喬麟軼，暢志堅，張曉軍，劉靜，朱艷，詹海仙，郭慧娟，李欣*

(1.山西大學 生命科學學院, 山西 太原 030006; 2.山西省農業(yè)科學院 作物科學研究所 / 作物遺傳與分子改良山西省重點實驗室,山西 太原0300311; 3.山西大學 生物工程學院, 山西 太原 030006)

烏拉爾圖小麥全基因組NBS-SSR位點分析及標記開發(fā)

喬麟軼1,2，暢志堅2，張曉軍2，劉靜3，朱艷3，詹海仙2，郭慧娟2，李欣2*

(1.山西大學 生命科學學院, 山西 太原 030006; 2.山西省農業(yè)科學院 作物科學研究所 / 作物遺傳與分子改良山西省重點實驗室,山西 太原0300311; 3.山西大學 生物工程學院, 山西 太原 030006)

[目的]本研究旨在診斷烏拉爾圖小麥NBS家族所在基因組序列的SSR位點，并為抗源的發(fā)掘和利用開發(fā)分子標記。[方法]利用NBS隱馬模型文件檢索數(shù)據(jù)庫獲得目標序列，通過軟件診斷序列SSR位點并開發(fā)標記，利用烏拉爾圖小麥抗白粉病材料UR207和感病材料UR203進行標記驗證。[結果]本研究從烏拉爾圖小麥全基因組中分離出463個NBS基因，分為N、CN、NL和CNL共4類。從NBS所在scaffold序列上發(fā)現(xiàn)4 292個SSR位點，以二堿基重復位點最多，占78.1%。隨機開發(fā)了42個分布于各染色體臂的TuNBS-SSR標記，有12個標記在UR207和UR203間存在多態(tài)性。[結論]本研究從烏拉爾圖小麥全基因組中診斷出4 292個NBS-SSR位點，開發(fā)的12個標記在抗感材料間有多態(tài)性，可用于烏拉爾圖小麥材料抗病性鑒定和抗病基因篩選。

烏拉爾圖小麥； NBS類基因； SSR標記； 抗病

植物在生長過程中不斷面臨著真菌、細菌、病毒等病原體的侵襲，逐漸形成了一系列復雜的防御機制，尤其是植物抗病蛋白對病原體的特異性識別。目前從植物中分離出約100多個抗病蛋白，其中80%以上都屬于NBS (Nucleotide binding site) 家族。

NBS家族由約320個氨基酸組成，其結構域中高度保守的部分通過與ATP或GTP作用使蛋白構象發(fā)生變化，進而參與抗病信號的傳導[1]。NBS蛋白的C端通常由數(shù)量不等的LRR (leucine rich repeats) 結構域組成，其N端往往連接一個TIR (toll and interleukin-1 receptor) 結構或者是一個CC (coiled-coil) 結構域。TIR在對病原物的識別以及各自免疫系統(tǒng)的信號傳導中起重要作用，含有這類結構的TIR-NBS基因有N[2]、RPP1[3]等；而CC結構可通過其異亮氨酸的作用，促進蛋白質之間的特異相互作用，這類CC-NBS基因包括Pm3b[4]、Lr10[5]等。

烏拉爾圖小麥(Triticumurartu, 2n=14, AA)為野生一粒小麥，是四倍體和六倍體小麥A染色體組的祖先種，具有優(yōu)質、抗逆等優(yōu)異性狀，因經歷過基因擴張，比其他二級基因源的種屬以及近緣種屬含有更多的抗病基因[6]，對其NBS家族進行分離和研究對于普通小麥抗性改良具有重要意義。烏拉爾圖小麥測序草圖的公布[7]，使得從全基因水平揭示重要基因家族的功能成為可能。本研究采用生物信息學方法從烏拉爾圖小麥全基因組中分離了NBS家族序列，對NBS所在基因組序列上的SSR位點進行了診斷，并開發(fā)部分分子標記在2個烏拉爾圖小麥的白粉病抗感材料間進行了驗證。本研究結果為挖掘和利用烏拉爾圖小麥中的抗病基因資源及功能研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料

苗期抗性鑒定材料為烏拉爾圖小麥UR207和UR203，由中國農業(yè)科學院作物科學研究所賈繼增研究員惠贈?？剐澡b定所用白粉病菌株為 E09，由中國農業(yè)科學院植物保護研究所段霞瑜研究員惠贈。

1.2 苗期鑒定

將UR207、UR203和小麥對照材料臺長29各20粒分別播于紙杯內，待植株生長至一葉一心期時，用毛筆將白粉菌菌株E09的分生孢子輕掃至小麥葉片上，之后轉入人工培養(yǎng)箱，設溫度15～20 ℃，光照時間 12～14 h。在7～10 d后當感病對照臺長29充分發(fā)病時, 采用0～4級標準調查材料第1片葉的反應型[8]。

1.3 序列的分離和檢測

從GIGA數(shù)據(jù)庫(http://gigadb.org/)中下載烏拉爾圖全基因組數(shù)據(jù)建立本地BLAST數(shù)據(jù)庫，利用NBS隱馬模型文件 (Pfam登錄號:PF00931)檢索本地數(shù)據(jù)庫。利用SMART工具對檢索結果進行結構域的檢查。

1.4 SSR位點診斷和引物設計

利用SSRhurnter軟件查找NBS所在scaffold序列的SSR位點。查找SSR的設定為：每重復單元堿基數(shù)為2～5，重復次數(shù)≥5。利用Primer5軟件對SSR位點設計引物，由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.5 標記檢測

采用 SDS法[9]提取基因組總DNA。PCR總體系為15 μL，含1.5 μL 10×buffer (TaKaRa)、0.2 mmol·L-1dNTP、1 U Taq酶(TaKaRa)、0.25 μmol·L-1引物和100 ng模板DNA。反應擴增程序為94 ℃變性5 min；94 ℃變性45 s，58 ℃復性45 s，72 ℃延伸1 min，36個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴增產物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，硝酸銀染色后觀察照相。

2 結果與分析

2.1 烏拉爾圖小麥NBS序列的分布及分類

從本地烏拉爾圖小麥數(shù)據(jù)庫中篩選出463條完整蛋白序列，根據(jù)染色體位置信息將其定位于烏拉爾圖小麥的1A～7A染色體上，分布數(shù)目依次為81、77、55、69、45、39和97，其中7A染色體上分布的NBS序列最多， 6A染色體上分布最少。檢索出的463條蛋白序列均包含NBS保守結構域，根據(jù)其C端和N端是否包含其他結構域，將NBS序列分為CC-NBS-LRR、NBS-LRR、CC-NBS和NBS共4類(表1)。

2.2 TuNBS-SSR位點診斷及標記開發(fā)

查找TuNBS所在scaffold序列的SSR位點，在365條scaffold序列上共檢測到4 292個SSR位點，分布于1A～7A染色體，分布比例依次為15.6%、16.6%、9.4%、18.9%、9.2%、10.1%和20.2% (圖1A)。其中二堿基重復位點最多，占78.1%；五堿基重復位點最少，僅9個 (圖1B)。

表1 烏拉爾圖小麥TuNBS序列的結構分類

Table 1 Structural classification of TuNBS protein sequences

在每條染色體的長短臂上分別隨機取3個位點，根據(jù)這些SSR位點的側翼序列設計引物，共開發(fā)TuNBS-SSR標記42對(表2)。

圖1 烏拉爾圖小麥全基因組NBS-SSR位點診斷Fig.1 The genome-wide diagnosis of NBS-related SSR loci in T. urartu

表2 42對烏拉爾圖小麥NBS-SSR標記

表2(續(xù))

2.3 TuNBS-SSR標記驗證

在對照材料臺長29發(fā)病級別達4級時，鑒定烏拉爾圖小麥UR207和UR203的抗性。結果顯示UR207對白粉菌小種E09表現(xiàn)為近免疫(IT=0)，UR203表現(xiàn)為感病(IT=4)。將開發(fā)的42個TuNBS-SSR標記擴增UR207和UR203的DNA，有12個標記在群體間表現(xiàn)出多態(tài)性 (圖2)。

圖2 TuNBS-SSR位點驗證Fig.2 Diagnosis of NBS-related SSR loci in T. urartu 注：圖中箭頭所指為差異條帶.Note: The arrows in the figure refer to differential electrophoretic bands.

3 討論

隨著測序技術的不斷提高，許多植物全基因組中的NBS基因數(shù)目及種類已確定。如擬南芥149個[10]，高粱211個[11]，大豆319個[12]、大麥420個[13]，水稻535個[14]等。本研究從烏拉爾圖小麥中篩選出463個NBS基因。與大麥NBS基因數(shù)目最為接近，與水稻次之，這可能是由于烏拉爾圖小麥與大麥和水稻的親緣關系較其他物種更近，三者基因組經歷了較為相似的進化過程，最終形成了成員數(shù)目相當?shù)腘BS家族。另外已有研究表明植物界TIR-NBS起源較早，但在陸生植物中TIR結構開始缺失，進化至單子葉植物中大幅度減少，因此目前大部分單子葉植物的NBS蛋白不包含TIR結構[15]。本研究從烏拉爾圖小麥基因組中分離的均為non-TIR-NBS蛋白，這與高粱、大麥等單子葉植物結果一致。

本研究分離的全基因組TuNBS為烏拉爾圖小麥抗病基因的篩選構建了一個候選序列庫，也為小麥抗病育種中廣泛發(fā)掘外源抗病基因提供了參考。我們還從TuNBS所在的基因組序列上診斷出4 292個SSR位點，并隨機合成42個標記對抗感材料進行擴增，其中有12個標記表現(xiàn)出多態(tài)性。因此我們預計可開發(fā)出1 000余個具有豐富多態(tài)性的NBS-SSR標記，這些標記可用于烏拉爾圖小麥基因組或小麥A基因組的分子圖譜構建和抗病基因定位研究中。另外，本研究開發(fā)的每個SSR標記均與TuNBS序列位于同一條scaffold序列上，可作為抗病基因的共分離標記使用，適合用于抗病育種過程中的分子標記輔助選擇。

4 結論

從烏拉爾圖小麥基因組中分離出463條NBS序列，包含N、CN、NL和CNL共4類結構，從NBS所在基因組序列中診斷出4 292個NBS-SSR位點，隨機開發(fā)了42個分布于各染色體的標記，其中有12個標記在抗感材料間有多態(tài)性，可用于烏拉爾圖小麥材料抗病性鑒定和抗病基因篩選。

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(編輯：邢國芳)

Genome-wide analysis and marker development of NBS-SSR inTriticumurartu

Qiao Linyi1,2, Chang Zhijian2, Zhang Xiaojun2, Liu Jing3, Zhu Yan3, Zhan Haixian2, Guo Huijuan2, Li Xin2*

(1.CollegeofLifeScience,ShanxiUniversity,Taiyuan030006,China; 2.InstituteofCropScience,ShanxiAcademyofAgriculturalSciences/ShanxiKeyLaboratoryofCropGeneticsandMolecularImprovement,Taiyuan030031,China; 3.CollegeofBiologicalEngineering,ShanxiUniversity,Taiyuan030006,China)

[Objective]The aim of this study was to diagnose the SSR loci on genome sequences of the NBS family inTriticumurartuand to develop molecular markers for the exploitation and utilization of this resistance resources. [Method]In this paper, the target sequences were getted by searching the database using NBS HMM, and molecular markers were developed based on the SSR loci diagnosed by software, then the markers were verificated by twoT.urartumaterials which resistant(UR207) and susceptible(UR203) to theBlumeriagraministritici, respectively. [Results]463 NBS genes, which can be divided into four categories containing N, CN, NL and CNL, were separated from theT.urartugenome. 4 292 SSR loci were found on the scaffold sequences with NBS and of which the dinucleotide repeat loci is most, accounting for 78.1%. 42 TuNBS-SSR markers distributing in the each chromosome arm were developed randomly and 12 markers showed polymorphism between UR207 and UR203.[Conclusion]4 292 NBS-SSR loci were diagnosed fromT.urartugenome and 12 markers exhibited polymorphism between resistant and susceptible materials. The results can be used for the identification of disease resistance and the screening of resistance genes ofT.urartu.

Turartu， NBS-encoding genes， SSR markers， Disease resistance

2016-08-25

2016-12-07

喬麟軼 (1988-)，男(漢)，山西晉中人，博士研究生，研究方向：小麥抗病

*通信作者：李欣，副研究員，Tel:18635101299, E-mail:saaslixin@126.com

國家自然科學青年基金項目(31601303), 山西省青年基金項目(2015021145), 山西省農業(yè)攻關項目(20150311001-1), 山西省農科院攻關項目(15YGG01, YGG1602)

S435.121

A

1671-8151(2017)03-0153-05