擊力量對大鼠下肢形成挫傷的損傷程度、損傷的可重復(fù)性、挫傷后的修復(fù)過程，試圖為今后挫傷的損傷時間研究探索重復(fù)性好、容易控制實施的大鼠挫傷實驗?zāi)Ｐ汀?/p>

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

成年健康Sprague-Dawley雄性大鼠61只，體質(zhì)量350～420g（北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司），隨機分為15 cm、30 cm、50 cm挫傷組，每個挫傷組按傷后6h、24h、3d、7d、13d時間段進行觀察。每個挫傷組每個觀察時間點大鼠4只及正常對照組1只。

1.2 打擊裝置的構(gòu)成

本研究中的簡易打擊裝置主要由3部分構(gòu)成：固定架、滑道管、打擊錘。滑道管為一50cm不銹鋼管，兩端鐵片焊接密閉，并在密閉鐵片中心鉆孔，孔的大小可容下打擊錘兩端柱形鋼，打擊錘上下兩端各焊接一柱形鋼，總質(zhì)量為500 g，放置于滑道管內(nèi)，可在上下方向自由滑動。通過調(diào)整、固定滑道管和打擊錘的位置，使得打擊錘能夠按固定高度垂直擊打，打擊錘末端柱形鋼作為與動物相接觸的結(jié)構(gòu)，表面為平面作為打擊面。

1.3 主要試劑

CD3兔抗大鼠多克隆抗體（標記T淋巴細胞）、CD20小鼠抗大鼠單克隆抗體（標記B淋巴細胞）、CD68小鼠抗大鼠單克隆抗體（標記單核巨噬細胞）、alpha-平滑肌肌動蛋白（alpha-smooth muscle actin，α-SMA）小鼠抗大鼠單克隆抗體（標記肌成纖維細胞）、辣根酶標記山羊抗小鼠IgG、辣根酶標記山羊抗兔IgG，以上抗體均購自蘇州睿瀛生物技術(shù)有限公司；髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）兔抗大鼠單克隆抗體（標記中性粒細胞，英國abcam公司）；過氧化物酶封閉液、羊血清封閉液（進口，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；DAB顯色濃縮試劑盒（北京Solarbio科技有限公司）。

1.4 動物模型制備

動物采用速眠新Ⅱ（吉林省敦化市圣達動物藥品有限公司）按0.1mL/kg在左后肢進行肌肉注射麻醉，右后肢剪毛備皮。將大鼠后肢置于伸膝、踝背屈90°位置，于右小腿內(nèi)側(cè)面（距跟骨2.5 cm），分別用自由落體打擊器從15、30、50cm高度打擊致傷。按自由落體勢能計算公式（Ep=mgh）計算打擊勢能，本研究中3個挫傷組打擊的勢能分別為0.74 J、1.47 J、2.45 J。其中，15cm打擊錘末端的直徑為0.8cm（1.46J/cm2），30 cm、50 cm打擊時為了防止皮膚被撕裂，將打擊錘末端直徑增加至1.1cm（1.55J/cm2、2.58J/cm2）。

1.5 取材方法

挫傷后不予任何處理，大鼠分籠飼養(yǎng)于自由獲得飼料與水的潔凈環(huán)境中，待至預(yù)定觀察時間點后頸椎脫臼法處死，并立即取右后肢打擊區(qū)域皮膚與肌肉（腓腸肌），標本大小為1.0cm×0.6cm×0.3cm，在生理鹽水中簡易清洗表面血液后，用4%多聚甲醛溶液固定。正常對照組動物備皮后直接取材。

1.6 切片染色與觀察

HE染色：4μm切片脫蠟至水，蘇木素染色10min，1%鹽酸-乙醇分化，60℃溫水返藍，1%伊紅染色40s，自來水水洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

免疫組織化學(xué)染色：4μm切片脫蠟至水，將切片浸泡在檸檬酸鹽緩沖液（0.01mol/L，pH=6.0）中，95℃或沸水中加熱10 min進行抗原熱修復(fù)；3%過氧化氫溶液20 min，PBS水洗，山羊血清封閉，室溫孵育10 min；直接滴加適當比例一抗（CD3/CD20/CD68：1∶ 200；MPO：1∶ 40；ɑ-SMA：1∶1 200），4℃冰箱過夜；滴加過氧化物酶標記二抗30min；DAB顯色；染核、脫水、透明、封片。

觀察：在CX22型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）下由3名高級職稱法醫(yī)病理學(xué)專家分別進行觀察記錄。

2 結(jié)果

2.1 皮膚及骨骼肌挫傷后的肉眼觀察

所有實驗大鼠均能保持皮膚完整，未出現(xiàn)撕裂創(chuàng)，三組不同高度打擊挫傷大鼠基本都可形成皮下和（或）肌肉組織的出血，具體見表1。50cm高度打擊時出現(xiàn)1例骨折，余實驗動物均未發(fā)生骨折。大鼠右后肢被擊打后均出現(xiàn)不同程度腫脹，呈暗紅色，取材時可見皮膚、肌肉明顯水腫，3d后腫脹基本消退，7d后挫傷區(qū)皮膚類似于正常對照組動物皮膚，在50cm挫傷組中仍可見肌肉內(nèi)灶性出血。

表1 3個挫傷組中皮下和肌肉組織傷后出血例數(shù)[n（%）]

2.2 免疫組織化學(xué)和HE染色形態(tài)觀察

無論是皮膚挫傷區(qū)還是肌肉挫傷區(qū)，隨著損傷時間延長均可分為炎癥、增生、瘢痕形成3個階段，即便在無明顯出血的樣本中，仍可看到有不同程度的修復(fù)過程，如炎癥反應(yīng)等。

隨著打擊高度的增加，挫傷的程度明顯增強，主要表現(xiàn)在皮下組織與肌肉區(qū)挫傷后無出血的例數(shù)下降，以及皮下組織與肌肉區(qū)同時出血例數(shù)增加，并且出血的范圍亦明顯擴大，修復(fù)時間也隨著損傷程度的加重而延長（表2、圖1～2）。

表2 不同打擊高度損傷在觀察時間段的組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)

圖1 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（×100，標尺長度：100μm）

圖2 50cm挫傷組修復(fù)過程（HE×100，標尺長度：100μm）

3 討論

動物實驗的主要局限性是難以找到與人體對外界刺激反應(yīng)完全相類似的實驗動物，盡管如此，動物模型對認識人類損傷、疾病的原因及病理生理過程仍起到至關(guān)重要的作用，并且已成為證實藥物治療作用的有效工具。大鼠與人類在很多器官系統(tǒng)如皮膚等，都具有相似的病理生理特征，大鼠皮膚由表皮和真皮層所構(gòu)成，損傷后的修復(fù)過程同人體大體類似，也要經(jīng)歷炎癥、增生、瘢痕三個過程。其與人體的主要區(qū)別是大鼠屬于“松散皮膚化動物（loose skinned animal）”，皮膚具有較大彈性并缺乏與皮下組織的牢固結(jié)合，創(chuàng)口修復(fù)的主要方式是皮膚收縮，而不是人體的皮膚再生修復(fù)[4]。大鼠作為皮膚實驗的優(yōu)點是其強大的免疫抵抗能力，與大型實驗動物（如豬）相比，大鼠在實驗過程中不易受到外源性細菌感染而發(fā)生敗血癥，亦不出現(xiàn)免疫抑制，其損傷后修復(fù)時間縮短以利于研究者快速認識整個創(chuàng)傷修復(fù)過程。因此，利用大鼠進行皮膚損傷修復(fù)研究，具有經(jīng)濟、高效的特征[4]。基于此，大鼠被廣泛選用為多種皮膚損傷后的修復(fù)研究，如藥物在全層皮膚切除模型的治療作用[5]、放射性損傷模型[6]、皮膚切割傷模型[7]、皮膚燒傷模型[8]等。

損傷時間推斷研究是法醫(yī)病理學(xué)的一個長期關(guān)注熱點，研究對象主要是皮膚[2，3，9，10]、骨骼肌[11，12]等，既往多集中于皮膚切創(chuàng)的損傷時間研究[13，14]。但本實驗室的前期研究[13，15]結(jié)果證實，在皮膚切創(chuàng)和挫傷中，檢測的3個炎癥因子（IL-1beta、COX-2和MCP-1 mRNAs）出現(xiàn)不同的表達方式，說明不同類型的損傷可能存在不同的修復(fù)過程，這就意味著需要針對不同類型損傷研究相應(yīng)的損傷時間推斷方法[13，15]。近年來，損傷時間的研究開始關(guān)注挫傷類損傷[2，3，11，16]，并開展了相應(yīng)的動物模型研究[17]，但對皮膚挫傷的動物實驗?zāi)Ｐ脱芯縿t較少。因此，本研究通過對大鼠下肢不同打擊高度所致挫傷的組織病理學(xué)變化進行系統(tǒng)觀察，以說明不同挫傷程度的組織修復(fù)過程。

在此次研究中，隨著挫傷程度增加，組織學(xué)表現(xiàn)逐漸加重，修復(fù)的過程也出現(xiàn)相應(yīng)的延長。其中50cm挫傷組與彭雪等[3]研究中采用的打擊高度（54 cm）類似，在觀察的時間段中，24 h內(nèi)主要以中性粒細胞炎癥反應(yīng)為主，而至3d以后肌纖維細胞增生為主要表現(xiàn)，7d之后主要表現(xiàn)為肉芽組織增生，炎癥細胞反應(yīng)明顯減少，但仍可見B、C淋巴細胞，單核巨噬細胞與中性粒細胞，而這些炎癥細胞浸潤的表現(xiàn)與15、30cm挫傷組的表現(xiàn)明顯不同。此外，50cm挫傷組中肌肉的組織病理學(xué)表現(xiàn)與于天水等[17]建立的重度肌肉挫傷模型相類似，但該研究未對損傷后炎癥細胞進行分類，且觀察時間最長至傷后第7天。損傷后3d內(nèi)主要以肌肉細胞壞死和炎癥細胞浸潤為主，3 d后則出現(xiàn)分化再生的肌細胞，后者所用的打擊動能為2.25J，與本次研究中50cm挫傷組的勢能2.45J較接近。在運動醫(yī)學(xué)研究中，常用的SD大鼠骨骼肌鈍挫傷實驗?zāi)Ｐ蛠碜杂贙ami等的實驗[18]，采用的是自由落體打擊方法，打擊錘質(zhì)量為350g，高度為45.7cm，打擊動能為1.57J，在劉樹坤等[19]的實驗中，對此類大鼠肌肉鈍挫傷實驗?zāi)Ｐ瓦M行組織病理學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)在挫傷后3 d內(nèi)大量炎癥細胞浸潤，5d時明顯下降，并開始出現(xiàn)少量瘢痕組織，7d后炎癥細胞基本消失，直到14d后仍有瘢痕組織增生趨勢，但在該研究中未能對炎癥細胞進行種類鑒別。

另一方面，在本研究中，30cm、50cm挫傷組在增加打擊高度的同時，亦增加了打擊面積，通過計算單位面積釋放能量，30 cm挫傷組（1.55 J/cm2）與15 cm挫傷組（1.46J/cm2）接近，但通過觀察兩組損傷后的出血情況及修復(fù)過程中的組織學(xué)表現(xiàn)，30cm挫傷組較15cm挫傷組仍然為重，這說明挫傷的嚴重程度不僅與單位面積釋放能量有關(guān)，同時與受力面積成正相關(guān)，由此建議在今后的損傷模型實驗中，不僅應(yīng)報道打擊能量或高度，亦應(yīng)同時報道打擊錘面積的相關(guān)數(shù)據(jù)。

在法醫(yī)學(xué)實踐中，需要推斷損傷時間的案例往往經(jīng)歷了嚴重的損傷，甚至最終死亡；另一方面，本研究結(jié)果證明不同程度挫傷的修復(fù)過程具有差異性，并且在15cm打擊高度時，挫傷后出血情況具有不確定性，可出現(xiàn)在皮下組織和（或）肌肉組織，甚至表現(xiàn)為無出血，而在50 cm打擊高度時，挫傷后出血在皮下和肌肉組織中的占比為87.5%，表明50cm高度打擊所致?lián)p傷具有較好的可重復(fù)性。因此，綜合考慮這些因素，筆者認為在開展挫傷損傷時間推斷研究工作中，以50cm打擊高度（2.58J/cm2）建立實驗動物下肢挫傷模型不僅能夠更客觀模擬現(xiàn)實中需要推斷損傷時間的情況，而且具有較好的實驗重復(fù)性。但還需要引起重視的是，在本研究50 cm挫傷組中，發(fā)生1例骨折情況，意味著隨著打擊高度或者勢能的進一步增加，骨折的發(fā)生率會有相應(yīng)增加，而骨折無疑是在挫傷動物模型基礎(chǔ)上另一新類型損傷的疊加，骨折因素在挫傷實驗中的影響程度可能是進一步研究的內(nèi)容，并且亦是今后挫傷研究者需要認真考慮的因素之一。

（本研究由中國政法大學(xué)青年創(chuàng)新團隊項目資助）

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Comparison of the Skin and Skeletal Muscle Contusion in Rats Induced by Blunt Force with Different Heights

BAI Ru-feng1,2,Lü Xiao-jiao1,2,E Xiao-fei1,2,YU Tian-shui1,2,LIU Ran1,2,ZHANG Hai-dong1,2
（1.2011 Cooperative Innovation Center of Judicial Civilization,Beijing 100088,China;2.Key Laboratory of Evidence Science,China University of Political Science and Law,Ministry of Education,Beijing 100088,China）

ObjectiveTo explore the differences in the repair process of skin and skeletal muscle after contusion caused by blunt force attack with different heights.MethodsThree degrees of contusion were performed on SD rats’right hind limbs by a designed free-dropping device falling from 15,30 and 50cm heights,which as a main consideration factor for degree of injury.The repair process of skin and skeletal muscle at 6 h,24 h,3 d,7 d and 13 d after contusion were observed using routine histological methods. Results Hematoma within skin and/or muscle was found in the rats’hind limbs after contusion with three different heights.The repair processes were similar at 24 h after contusion.However,with the increase of height,the display degree was more obvious.At 3 d after contusion,the RBC of the hemorrhagic region would be decomposed and elapsed in 15 cm contusion group,but for 30 cm contusion group,it delayed to 7 d.At 13d after contusion,the similar result was found in 15cm and 30cm contusion groups,in contrast,the 50 cm contusion group was still in the proliferative phase.ConclusionWith the increase of height,the occurring rate of hematoma within skin and muscle at the same time increases,and the more serious histological appearance after contusion,including inflammation and proliferation,the longer healing process are observed.According to the results of present study and considering forensic application,the contusion model with 50cm height（2.58J/cm2）is recommended as the experimental animal model for the future study of wound age estimation on contusion.

forensic pathology;skin;contusions;muscle,skeletal;rats;wound age

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2017.01.001

1004-5619（2017）01-0001-05

2015-12-03）

（本文編輯：鄒冬華）

國家自然科學(xué)基金資助項目（81172902，81373241）；上海市法醫(yī)學(xué)重點實驗室開放課題資助項目（KF-116）

百茹峰（1977—），男，主任法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)損傷學(xué)研究；E-mail：brf1000cn@aliyun.com

于天水，男，副教授，主要從事法醫(yī)病理學(xué)研究；E-mail：30030005@qq.com