徐櫻溪,趙 晴,孫 燦,車千紅,付 瑜,丁 丁,孔 娟

活性維生素D類似物對內(nèi)毒素感染小鼠腎臟細胞因子的影響

徐櫻溪,趙 晴,孫 燦,車千紅,付 瑜,丁 丁,孔 娟*

目的 研究活性維生素D類似物對內(nèi)毒素感染小鼠腎臟細胞因子的影響。方法 將C57 BL/6源性野生小鼠(20只)隨機分為正常對照組(CON組)、帕立骨化醇組(P組)、脂多糖組(LPS組)、帕立骨化醇+脂多糖組(P+LPS組)。比較各組小鼠一般狀態(tài)，應(yīng)用ELISA試劑盒檢測小鼠血清肌酐含量，實時定量PCR法測定小鼠腎臟中細胞因子水平。結(jié)果 一般狀態(tài)比較，P+LPS組小鼠較LPS組小鼠不良反應(yīng)減輕。各組小鼠腎臟形態(tài)學(xué)及血清肌酐水平未見明顯差異。P+LPS組腎臟組織細胞因子IL-1β、ICAM、TNF-α、INF-γ表達比LPS組明顯下降(P<0.05)。結(jié)論 活性維生素D類似物能顯著減少內(nèi)毒素感染小鼠腎臟組織中IL-1β、ICAM、TNF-α、INF-γ的含量，減輕炎性細胞因子介導(dǎo)的腎臟損傷，從而起到對腎臟的保護作用。

活性維生素D類似物;內(nèi)毒素;細胞因子

0 引言

維生素D主要通過作用于骨、腎、甲狀旁腺等組織調(diào)節(jié)鈣磷代謝，維持礦物質(zhì)及骨代謝平衡，其非傳統(tǒng)生物學(xué)效應(yīng)近年來也受到廣泛的重視。1,25-(OH)2D3是維生素D的活性形式,大多數(shù)維生素D的生物學(xué)效應(yīng)都是通過1,25-(OH)2D3與維生素D受體(VDR)結(jié)合發(fā)揮調(diào)節(jié)下位基因的作用實現(xiàn)的。隨著VDR在不同組織表達的發(fā)現(xiàn)，其相應(yīng)的生理功能被揭示,活性維生素D及其類似物的作用也得到證實，在腎臟疾病、心血管疾病、免疫炎性反應(yīng)、腫瘤等方面都有一定作用,其抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用近來更是受到了廣泛的關(guān)注[1-5]。活性維生素D及其類似物作用于抗原提呈細胞(APCs)及T淋巴細胞參與免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)及炎癥反應(yīng)，其可調(diào)控多種免疫、防御細胞的功能，包括巨噬細胞、單核細胞、上皮細胞、淋巴細胞等[6]。實驗中發(fā)現(xiàn)，活性維生素D及其類似物可以延長腎臟、肝臟、胰腺等存活時間，降低慢性腎臟病患者尿蛋白[7]、減少足細胞損傷和丟失[8],增加糖尿病腎病小鼠超氧化物歧化酶活性，抑制腎素受體、轉(zhuǎn)化生長因子-βl、單核細胞趨化蛋白l的活性，恢復(fù)nephrin的表達[9]?；钚跃S生素D及其類似物的缺乏與慢性炎癥及糖尿病腎病的發(fā)生及發(fā)展相關(guān)[10-12]。目前針對活性維生素D及其類似物對腎臟作用的研究多為對慢性損傷腎臟的保護作用，而活性維生素D及其類似物對急性炎癥反應(yīng)所致腎臟損傷影響的研究較少。本研究采用活性維生素D類似物干預(yù)內(nèi)毒素感染小鼠模型，以探究活性維生素D類似物對內(nèi)毒素感染小鼠腎臟細胞因子的影響，從而進一步研究活性維生素D及其類似物對腎臟應(yīng)激損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及處理方法 C57 BL/6源性野生小鼠20只，2月齡，體重20～25 g，性別不限，室溫飼養(yǎng)，飼料為普通動物飼料，自由飲水進食。隨機分4組，每組5只。正常對照組(CON組)：腹腔注射60%丙二醇注射液2周，隔日1次，每次200 μL/只。帕立骨化醇組(P組):400 ng/kg帕立骨化醇溶解在60%丙二醇注射液中,每次200 μL/只，腹腔注射2周，隔日1次。脂多糖組(LPS組)：腹腔注射60%丙二醇注射液，隔日1次，每次200 μL/只，2周后予LPS以15 mg/kg腹腔注射,18 h后處死。帕立骨化醇+脂多糖組(P+LPS組)：400 ng/kg帕立骨化醇溶解在60%丙二醇注射液中，每次200 μL/只，腹腔注射，隔日1次，喂養(yǎng)2周后予LPS以15 mg/kg腹腔注射，18 h后處死。

1.2 組織學(xué)處理 脫頸處死各組小鼠，立即冰上取新鮮腎臟組織，應(yīng)用OCT復(fù)合物包埋，-80 ℃冰箱冷凍、切片，蘇木精伊紅(HE)染色,200倍顯微鏡下觀察腎臟組織病變情況。

1.3 各組小鼠血清肌酐測定 經(jīng)右心室取血，離心后取上清，應(yīng)用ELISA試劑盒檢測各組小鼠血清肌酐含量，采用ABCAM公司試劑盒，貨號Creatinine Assay(ab30719)，依照說明操作。

1.4 各組小鼠腎臟組織細胞因子測定 實時定量PCR法測定小鼠腎臟組織中細胞因子mRNA的表達水平：提取小鼠腎組織，按照試劑說明書用TRizol法提取總RNA，用美國Invitrogen公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用Primer 3.0設(shè)計合成特異性引物(如表1)。

表1 細胞因子引物序列

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般狀態(tài)比較 CON組及P組小鼠一般狀態(tài)良好，活動情況、進食(水)量、尿量、體溫等指標無明顯差異。注射LPS 3 h后，LPS組5只小鼠均逐漸出現(xiàn)皮膚潮濕，倦怠，活動能力下降，進食及進水量進行性下降，排便明顯增多，呼吸深大。注射LPS 4 h后，P+LPS組3只小鼠逐漸出現(xiàn)皮膚潮濕，倦怠，活動能力下降，進食及進水量進行性下降，腹瀉明顯，呼吸深大，但較LPS組減輕，且其中2只小鼠一般狀態(tài)良好，活動情況、進食(水)量、尿量、體溫等指標較CON組無明顯差異。

2.2 各組小鼠腎臟形態(tài)學(xué)及組織學(xué)比較 四組小鼠腎臟大小正常，顏色紅潤，無腫脹、出血，光鏡下可見腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)正常，無變性壞死，細胞形態(tài)比較無明顯差異。

2.3 各組小鼠腎臟功能的比較 經(jīng)右心室取血，離心后取上清，應(yīng)用ELISA試劑盒檢測各組小鼠血清肌酐含量。各組小鼠肌酐值比較，P+LPS組較LPS組小鼠血清肌酐值略下降，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見圖1)。

2.4 各組小鼠細胞因子水平的變化 用實時定量PCR法測定各組小鼠腎臟組織中細胞因子mRNA的表達水平。P+LPS組IL-1β、TNF-α、

ICAM、INF-γ表達均低于LPS組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；P+LPS組TGFβ-1、MMP3、IL-10較LPS組略有降低，IL-1Ra、IL-6表達較LPS組略有增加，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果提示，活性維生素D類似物降低腎臟組織中IL-1β、TNF-α、ICAM、INF-γ等炎性細胞因子在急性感染時對腎臟的損傷(見圖2)。

圖1 各組小鼠肌酐值比較

圖2 各組小鼠細胞因子水平的變化

3 討論

帕立骨化醇是一種活性維生素D類似物，通過結(jié)合VDR而發(fā)揮相應(yīng)的生理效應(yīng)，同時具有對血鈣影響較小的優(yōu)點[13]。感染所致的膿毒癥是引起急性腎損害的常見原因，LPS是G-菌膿毒血癥致病過程中最重要的介質(zhì)。LPS與細胞膜上的清道夫受體結(jié)合可激活巨噬細胞內(nèi)的多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，如絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路、蛋白激酶c(PKC)通路、核因子(NF)-κB通路等，當巨噬細胞與LPS接觸40～60 min后即分泌大量炎癥介質(zhì)[14]。炎癥介質(zhì)大量釋放及繼之的級聯(lián)反應(yīng)，造成微循環(huán)障礙、組織細胞缺氧，全身炎癥反應(yīng)失控，最終造成多器官功能衰竭，目前已知多種細胞因子參與了內(nèi)毒素血癥所引發(fā)的多臟器功能衰竭。

本實驗研究中，C57 BL/6源性的野生小鼠注射LPS 18 h后小鼠無死亡，進行小鼠腎臟形態(tài)學(xué)及組織學(xué)觀察及血清肌酐測定，各組未見明顯差異。既往研究中曾發(fā)現(xiàn)，在LPS行腹腔注射18 h后，小鼠的肝臟中巨噬細胞特異性抗體染色的巨噬細胞數(shù)量明顯增多[15]，LPS注射12 h后，小鼠后腸道黏膜損傷程度評分明顯增高[16]，肺上皮細胞屏障完整性明顯受損[6]。本研究中，LPS組小鼠注射內(nèi)毒素3 h后，5只小鼠均逐漸出現(xiàn)異常表現(xiàn)，以倦怠、排便明顯增加及呼吸深大為主，尿量無明顯變化，從小鼠的一般狀態(tài)分析，考慮此時內(nèi)毒素血癥主要影響小鼠肝臟、腸道及呼吸系統(tǒng)，對腎臟的損傷無論從組織形態(tài)學(xué)還是腎臟功能肌酐的測定中均未出現(xiàn)明顯異常。LPS趨化作用來自于血液循環(huán)中的單核細胞，LPS腹腔注射后，經(jīng)腸系膜、大小網(wǎng)膜吸收入血，進入腸系膜靜脈到達肝臟,首先對腸道及肝細胞產(chǎn)生毒性作用[15]?？紤]本研究中小鼠出現(xiàn)異常表現(xiàn)的原因多為腸道、肝臟及肺損傷所致，對腎臟為早期損傷，在腎臟形態(tài)學(xué)上并未明顯變化，對細胞因子的影響較為明顯。

本研究為內(nèi)毒素所致腎臟損傷的早期，活性維生素D類似物對細胞因子的影響更具有指導(dǎo)意義。IL-1的活性形式有IL-1α、IL-1β、IL-1γ 3種，IL-1β是其在血液和組織液中的主要形式，不僅能夠協(xié)同其他細胞因子促進T、B細胞活化，而且能夠誘導(dǎo)其他炎癥性介質(zhì)的產(chǎn)生，加強白細胞與內(nèi)皮細胞黏附，調(diào)節(jié)TNF-α、IL-6的產(chǎn)生[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，活性維生素D類似物可以抑制內(nèi)毒素血癥早期腎臟組織中IL-1β的升高，抑制炎癥反應(yīng)對腎臟的損傷。血管內(nèi)皮細胞是內(nèi)毒素作用早期的主要靶細胞，內(nèi)毒素對血管內(nèi)皮細胞的損傷與激活和重度感染后機體免疫功能紊亂與多器官功能衰竭密切相關(guān)[18]。ICAM-1在增生的血管內(nèi)皮細胞上表達最強，ICAM-1促進白細胞與內(nèi)皮細胞之間的黏附可能是誘導(dǎo)血管生成，因此，ICAM在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，活性維生素D類似物可以降低內(nèi)毒素血癥早期腎臟組織中ICAM-1的分泌，使后續(xù)腎缺血再灌注損傷減輕。TNF是細胞因子系統(tǒng)的關(guān)鍵部分，當細菌或毒素進入機體后，TNF-α在循環(huán)中較早出現(xiàn)并迅速達到高峰，可以直接損傷組織細胞，還可以激活中性粒細胞，使后者進一步釋放各種炎癥因子，引起進一步損傷，也可以介導(dǎo)IL-1，使損傷進一步加重[19]。既往研究發(fā)現(xiàn)，活性維生素D可通過抑制慢性腎臟損傷中TNF-α的表達，減輕炎性浸潤，減少蛋白尿，進而緩解腎損傷[20]。輔助性T淋巴細胞在細胞免疫中起主要的作用。IFN-γ是Th1細胞分泌的細胞因子中的代表性因子，能夠促進原始T細胞分化為Th1細胞，并增強Th1細胞的活性，同時能有效抑制原始T細胞向Th2細胞分化增殖，也可上調(diào)單核巨噬細胞的殺菌作用。IFN-γ還是激活并調(diào)節(jié)單核巨噬細胞分化的重要細胞因子之一。Th1和Th2細胞是決定細胞免疫類型的主要因素，Th1細胞選擇性激活引起細胞免疫，而Th2細胞選擇性激活體液免疫。IFN-γ抑制Th2細胞，進一步抑制體液免疫，而使免疫應(yīng)答向細胞免疫應(yīng)答的方向進行。急性感染期，Th1細胞處于激活狀態(tài)，IFN-γ明顯增高[21-23]。本研究發(fā)現(xiàn)，P+LPS組IFN-γ較LPS組下降明顯，考慮內(nèi)毒素所致的腎臟損傷在腎臟組織學(xué)及腎臟功能尚未發(fā)生異常的早期階段，活性維生素D類似物抑制誘導(dǎo)后續(xù)炎癥及免疫反應(yīng)細胞因子，對腎臟起到保護作用。

IL-6是單核巨噬細胞產(chǎn)生的細胞因子，在正常情況下可調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，在炎癥反應(yīng)和抗感染防御中起重要作用，而在病理狀態(tài)下，其過度升高可造成機體的病理性損傷。IL-6可刺激腎小球系膜細胞的活化和增生，分泌大量的細胞因子，如IL-1、TGF-I、IL-6等，導(dǎo)致腎小球硬化。IL-6亦可活化B細胞，產(chǎn)生大量的IgE和IgA，形成循環(huán)免疫復(fù)合物，沉積于腎小球系膜區(qū)，引起局部炎癥反應(yīng)。既往研究中證明，活性維生素D可降低糖尿病腎病小鼠腎臟組織中的IL-6，抑制糖尿病腎病腎組織炎癥狀態(tài)，減少蛋白尿，進而保護腎臟。本研究表明，應(yīng)用活性維生素D小鼠腎臟組織中IL-6較LPS組增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，考慮本實驗設(shè)計為急性炎癥反應(yīng)時活性維生素D對腎臟的保護作用，糖尿病腎病小鼠的炎癥狀態(tài)為慢性炎性過程，而且IL-6濃度不同對組織器官的作用也存在差異。有研究提示，低濃度的IL-6預(yù)先提示炎癥反應(yīng)，促進組織復(fù)蘇;而較高濃度的IL-6可導(dǎo)致組織出現(xiàn)瀑布鏈式炎癥損傷反應(yīng)[24]。IL-10通過抑制Th1細胞的增殖和IL-2、IFN等細胞因子的產(chǎn)生，從而抑制Th1免疫應(yīng)答，降低患者的細胞免疫功能，促進Treg的增殖和活化，從而有利于誘導(dǎo)機體對外來病原的耐受。IL-1Ra是主要由單核/巨噬細胞產(chǎn)生的一種IL-1的內(nèi)源抑制劑，可與Ⅰ型和Ⅱ型IL-1R結(jié)合，但不啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，其結(jié)合IL-1受體，與IL-1競爭結(jié)合位點，在阻礙IL-1促炎效應(yīng)中發(fā)揮重要作用。IL-10、IL-1Ra為體內(nèi)重要的抗炎性細胞因子，在應(yīng)用活性維生素D類似物后，在腎臟表達出現(xiàn)增加趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，考慮可能與本實驗樣本數(shù)較小有關(guān)，因此，后續(xù)研究中應(yīng)進一步關(guān)注活性維生素D對抗炎性細胞因子的影響。

綜上所述，活性維生素D類似物能顯著減少內(nèi)毒素感染小鼠腎組織中IL-1β、ICAM、TNF-α、INF-γ的含量，減輕炎性細胞因子介導(dǎo)的腎臟損傷，保護腎臟功能，本研究進一步證明了維生素D受體及其信號系統(tǒng)在感染早期對腎臟的保護作用。

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Effects of active vitamin D analogues on cytokines in kidney of mice with endotoxin infection

XU Ying-xi,ZHAO Qing,SUN Can,CHE Qian-hong,FU Yu,DING Ding,KONG Juan*

(Department of Clinical Nutrition，Shengjing Hospital of China Medical University，Shenyang 110004，China)

Objective To study the protective effect of active vitamin D analogue on cytokines in kidney of mice with endotoxin infection.Methods Twenty C57 BL/6 mice were randomly divided into four groups:normal control group (CON group),paricalcitol group (P group),lipopolysaccharide group (LPS group),and paricalcitol+lipopolysaccharide group (P+LPS group).The general status was compared,the levels of serum creatinine in the kidneys were measured by ELISA kit,and the levels of cytokines in the kidneys were determined by real-time PCR methods in the four groups.Results The general state of P+LPS group was better than that of LPS group.There was no significant difference in renal morphology and serum creatinine level between the two groups.The expression of IL-1β,ICAM,TNF-α and INF-γ in renal tissue of P+LPS group was significantly lower than that of LPS group (P<0.05).Conclusion Active vitamin D analogues can significantly reduce the levels of IL-1β,ICAM,TNF-α and INF-γ in renal tissue of mice induced by LPS,reduce inflammatory cytokine-mediated kidney damage,and protect the kidney function.

Active vitamin D analogues;LPS;Cytokines

2016-10-17

中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院臨床營養(yǎng)科，沈陽 110004

國家自然科學(xué)基金(81570811)；遼寧省攀登學(xué)者計劃；遼寧省十百千計劃

10.14053/j.cnki.ppcr.201703002

*通信作者