馬 源，馬暉玲，劉興菊

(甘肅農業(yè)大學草業(yè)學院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室/甘肅省草業(yè)工程實驗室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

2R,3R-丁二醇和2,3-丁二醇誘導匍匐翦股穎抗病性的比較

馬 源，馬暉玲，劉興菊

(甘肅農業(yè)大學草業(yè)學院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室/甘肅省草業(yè)工程實驗室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

以2R,3R-丁二醇和2,3-丁二醇作為誘抗劑，在誘導匍匐翦股穎產(chǎn)生對褐斑病抗性的過程中，重點比較了不同施用方式的誘抗效果，篩選出了誘抗劑的最佳作用方式和濃度。結果表明：匍匐翦股穎接菌后第15 d，2R,3R-丁二醇根部注射處理下，100 μmol/L的病情指數(shù)最低，誘導效果最佳；而與葉面噴施相比，葉面噴施的誘導效果不明顯；2,3-丁二醇根部注射處理下，250 μmol/L的病情指數(shù)最低，誘導效果最佳，而與葉面噴施相比，葉面噴施的誘導效果不明顯。結果表明，100 μmol/L的2R,3R-丁二醇與250 μmol/L的2,3-丁二醇根部注射可有效誘導匍匐翦股穎產(chǎn)生對褐斑病的抗性。

匍匐翦股穎；2R,3R-丁二醇；2,3-丁二醇；褐斑病

匍匐翦股穎(Agrostisstolonifera)為禾本科翦股穎屬多年生草本植物，葉片質地柔軟纖細，耐低修剪，廣泛建植于高爾夫球、保齡球場等場地。但匍匐翦股穎的抗病性較差，容易感染幣斑病、條黑粉病、褐斑病等[1]，嚴重影響草坪功能的發(fā)揮并給草坪生產(chǎn)和經(jīng)營帶來極大損失。通過抗病誘導方式找到適當?shù)恼T導因子將其潛能激發(fā)出來，就可以抵御各種病害。其中，化學抗劑可抗菌譜廣，對環(huán)境安全，不易產(chǎn)生抗藥性，作用時間長，且抗病性誘導劑用量少，防治效果好，是一種具有廣泛應用前景的新型植物病害防治劑[2-3]。

目前，誘導植物抗病性的機制有兩種形式，系統(tǒng)獲得抗性(SAR)，誘導系統(tǒng)抗性(ISR)。SAR可以被一些植物激發(fā)子激活進而誘導植物抗病，這些激活物可以在植株體局部誘導抗病性反應繼而這種反應如信號一般傳遍植株體各個部位，使得整個植株系統(tǒng)地獲得抗病性，這種反應信號的傳導是一種短距離的傳遞，通常以葉面噴施為主。而ISR往往由土壤根際的植物促生菌(PGPR)所激活，這類信號分子是乙烯(ET)和茉莉酸(JA)等[4]，通常為根部注射。2003年Suzuki等[5]在匍匐翦股穎的抗病誘導研究中發(fā)現(xiàn)Pseudomonasfluorescens株系HP72可引發(fā)匍匐翦股穎對立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)產(chǎn)生抗性[5]。2004年Ryu等[6]研究認為，植物根際促生菌分泌的揮發(fā)性有機物2,3-butanediol及其同分異構體在誘導植物產(chǎn)生抗病性的過程中具有重要的作用[6]。2010年，加拿大學者Cortes-Barco和Hsiang等[7-9]報道了BDO和PC1(異鏈烷烴混合物)以ISR方式根部施入植株體后可抑制分別由真菌Sclerotiniahomoeocarpa,Rhizoctoniasolani和Microdochiumnivale導致的3種草坪葉病，施入PC1或BDO可減少匍匐翦股穎葉病區(qū)域20%～40%。

試驗采用新型誘導劑丁二醇的2種同分異構體2R,3R-丁二醇(2R,3R-BD)與2,3-丁二醇(2,3-BD)，通過葉面噴施和根部注射處理匍匐翦股穎，觀察比較了2種不同施用方式下的誘抗效果，尋找丁二醇誘導匍匐翦股穎抗褐斑病的最佳誘導劑濃度和施用方式，以期為丁二醇誘導其他植物抗多種病害的作用方式提供研究基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試匍匐翦股穎品種為Penn-A4，由北京克勞沃公司提供。誘導劑2R,3R-BD購自Sigma，2,3-BD購自西亞試劑。匍匐翦股穎褐斑病病原物為立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)，購自中國科學院菌種保存中心。

1.2 試驗設計

營養(yǎng)土∶沙∶蛭石以2∶1∶1混合，種植前經(jīng)高溫、高壓滅菌后，裝于花盆中播種翦股穎種子，并置于一定溫濕度條件的溫箱中，植株生長8 d后用丁二醇處理，誘導7 d后接種立枯絲核菌。240 mL組培瓶中裝60 mL試驗土，加入20 mL蒸餾水，使沙土中的含水量控制在17%。

1.2.1 種植 種植前處理種子用無菌水浸泡6 h，用70%乙醇溶液浸泡1 min，無菌水沖洗2次，20%次氯酸鈉浸泡15 min，無菌水沖洗5～6次，種植于240 mL的組培瓶，每瓶0.3 g。培養(yǎng)在25℃的恒溫培養(yǎng)箱中。

1.2.2 種植前誘導劑與菌種間的關系 PDA培養(yǎng)基制作中加入不同濃度梯度的2R,3R-BD和2，3-BD，并接種立枯絲核菌，觀察培養(yǎng)基中菌種的發(fā)病情況，發(fā)現(xiàn)2種誘導劑對立枯絲核菌在離體培養(yǎng)條件下沒有抑制效果，在試驗過程中無影響。

1.2.3 種植后誘導和接種 2R,3R-BD以50、75、100、125、150 μmol/L(以C1，C2，C3，C4，C5表示)分別設5個濃度梯度，2，3 -BD設150、250、350、450、550 μmol/L 5個濃度(以D1，D2，D3，D4，D5表示),不用誘導劑處理只接種為CK。植物在恒溫箱中正常生長8 d后，以2種誘導劑處理植株并且保證誘導環(huán)境中無其他雜菌以防污染，每個處理3個重復。將不同濃度丁二醇分別用注射器注射和葉面噴施的方式施用到匍匐翦股穎上，每瓶根部注射10 mL，葉面噴施8 mL。用封口膜封住瓶口。丁二醇處理幼苗后第7 d后接種病原菌。立枯絲核菌在PDA固體培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)4 d后，用滅菌的打孔器取6 mm直徑菌絲塊，加入到PDB液體培養(yǎng)基，在25℃、100 r/min的搖床培養(yǎng)5 d后研磨為菌絲，確定濃度為D340=0.8，使用該濃度菌絲懸浮液噴霧法接種。

1.3 匍匐翦股穎褐斑病發(fā)病程度基本標準

接菌種后第7，10和15 d，參照文獻[10]的調查與評定方法，進行病情觀察，統(tǒng)計病葉率并計算病情指數(shù)。匍匐翦股穎褐斑病嚴重度的分級標準：0級：無癥狀；1級：葉片上有零星菌絲；2級：10%～40%的葉片上有菌絲；3級：40%～60%的葉片上有菌絲體生長并有壞死跡象；4級：60%～80%的葉片上有豐富的菌絲體和壞死現(xiàn)象；5級：全部植株普遍感病。

1.4 數(shù)據(jù)分析方法

運用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，運用Excel進行圖表制作。

2 結果與分析

2.1 不同濃度2R,3R-BD根部注射對匍匐翦股穎發(fā)病程度的影響

接種病原菌后隨時間延長，對照與各濃度的病情指數(shù)均呈上升趨勢，一定濃度的2R,3R-BD根部注射可明顯降低匍匐翦股穎褐斑病病情指數(shù)(圖1)。接種第7 d后，發(fā)病不明顯，各處理間差異不顯著。接種后第10 d，各濃度的病情指數(shù)顯著低于CK，而且C3的病情指數(shù)最低，為1.6%。在第15 d C3的病情指數(shù)顯著低于CK，C3的病情指數(shù)最低，為27.2%，CK的病情指數(shù)是其3.34倍。結果表明C3濃度的2R,3R-BD根部注射可明顯降低匍匐翦股穎褐斑病的病情指數(shù)。

2.2 不同濃度2,3-BD根部注射對匍匐翦股穎發(fā)病程度的影響

接種病原菌后第15 d可明顯觀察到，一定濃度的2,3-BD根部注射可有效降低匍匐翦股穎褐斑病的病情指數(shù)(圖1)。接種后第7 d各處理間差異不顯著。接種后第10 d，除D5外其他濃度的病情指數(shù)都顯著低于CK，并且D2的病情指數(shù)顯著低于其他處理。在第15 d，除D5以外，其他濃度的病情指數(shù)顯著低于CK，同時D2的病情指數(shù)顯著低于其他處理。表明2,3-BD的D2濃度最適宜，誘導效果最為明顯，根部注射可有效降低匍匐剪股穎褐斑病的病情指數(shù)。

2.3 不同濃度2R,3R-BD葉面噴施對匍匐翦股穎病情指數(shù)的影響

接種病原菌后各處理的病情指數(shù)呈明顯上升趨勢,2R，3R-BD葉部噴施后誘導匍匐翦股穎抗褐斑病效果不明顯(圖2)。接種后第7 d，各處理差異不顯著。接種后第10 d，C5病情指數(shù)最高，其他處理差異不顯著。在接種后第15 d，C3、C4的病情指數(shù)顯著低于其他處理，分別達到67.47%、69.87%。因此,葉面噴施2R,3R-BD的C3、C4可在一定程度降低匍匐剪股穎褐斑病的病情指數(shù)，但效果不明顯。

圖1 不同濃度2R,3R-BD和2.3-BD根部注射處理下匍匐翦股穎的病情指數(shù)Fig.1 The disease index of roots injection treatment at different concentrations of 2R,3R-BD and 2,3-BD

圖2 不同濃度2R,3R-BD和2,3-BD葉面噴施處理下匍匐翦股穎的病情指數(shù)Fig.2 The disease index of foliage spray treatment at different concentrations of 2R,3R-BD and 2,3-BD

2.4 不同濃度2,3-BD葉面噴施對匍匐翦股穎病情指數(shù)的影響

接種病原菌后結果表明，2,3-BD葉部噴施誘導匍匐翦股穎抗褐斑病的效果不明顯(圖2)。接種后第7 d，各處理差異不顯著。接種后第10 d，D4、D5的病情指數(shù)低于其他處理，并且其他各處理差異不顯著。而接種后第15 d，D2、D3的病情指數(shù)低于其他處理，但其病情指數(shù)已分別達68.8%、70.4%。試驗表明葉面噴施2,3-BD對降低匍匐翦股穎褐斑病的病情指數(shù)效果不明顯。

2.5 兩種丁二醇在不同時間不同作用方式下對匍匐翦股穎病情指數(shù)的影響

通過比較發(fā)現(xiàn)，兩種誘導劑在進行根部注射時效果最好(圖3)。第7 d時通過根部注射的兩種誘導劑其病情指數(shù)分別為0.3%和0.5%，與葉面噴施的5%和6%相比，根部注射的效果最好而且差異極顯著。第10 d根部注射最低的病情指數(shù)分別為1.6%和1.07%，效果比葉面噴施的最低病情指數(shù)分別降低了11倍和10倍，抗病效果極顯著。第15 d使用2種最佳濃度誘導劑，葉面噴施下其病情指數(shù)為67%和68%，是根部注射后其病情指數(shù)35%的2倍和21%的 3倍。因此，通過比較發(fā)現(xiàn)根部注射的作用效果明顯優(yōu)于葉面噴施的作用效果。所以最佳的作用方式是根部注射。

2.6 不同濃度丁二醇對植株發(fā)病的誘導效果影響

2,3-BD與2R,3R-BD分別設置不同濃度，根部注射和葉面噴施處理匍匐翦股穎，接種后第15 d的誘導效果表明，2,3-BD 的D2與2R,3R-BD的C3濃度根部注射，都能誘導匍匐翦股穎抗褐斑病，誘導效果分別為86.07%、70.32%。葉面噴施2R,3R-BD，C3、C4兩個濃度雖然有一定誘導作用，但誘導效果分別為25.9%、23.2%，與根部注射相比較其作用效果不明顯，表明根部注射是2R,3R-BD的有效作用方式。葉面噴施2,3-BD后，D2和D3的誘導效果分別為18.8%、16.9%，誘導效果不明顯，因此，2,3-BD的有效作用方式是根部注射(表1)。

圖3 兩種丁二醇在不同時間不同作用方式處理下匍匐翦股穎的病情指數(shù)Fig.3 The disease index of roots injection treatment at different concentrations of 2R,3R-BD and 2,3-BD

3 討論

防治植物病害的主要措施是化學防治，除造成經(jīng)濟損失外，有些殺菌劑還對人類和環(huán)境造成極大傷害。開發(fā)綠色環(huán)保的生物農藥顯得尤為重要，植物抗病誘導劑的有效成分屬天然產(chǎn)物，誘導植物發(fā)揮自身抗病潛力，是草坪病害防治的新方法。同時誘導劑的不同使用濃度對不同植物病害的防治效果差異顯著[11-17]。

表1 2,3-BD與2R,3R-BD 不同使用方式對匍匐翦股穎抗病性的誘導效果

注：縱列字母不同者表示差異顯著(P<0.05)

2,3-丁二醇存在3種同分異構體,現(xiàn)有研究表明，2,3-butanediol的左旋體2R,3R-BD可以誘導煙草抗E.carotovorasubsp.carotovoraSCC1，但不能夠對P.syringaepv.tabaci產(chǎn)生抗性,其右旋體2S,3S -BD則對植物體沒有作用[18-19]。ChoongChoong -Min Min研究認為 2,3-butanediol的外消旋體(2R,3R -BD與2S,3S -BD的混合物)可誘導擬南芥產(chǎn)生ISR。研究結果表明 2,3-butanediol立體異構的混合物與其左旋2R,3R -BD能夠有效誘導匍匐翦股穎產(chǎn)生抗病性。綜上所述,2,3-butanediol及其同分異構體誘導不同植物對多種病原菌產(chǎn)生抗性存在個體差異性。

Song等[12]使用2R,3R-BD誘導煙草的ISR，設置100 pg/株～1 mg/株不同劑量，結果表明2R,3R-BD的劑量為100 μg/株時抵抗由E.carotovora引起的軟腐病效果最佳，當劑量小于10 pg/株時不能誘導煙草產(chǎn)生ISR。Cortes-Barco等[17]的研究表明，100 μmol/L的2R,3R-BD可誘導本氏煙草抗由C.orbiculare引起的炭疽病，葉面害積降低引起的炭疽病，葉面害積降低77%。以上結果表明微量濃度的2,3-BD及其同分異構體能夠誘導植物產(chǎn)生ISR[18-20]。

4 結論

(1)一定濃度誘導劑處理能夠有效降低匍匐翦股穎褐斑病的病情指數(shù)，2,3-BD與2R,3R-BD能夠誘導匍匐翦股穎對褐斑病產(chǎn)生抗性。采用兩種丁二醇2R,3R-BD、2,3-BD分別通過根部注射和葉部噴施作用方式，都能誘導匍匐翦股穎對褐斑病產(chǎn)生抗性。同時誘導劑的不同使用濃度對不同植物病害的防治效果差異顯著。而在2R,3R-BD根部注射的5個濃度中100 μmol/L在接種后第15 d病情指數(shù)最低，為27.2%，誘導效果為70.32%，誘導效果最佳，可誘導匍匐翦股穎對褐斑病產(chǎn)生抗性。而2R,3R-BD葉面噴施后，100 μmol/L、125 μmol/L 2個濃度雖有一定誘導作用，但誘導效果分別僅為25.9%、23.2%，與根部注射相比誘導效果不明顯。試驗表明，2R,3R-BD誘導匍匐翦股穎產(chǎn)生褐斑病的最佳作用方式是根部注射。

(2)2,3-BD和2R,3R-BD兩種誘導劑葉面噴施與根部注射相比誘導效果不明顯，試驗表明，兩種誘導劑誘導匍匐翦股穎產(chǎn)生褐斑病的最佳作用方式是根部注射。通過根部注射的抗病性誘導效果比葉面噴施好得多，再次證實了BDO誘導匍匐翦股穎的抗病性是依ISR作用方式進行的。

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Comparisons on 2R,3R-butanediol and 2,3-butanediol induced disease resistance of creeping bentgrass

MA Yuan，MA Hui-ling，LIU Xing-ju

(CollegeofPrataculturalScience,GansuAgriculturalUniversity/KeyLaboratoryofGrasslandEcosystem，MinistryofEducation/PrataculturalEngineeringLaboratoryofGansuProvince/Sino-U.S.CentersforGrazinglandEcosystemSustainability,Lanzhou730070,China)

2,3-butanediol and 2R,3R-butanediol were used as revulsants to induce the resistance of bentgrass to brown spot,and the optimum treatment method and concentration were studied.The results showed that the disease index of creeping bentgrass injected with 2R,3R-BD at 100 mol/L and 2,3-BD at 250 mol/L after15 days inoculation was the lowest.The effect of foliage application on induced disease resistance was not obvious.

creeping bentgrass；2R,3R-butanediol;2,3-butanediol ;brown spot

2015-10-22；

2016-06-03

國家自然科學基金“丁二醇誘導匍匐翦股穎抗病性及其ISR機理研究”(31360583)資助

馬源(1989-)，男，甘肅嘉峪關人，在讀碩士研究生。 E-mail：mayuan608@163.com 馬暉玲為通訊作者。

S 543；S 482.8

A

1009-5500(2017)01-0079-06