趙效南，葉超群，常維山

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東泰安 271000）

枯草芽孢桿菌對(duì)SPF雞腸道菌群的影響

趙效南，葉超群，常維山*

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東泰安 271000）

研究選用枯草芽孢桿菌作為益生菌，將其添加在基礎(chǔ)日糧中，來評(píng)估其對(duì)10日齡SPF雞腸道菌群的影響。將SPF雞24只隨機(jī)分為兩組：枯草芽孢桿菌處理組（A組）和正常對(duì)照組（B組），連續(xù)飼喂7 d，收集各組盲腸內(nèi)容物，采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)各組SPF雞盲腸內(nèi)容物菌群進(jìn)行分析。結(jié)果表明，A組盲腸內(nèi)容菌群物種多樣性高于B組，A組盲腸內(nèi)容物菌群中有益菌所占的比例（8%）高于B組（2%），試驗(yàn)表明，枯草芽孢桿菌能夠通過調(diào)節(jié)腸道菌群，增加腸道微生物的多樣性，抑制有害菌的生長(zhǎng)，促進(jìn)有益菌的生長(zhǎng)。

SPF雞；枯草芽孢桿菌；腸道微生物；高通量測(cè)序

益生菌是一類對(duì)宿主有益的活性微生物，其可以定植在人和動(dòng)物的腸道，從而對(duì)宿主產(chǎn)生有益作用的微生物，主要包括芽孢桿菌、糞腸球菌、乳酸菌等[1]。益生菌具有調(diào)節(jié)腸道微生物區(qū)系平衡、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、產(chǎn)生生物活性物質(zhì)、抑制病原菌和病毒的作用等[2]。

腸道是動(dòng)物用來消化食物吸收營(yíng)養(yǎng)的主要部位，每g腸道內(nèi)容物中含100億個(gè)細(xì)菌，對(duì)動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)吸收、生長(zhǎng)代謝和免疫抗病等方面發(fā)揮著重要的作用，其結(jié)構(gòu)組成與多樣性是影響宿主健康的重要因素[3-5]。動(dòng)物腸道內(nèi)菌群中有益微生物與有害微生物的種類及數(shù)量長(zhǎng)期處于動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)，腸道微生態(tài)才能得以維持，若正常菌群的種類、數(shù)量和比例發(fā)生變化，有害菌占多數(shù)，會(huì)破壞腸道菌群的平衡，從而對(duì)宿主腸道功能產(chǎn)生不利影響[6-7]。

分析腸道中微生物組成的多樣性有助于了解宿主與菌群間相互作用關(guān)系，并對(duì)益生菌的研究和開發(fā)提供依據(jù)[8-9]。傳統(tǒng)的方法主要是通過對(duì)微生物的分離培養(yǎng)、生化鑒定來對(duì)微生物進(jìn)行表觀的研究，但并不能進(jìn)行更加深層次的了解，并且腸道菌群中還有1%～10%為非培養(yǎng)菌，因此利用傳統(tǒng)的方法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行研究比較局限[10-11]。近些年，利用16SrRNA基因克隆文庫測(cè)序，變形梯度凝膠電泳DGGE，末端限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性T-RFLP等來分析微生物群落的多樣性[12-14]。但常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)只能檢測(cè)到少量的優(yōu)勢(shì)菌群。相對(duì)而言，高通量測(cè)序具有測(cè)序通量高、準(zhǔn)確度高、實(shí)時(shí)檢測(cè)等較為明顯的優(yōu)勢(shì)，顯著拓寬了微生物生態(tài)學(xué)研究的廣度和深度，已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)領(lǐng)域[15-17]。

新生雛雞的腸道幾乎是無菌的，腸道免疫功能相對(duì)不成熟，以上兩個(gè)因素促進(jìn)了致病菌在雛雞腸道內(nèi)存活和定植，使得新生雛雞易患腸道疾病。為預(yù)防腸道疾病的發(fā)生，益生菌在家禽業(yè)的應(yīng)用得到了發(fā)展。已有多項(xiàng)研究表明，芽孢桿菌的攝入會(huì)降低病原菌的水平，而促進(jìn)有益菌的生長(zhǎng)[18]。因此本試驗(yàn)通過對(duì)SPF雞飼喂枯草芽孢桿菌，采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)SPF雞腸道菌群進(jìn)行分析，以探究枯草芽孢桿菌對(duì)腸道菌群的影響。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)動(dòng)物為10日齡SPF雞，體重差異不顯著（P＞0.05），由濟(jì)南斯帕法斯家禽有限公司提供。

1.2 材料與試劑

枯草芽孢桿菌（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)胞免疫實(shí)驗(yàn)室保存）；糞便基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）。

1.3 儀器與設(shè)備

YXQ-LS-50G立式壓力蒸汽滅菌器購(gòu)自上?？茣钥茖W(xué)儀器有限公司；SW-CJ-1G超凈工作臺(tái)購(gòu)自江蘇凈通凈化設(shè)備有限公司；TDZ5-BP離心機(jī)購(gòu)自長(zhǎng)沙湘銳離心機(jī)有限公司；YQX-Ⅱ厭氧培養(yǎng)箱購(gòu)自上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 枯草芽孢桿菌菌液的制備

將枯草芽孢桿菌于MRS培養(yǎng)基37℃厭氧培養(yǎng)24h，計(jì)數(shù)并將芽孢桿菌配制成菌懸液（107cfu·mL-1）。

1.4.2 動(dòng)物的飼養(yǎng)與管理

將SPF雞分為試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組12只。試驗(yàn)組為A組，對(duì)照組為B組。試驗(yàn)組每天在基礎(chǔ)日糧中添加5 mL（107cfu·mL-1）的枯草芽胞桿菌菌懸液，連續(xù)飼喂一周，對(duì)照組正常飼喂基礎(chǔ)日糧。

1.4.3 SPF雞盲腸內(nèi)容物的收集

在第7天，利用斷頸的方式處死SPF雞，無菌收集各組雞只的盲腸內(nèi)容物，每組12只，然后把每組的盲腸內(nèi)容物混合在一起，各組取混勻物2 g加入30 mL的無菌PBS（pH=8.0）振蕩均勻，并將懸濁液離心15 min，連續(xù)清洗沉淀兩次，最后用來提取樣品DNA。

1.4.4 DNA提取和測(cè)序

采用糞便基因組DNA提取試劑盒提取各組SPF雞盲腸內(nèi)容物樣品的DNA，干冰條件下運(yùn)送到北京百邁克生物科技有限公司，通過16SrDNA V3～V4區(qū)引物擴(kuò)增各樣品，通過barcode區(qū)分樣品序列，對(duì)樣品進(jìn)行Alpha多樣性分析。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 菌群多樣性分析

OUT是通過提取樣品的總基因組DNA，利用16sRNA或ITS的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過測(cè)序以后就可以分析樣品中微生物多樣性，每個(gè)OUT對(duì)應(yīng)于一個(gè)不同細(xì)菌（微生物）種。通過OUT分析就可以知道樣品種微生物多樣性和不同微生物的豐度。各組腸道菌群樣品OUT稀釋曲線見圖1。從圖1可知，飼喂枯草芽孢桿菌組（A）糞便中微生物物種的豐度大于對(duì)照組，表明飼喂益生菌有助于增加腸道菌群物種的豐度。

圖1 各組腸道菌群樣品OUT稀釋曲線

各組腸道菌群樣品的Shannon-Wiener曲線見圖2。Shannon-Wiener曲線反映樣品中微生物多樣性的指數(shù)，利用各樣品的測(cè)序量在不同測(cè)序深度時(shí)的微生物多樣性指數(shù)構(gòu)建曲線，以此反映各樣本在不同測(cè)序數(shù)量時(shí)的微生物多樣性。從圖2可知，飼喂枯草芽孢桿菌組（A）盲腸內(nèi)容物微生物的多樣性大于對(duì)照組（B）盲腸內(nèi)容物微生物多樣性。

圖2 各組腸道菌群樣品的Shannon-Wiener曲線

2.2 菌群構(gòu)成分析

各組樣品在菌科和菌屬水平上的相對(duì)豐度見圖3～4。

圖3 各組樣品在菌科水平上的相對(duì)豐度

圖4 各組樣品在菌屬水平上的相對(duì)豐度

由圖3可知，A組樣品的菌群以瘤胃球菌科為主。B組樣品的菌群以擬桿菌科為主。

由圖4可以看出，A組在屬水平上，以巨單胞菌屬為主。B組樣品的菌群以擬桿菌屬為主。其中A組的乳酸菌屬所占的比例高于B組乳酸菌屬所占的比例。

3 討論

消化道微生物組是一個(gè)物種數(shù)量巨大且處于動(dòng)態(tài)的生態(tài)系統(tǒng)，與宿主存在互利共生、同食共生和致病性的關(guān)系，不僅為機(jī)體生長(zhǎng)提供多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、抑制病原菌的定植，同時(shí)對(duì)腸道的形態(tài)、免疫系統(tǒng)的發(fā)育、消化吸收和基因的表達(dá)調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要作用[19]。利用高通量測(cè)序?qū)γつc內(nèi)容物菌群多樣性的分析結(jié)果表明，添加枯草芽胞桿菌能夠增加菌群的多樣性，微生物群體的多樣性可以抑制有害菌的生長(zhǎng)，生態(tài)學(xué)理論推測(cè)菌群種屬的多樣性，能夠降低有害菌的侵襲，由于細(xì)菌只能利用有限的途徑侵入機(jī)體，因此枯草芽孢桿菌可以調(diào)節(jié)腸道微生物的生態(tài)平衡，增加腸道菌群的多樣性[20]。

本研究在菌科和菌屬水平上，A組即添加益生菌組以瘤胃球菌科、巨單胞菌屬為主，這一結(jié)果與Li等報(bào)道的結(jié)果相一致，即在肉雞飼料中添加枯草芽孢桿菌CGMCC 1.1086，不僅能夠促進(jìn)肉雞的生產(chǎn)性能，還能改變?nèi)怆u的腸道微生物，通過對(duì)腸道微生物進(jìn)行高通量測(cè)序，結(jié)果表明，添加枯草芽孢桿菌CGMCC 1.1086組腸道微生物以瘤胃球菌科、巨單胞菌屬為主，同時(shí)瘤胃球菌科能夠增加葡萄糖的代謝和纖維素的消化吸收[21-22]。B組即正常對(duì)照組以擬桿菌科、擬桿菌屬為主，擬桿菌屬是引起腸道疾病重要的病原菌，能夠引起敗血癥等。其中A組的乳酸菌屬所占的比例高于B組乳酸菌屬所占的比例，與齊博等研究結(jié)果相一致，即枯草芽孢桿菌可改善肉仔雞腸道形態(tài)，增加腸道中乳酸菌數(shù)量，促進(jìn)肉仔雞生長(zhǎng)[23]。

枯草芽孢桿菌能夠促進(jìn)乳酸菌等其他有益菌的生長(zhǎng)，可能由于枯草芽孢桿菌是需氧菌，進(jìn)入消化道后能迅速消耗氧氣，促進(jìn)乳酸桿菌厭氧性有益菌的繁殖，抑制大腸桿菌等需氧型有害菌的增殖，此外，枯草芽孢桿菌能產(chǎn)生具有生物活性的抗菌物質(zhì)（脂肽類、肽類等），對(duì)病原菌具有抑制作用[24-25]。表明基礎(chǔ)日糧中添加枯草芽孢桿菌能改善腸道菌群的分布、抵制有害菌的生長(zhǎng)、提高有益菌的比例并促進(jìn)家禽機(jī)體健康生長(zhǎng)。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)研究表明，枯草芽孢桿菌能夠有效的改善盲腸微生物菌群的分布，使瘤胃球菌科、巨單胞菌屬的比例升高，并促進(jìn)其他有益菌的生長(zhǎng)。

[1]何名芳.益生菌粉的研制及復(fù)合益生菌對(duì)小鼠生長(zhǎng)性能的影響[D].南昌:江西農(nóng)業(yè)大學(xué),2014.

[2]Senok A,Ismaeel A,Botta G.Probiotics:facts and myths[J].Clini?cal Microbiology and Infection,2005,11（12）:958-966.

[3]Harris J M.The presence,nature,and role of gut microflora in aquatic invertebrates:a synthesis[J].Microbial Ecology,1993,25（3）:195-231.

[4]Chaiyapechara S,Rungrassamee W,Suriyachay I,et al.Bacterial community associated with the intestinal tract of P.monodon in commercial farms[J].Microbial Ecology,2012,63（4）:938-953.

[5]De Schryver P,Vadstein O.Ecological theory as a foundation to control pathogenic invasion in aquaculture[J].ISME Journal, 2014,8（12）:2 360-2 368.

[6]劉洪明.益生菌-黃芪多糖合生元的研制及其對(duì)腹瀉犢牛腸道菌群結(jié)構(gòu)影響的研究[D].楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué),2009.

[7]丁倩.益生菌制劑的臨床應(yīng)用[J].天津藥學(xué),2005,17（1）:56-58.

[8]Rungrassamee W,Klanchui A,Maibunkaew S,et al.Characteriza?tion ofintestinal bacteria in wild and domesticated adult black ti?ger shrimp(Penaeus monodon)[J].PLoS One,2014,9（3）:91 853.

[9]Newaj-Fyzul A,Al-Harbi A H,Austin B.Review,developments in the use of probiotics for disease control inaquaculture[J].Aqua?culture,2014,431:1-11.

[10]李曉敏,楊麗杰,霍貴成.Illumina技術(shù)研究不同喂養(yǎng)方式嬰兒腸道菌群差異[J].食品科技,2012,9:319-324.

[11]Haraszthy V I,Zambon J J,Sreenivasan P K,et al.Identification of oral bacterial species associated with halitosis[J].The Journal of American Dental Association,2007,138（8）:1 113-1 120.

[12]Johnson C N,Barnes S,Ogle J,et al.Microbial community analy?sis of water,foregut,and hindgut during growth of pacific white shrimp,Litopenaeus vannamei,in closed-system aquaculture[J]. Journal of the World Aquaculture Society,2008,39（2）:251-258.

[13]Li Y H,Chai P C,Hu X G,et al.Analysis of intestinal microecolo?gy of Litopenaeus vannamei in industrial aquaculture by RFLP and DGGE techniques[J].Progress in Fishery Sciences,2014,35（2）:83-89.

[14]李袁飛,成艷芬,朱偉云.T-RFLP分析厭氧真菌傳代頻率對(duì)共存產(chǎn)甲烷菌菌群的影響[J].微生物學(xué)通報(bào),2015,42（3）: 609-619.

[15]秦楠,栗東芳,楊瑞馥.高通量測(cè)序技術(shù)及其在微生物學(xué)研究中的應(yīng)用[J].微生物學(xué)報(bào),2011,51（4）:445-457.

[16]Zhou J Z,Wu L Y,Deng Y,et al.Reproducibility and quantita?tion of amplicon sequencing-based detection[J].ISME Journal, 2011,5（8）:1 303-1 313.

[17]Yang F,Zeng X,Ning K,et al.Saliva microbiomes distinguish car?ies-active from healthy human populations[J].ISME Journal, 2012,6（1）:1-10.

[18]Ng S C,Hart A L,Kamn M A,er al.Mechanisms of action of pro?biotics:recent advances[J].Inflammatory Bowel Diseases,2009, 15（2）:300-310.

[19]Levine J M,Dantonio C M.Elton revisited a review of evidence linking diversity and invasibility[J].Oikos,1999,87（1）:15-26.

[20]Turnbaugh P J,Ley R E,Mahowald M A,et al.An obesity-associ?ated gut microbiome with increased capacity for energy harvest[J]. Nature,2006,444:1 027-1 031.

[21]Liu C,Finegold S M,Song Y,et al.Reclassification of clostridi?um coccoides,ruminococcus hansenii,ruminococcus hydrogeno?trophicus,ruminococcusluti,ruminococcus productus and rumino?coccus schinkii as blautia coccoides gen.nov.,comb.nov.,blautia hansenii comb.nov.,blautia hydrogenotrophica comb.nov.,blau?tia luti comb.nov.,blautia producta comb.nov.,blautiaschinkii comb.nov and description of blautia wexlerae sp nov.,isolated from human faeces[J].Int J Syst Evol Microbiol,2008,58, 1 896-1 902.

[22]Li Y,Xu Q,Huang Z,et al.Effect of Bacillus subtilis CGMCC 1.1086 on the growth performance and intestinal microbiota of broilers[J].Journal of Applied Microbiology,2015,120:195-204.

[23]齊博,武書庚,王晶,等.枯草芽孢桿菌對(duì)肉仔雞生長(zhǎng)性能、腸道形態(tài)和菌群數(shù)量的影響[J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào),2016,28（6）: 1 748-1 756.

[24]Abdelqader A,Alfataftah A R.Effects of dietary Bacillus subtilis and inulin supplementation on performance,egg shell qualitu,in?testinal morphology and microflora composition of laying hens in the late phase if production[J].Animal Feed Science and Technol?ogy,2013,179（1/2/3/4）:103-111.

[25]都海明.抗菌脂肽對(duì)AA肉雞生長(zhǎng)性能、養(yǎng)分代謝及抗氧化機(jī)能的影響[D].南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2009.

Effect ofBacillus Subtilison The Intestinal Microbiota of SPF Chickens

ZHAO Xiaonan,Ye Chaoqun,Chang Weishan*

（College of Animal Science and Technology,Shandong Agricultural University,Taian 271000,Shandong China）

In this study,as a probiotic bacterium,Bacillus subtilis was administered in diet and its effects on the ceacal microbiota of 10 d SPF chickens were evaluated.A total of 24 SPF chickens were randomly allcated into two treatment groups of basal diet containing B.subtilis(A)and basal diet without any addition of probiotics(B).MiSeq high-throughput sequencing analysis of 16SrRNA was used to investigate the bacterial community structure in the caeca of SPF chickens.The results indicated that the species diversity of A group was higher than that of group B and the relative abundance of intestinal microbiota were higher(8%)than those of control(2%)in the caeca of SPF chick?ens fed with B.subtilis.The probiotic B.subtilis could effectively modulate caecal microbiota and promote the grow of theprobiotics.The results of this study promoted application of probiotics in poultry industry.

SPFchickens;Bacillus subtilis;intestinal microbiota;MiSeq high-throughput sequencing

S816.46；S816.6

A

1001-0084（2017）02-0001-04

2017-01-02

趙效南（1987-），女，山東菏澤人，博士，主要從事微生態(tài)制劑研究。

*通訊作者：E-mail:1651512031@qq.com。