石長(zhǎng)青，侯 芳，王連群*，陳 榮，劉俊峰，王惠娥，王 永

（1.塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300）

埋植褪黑激素對(duì)非繁殖季節(jié)和田羊胚胎移植效果的影響

石長(zhǎng)青1，2，侯 芳2，王連群1，2*，陳 榮1，2，劉俊峰1，2，王惠娥1，2，王 永1，2

（1.塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300）

為了探究外源性褪黑激素對(duì)非繁殖季節(jié)和田羊胚胎移植效果的影響，采取隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)試驗(yàn)，選擇30只和田羊成年母羊隨機(jī)分為6組 （供體羊和受體羊各3組），5只和田羊成年公羊單獨(dú)為1組做為配種公羊，分別給予3組供體羊和3組受體羊褪黑激素埋植、孕激素海綿栓結(jié)合促性腺激素、褪黑激素埋植結(jié)合孕激素海綿栓和促性腺激素處理。結(jié)果表明：褪黑激素埋植結(jié)合孕激素海綿栓和促性腺激素處理顯著提高了非繁殖季節(jié)和田羊母羊的排卵率（P＞0.05），單純埋植褪黑激素并未提高非繁殖季節(jié)和田羊母羊的排卵率。說(shuō)明外源性的褪黑激素能夠協(xié)同孕激素海綿栓和促性腺激素處理促進(jìn)非繁殖季節(jié)和田羊母羊的排卵。

褪黑激素；埋植；非繁殖季節(jié)；和田羊；胚胎移植

10.16863/j.cnki.1003-6377.2017.01.007

現(xiàn)階段，羊的同期發(fā)情及胚胎移植較為廣泛使用的方法是孕酮陰道海綿栓結(jié)合馬絨毛膜促性腺激素（eCG,equine chorionic gonadotropin）的處理方法[1]，其效果也得到了證實(shí)[2]。僅有少量的研究比較了褪黑激素與孕激素海綿栓結(jié)合促性腺激素對(duì)綿羊繁殖調(diào)控效果的影響[3]。本研究在非繁殖季節(jié)，對(duì)和田羊母羊進(jìn)行褪黑激素埋植、孕激素海綿栓結(jié)合促性腺激素、褪黑激素埋植結(jié)合孕激素海綿栓和促性腺激素處理，以胚胎移植的方式，研究褪黑激素對(duì)母羊排卵率和受胎率的影響，比較三種誘導(dǎo)母羊繁殖方法的效果。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

選取2～3歲、體質(zhì)健壯、體重一致、膘情適中、健康無(wú)?。o(wú)繁殖性疾病、遺傳性疾病、傳染性疾?。┑目諔押吞镅虺赡昴秆?0只。與配公羊選取2～3歲、體質(zhì)強(qiáng)壯、精力旺盛、繁殖機(jī)能良好且有自然交配史的和田羊成年公羊5只。

1.2 主要藥品器械

MLT埋植顆粒（10 mg/粒）、埋植器，促黃體生成素LH、促卵泡刺激素FSH、氯前列烯醇PG、陰道海綿栓（CIDR）、放栓器等，手術(shù)移植保定車、沖胚導(dǎo)管、移卵管、集卵杯、體視顯微鏡等。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在非繁殖季節(jié)，采用單因素完全隨機(jī)區(qū)組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，將30只和田羊母羊隨機(jī)分為6組（A組、B組、C組、D組、E組、F組），其中3組為供體羊組（A組、B組、C組），另外3組為受體羊（D組、E組、F組）。3組供體羊分別進(jìn)行褪黑激素埋植處理（A組）、褪黑激素埋植結(jié)合孕激素海綿栓和促性腺激素處理（B組）、孕激素海綿栓結(jié)合促性腺激素處理（C組）；同樣，相對(duì)應(yīng)的3組受體羊也分別進(jìn)行褪黑激素埋植處理（D組）、褪黑激素埋植結(jié)合孕激素海綿栓和促性腺激素處理（E組）、孕激素海綿栓結(jié)合促性腺激素處理（F組）。供體羊發(fā)情同期化和超排處理后，選擇已埋植褪黑激素處理的公羊5只進(jìn)行自然交配。配種后，進(jìn)行胚胎移植，對(duì)兩側(cè)卵巢的黃體數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)，并對(duì)胚胎質(zhì)量進(jìn)行觀測(cè)。在供體羊胚胎移植至受體羊過(guò)程中，保持對(duì)應(yīng)一致的同期化及超排方法，即：褪黑激素處理的供體羊的胚胎移植給褪黑激素處理的受體羊，褪黑激素埋植結(jié)合孕激素海綿栓和促性腺激素處理的供體羊的胚胎移植給褪黑激素埋植結(jié)合孕激素海綿栓和促性腺激素處理的受體羊，孕激素海綿栓結(jié)合促性腺激素處理的供體羊的胚胎移植給孕激素海綿栓結(jié)合促性腺激素處理的受體羊。胚胎移植完成后的35 d對(duì)受體羊進(jìn)行孕檢，確定移植后的存活胚胎數(shù)量。

1.4 試驗(yàn)處理

1.4.1 褪黑激素埋植

隨機(jī)選擇3組供體羊中的2組，于2014年6月1日在塔里木大學(xué)動(dòng)科院綜合試驗(yàn)站羊舍進(jìn)行褪黑激素埋植，埋植劑量為20 mg/只，3組受體羊中的2組及5只公羊在同一時(shí)間也做相同的褪黑激素埋植處理。

根據(jù)預(yù)定的試驗(yàn)處理，由助手保定好羊只，實(shí)施褪黑激素埋植者剪掉公羊頸背部耳根處的羊毛，用75%的醫(yī)用酒精消毒后，右手持裝入預(yù)定劑量褪黑激素緩釋劑的專用埋植器，左手提起公羊頸背部耳根處的皮膚呈空心三角形，將針頭與埋植位點(diǎn)成30°角刺入皮下，拇指按壓埋植器的活塞柄端，緩慢用力，由活塞推動(dòng)埋植器中預(yù)定劑量的褪黑激素緩釋劑注入頸背部耳根處，埋植完畢后迅速拔下埋植器及其針頭，用醫(yī)用酒精再次對(duì)埋植部位進(jìn)行消毒。

1.4.2 同期化、超排、配種處理

2014年6月20日隨機(jī)選擇已經(jīng)埋植褪黑激素2組供體羊中的1組進(jìn)行CIDR+FSH+LH+PG的發(fā)情同期化和超數(shù)排卵處理，未進(jìn)行褪黑激素埋植的供體羊組也進(jìn)行相同的CIDR+FSH+LH+PG的發(fā)情同期化和超數(shù)排卵處理。隨機(jī)選擇已經(jīng)埋植褪黑激素2組受體羊中的1組進(jìn)行CIDR+PG的繁殖生理同期化處理，未進(jìn)行褪黑激素埋植的受體羊組也進(jìn)行相同的CIDR+PG的繁殖生理同期化處理。撤栓后，由公羊試情確定母羊發(fā)情，用埋植褪黑激素的和田羊公羊與供體和田羊母羊進(jìn)行自然交配。具體胚胎移植程序見(jiàn)表1。

表1 供體羊和受體羊胚胎移植程序

1.4.3 胚胎移植

為了便于供體羊的胚胎采集和受體羊的胚胎移植，對(duì)所有母羊?qū)嵤┡咛ヒ浦残g(shù)前24 h斷食和12 h斷水處理，并將母羊乳房前腹中線手術(shù)部位的毛剪干凈。

供體羊通過(guò)靜松靈進(jìn)行麻醉處理（防治麻醉過(guò)度），待羊只進(jìn)入深度麻醉期后，置于手術(shù)臺(tái)上保定好，并在術(shù)處放置好創(chuàng)巾并夾好。用手術(shù)刀沿著羊只軀體的縱軸方向在術(shù)部切開(kāi)腹腔，并用止血鉗止住出血較多的毛細(xì)血管，最后將子宮角和卵巢拉出，記錄卵巢大小和黃體數(shù)目，用沖卵液通過(guò)三通式?jīng)_胚導(dǎo)管將胚胎從子宮沖進(jìn)集卵杯中，置于體視顯微鏡下進(jìn)行鏡檢，記錄回收的胚胎數(shù)量及發(fā)育情況。

受體羊的術(shù)前處理、麻醉和開(kāi)腹手術(shù)同供體羊，用移卵管將鏡檢優(yōu)選的2枚優(yōu)質(zhì)胚胎移植到受體羊子宮角內(nèi)（黃體發(fā)育較好側(cè)），多余胚胎回收液氮冷凍保存。

采集胚胎結(jié)束后，立即用高壓滅菌的生理鹽水和青霉素對(duì)供體羊子宮沖洗干凈，復(fù)位子宮和卵巢。涂抹碘酒于縫合切口及周圍，并用紗布敷上青霉素粉末，立即對(duì)術(shù)羊進(jìn)行80萬(wàn)IU青霉素和100萬(wàn)IU鏈霉素的肌注，并在其后的6 d內(nèi)進(jìn)行青霉素和鏈霉素的肌注，加強(qiáng)傷口及羊只的護(hù)理，防止創(chuàng)口感染。

1.4.4 孕檢

在胚胎移植后的35 d，通過(guò)B超對(duì)受體羊進(jìn)行孕檢，記錄受孕情況。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用Excel對(duì)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，用SPSS 22.0軟件對(duì)整理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用卡方（X2）檢驗(yàn)對(duì)百分?jǐn)?shù)進(jìn)行比較，用t檢驗(yàn)對(duì)平均數(shù)進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

從表2可以看出，B組供體羊黃體數(shù)顯著高于A組和C組供體羊（P＜0.05），A組和C組供體羊黃體數(shù)之間差異不顯著（P＞0.05）。雖然B組供體羊回收卵數(shù)和可用胚胎數(shù)均高于A組和C組供體羊，但是差異不顯著（P＞0.05）。同樣，供體羊的回收卵率和可用胚胎率在各處理組間均差異不顯著（P＞0.05）。D組和E組受體羊的受胎率高于F組，但各組受體羊的受胎率差異不顯著（P＞0.05）。

表2 埋植褪黑激素對(duì)和田羊母羊胚胎及受胎率的影響

3 討 論

光周期通過(guò)調(diào)節(jié)褪黑激素的分泌進(jìn)而調(diào)節(jié)性腺軸以實(shí)現(xiàn)對(duì)綿羊的繁殖季節(jié)的調(diào)控作用，因此人們很早就開(kāi)始利用外源性褪黑激素提前季節(jié)性發(fā)情繁殖羊的繁殖[4]。但是，外源性褪黑激素對(duì)非繁殖季節(jié)羊的胚胎移植方面的研究和應(yīng)用卻很少。

3.1 外源性褪黑激素對(duì)綿羊胚胎的影響

本研究通過(guò)褪黑激素埋植結(jié)合孕激素海綿栓和促性腺激素處理提高了非繁殖季節(jié)和田羊母羊的排卵率。但是，與孕激素海綿栓結(jié)合促性腺激素處理比較，單純埋植褪黑激素并未提高非繁殖季節(jié)和田羊母羊的排卵率。動(dòng)物在繁殖季節(jié)具有較高的排卵率，而在非繁殖季節(jié)和繁殖季節(jié)的開(kāi)始和結(jié)束排卵率較低。在休情期，孕酮會(huì)阻止LH峰，因而較早的終止了卵泡的發(fā)育和雌二醇的分泌[5]。通過(guò)褪黑激素埋植處理非繁殖季節(jié)的羊降低了雌激素對(duì)發(fā)情繁殖的負(fù)反饋調(diào)節(jié)效應(yīng)，從而獲得持續(xù)的LH脈沖和卵泡的充分發(fā)育生長(zhǎng)[6]，Viguié等研究表明，通過(guò)外源性褪黑激素處理母羊74 d后能夠顯著增加母羊的GnRH和LH的脈沖[7]。本研究埋植褪黑激素可能通過(guò)降低雌激素對(duì)發(fā)情繁殖的負(fù)反饋調(diào)節(jié)效應(yīng)和增加GnRH及LH的脈沖效應(yīng)增加了孕激素海綿栓和促性腺激素處理的發(fā)情排卵效應(yīng)。

關(guān)于單獨(dú)使用外源性褪黑激素對(duì)于排卵率的影響仍然存在爭(zhēng)議，有待于進(jìn)一步研究。Zarazaga等[8]研究表明埋植褪黑激素能夠增加排卵率，而對(duì)同期化母羊進(jìn)行褪黑激素處理的相關(guān)研究認(rèn)為：褪黑激素處理不是通過(guò)改變卵泡發(fā)生的周期而提高排卵率，而是通過(guò)減少中等大小和大的卵泡的閉鎖增加了排卵卵泡的數(shù)量[9]。然而，也有研究得出了相反的結(jié)論，無(wú)論是在繁殖季節(jié)[10]還是在非繁殖季節(jié)[11]進(jìn)行超數(shù)排卵時(shí)埋植褪黑激素均未明顯誘導(dǎo)排卵率的增加，這可能是少數(shù)FSH注射程序利用了所有卵泡相對(duì)獨(dú)立的閉鎖機(jī)制[10]。類似，無(wú)論是繁殖季節(jié)還是非繁殖季節(jié)，從屠宰羊的卵巢上分離得到的卵母細(xì)胞的數(shù)量和體外培養(yǎng)（IVM）的成熟率上都沒(méi)有差異[12]。Luther等研究表明非繁殖季節(jié)對(duì)母羊進(jìn)行褪黑激素埋植沒(méi)有增加卵母細(xì)胞的數(shù)量和體外培養(yǎng)成熟率[13]。Abecia等的研究表明褪黑激素對(duì)非繁殖季節(jié)或繁殖季節(jié)從綿羊的卵巢分離卵母細(xì)胞經(jīng)體外成熟培養(yǎng)沒(méi)有提高其成熟率[14]。Forcada等通過(guò)褪黑激素埋植結(jié)合孕激素海綿栓的方法使供體羊發(fā)情并通過(guò)公羊自然交配使之受孕，在發(fā)情配種后的7 d通過(guò)解剖采集胚胎，發(fā)現(xiàn)褪黑激素埋植（與對(duì)照組沒(méi)有埋植褪黑激素比較）能夠提高胚胎的質(zhì)量[11]。

3.2 外源性褪黑激素對(duì)綿羊受胎率的影響

本研究表明，埋植褪黑激素具有增加非繁殖季節(jié)受體母羊受胎率的趨勢(shì)，這一結(jié)果應(yīng)歸因于外源性的褪黑激素通過(guò)提高母羊黃體的功能或降低抗黃體溶解蛋白機(jī)制來(lái)提高胚胎的存活率，從而提高了受胎率。

反芻動(dòng)物妊娠的開(kāi)始和維持建立于胚胎對(duì)母體系統(tǒng)的信號(hào)，母體對(duì)妊娠的識(shí)別已經(jīng)被限定為早期妊娠期黃體的退化被阻止的過(guò)程。反芻動(dòng)物黃體溶解機(jī)制包括子宮內(nèi)膜產(chǎn)生的PGF2α和催產(chǎn)素的反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)。雌二醇和孕酮是子宮功能的主要調(diào)節(jié)物，二者通過(guò)他們的分子受體調(diào)節(jié)黃體溶解的時(shí)間[16]。另外，褪黑激素影響黃體對(duì)孕酮的分泌已經(jīng)在綿羊上得以報(bào)道[17]。有研究表明埋植褪黑激素進(jìn)行發(fā)情繁殖同期化的處理方法提高了受胎率從而提高繁殖力[15]，這一作用應(yīng)歸因于黃體功能的提高[18]、排卵率的增加[19]和較高的胚胎存活率[17]。Chemineau等研究發(fā)現(xiàn)，非繁殖季節(jié)進(jìn)行褪黑激素的處理能夠通過(guò)提高黃體的功能或降低抗黃體溶解蛋白機(jī)制而提高胚胎的存活率來(lái)提高產(chǎn)羔率[15]。Abecia等給三個(gè)品種羊（Rasa Aragonesa,Assaf,Merino）在產(chǎn)羔季節(jié)開(kāi)始時(shí)埋植MLT的研究進(jìn)一步表明：埋植褪黑激素提高了非繁殖季節(jié)母羊超數(shù)排卵胚胎存活率，明顯降低了不能夠成活的胚胎細(xì)胞（退化的細(xì)胞和生長(zhǎng)遲緩的細(xì)胞）的數(shù)量和比例[14]。Scott等研究表明，在配種后的45～90 d埋植緩釋褪黑激素表明自然繁殖季節(jié)外源性的褪黑激素能夠提高19%的窩產(chǎn)仔數(shù)[20]。Gómez等比較了埋植褪黑激素、孕激素海綿栓、埋植褪黑激素結(jié)合孕激素海綿栓這三種處理方法對(duì)乳用山羊產(chǎn)羔率的影響，結(jié)果表明這三種方法之間沒(méi)有顯著差異（P＞0.05）[2]。但是，McEvoy等的研究卻得出了相反的結(jié)論：無(wú)論給母羊是否進(jìn)行褪黑激素的處理，胚胎轉(zhuǎn)移、胚胎生存均沒(méi)有不同[10]。

本研究結(jié)果表明，褪黑激素埋植結(jié)合孕激素海綿栓和促性腺激素處理顯著提高了非繁殖季節(jié)和田羊母羊的排卵率。

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Effects of Melatonin Implants on Embryo Transfer of Hetian Sheep during the Non-breeding Seasons

SHI Chang-qing1,2,HOU Fang2,WANG Lian-qun1,2*,CHEN Rong1,2,LIU Jun-feng1,2, WANG Hui-e1,2,WANG Yong1,2
（1.College of Animal Sciences,Tarim University,Alar Xinjiang 843300,China; 2.Key Laboratory of Tarim Animal Husbandry Science and Technology,Xinjiang Production&Construction Corps,Alar Xinjiang 843300,China）

To explore the effect of exogenous melatonin on embryo transfer of Hetian Sheep during the nonbreeding seasons,taking a randomized block test，30 ewes and 5 rams were selected from Hetian sheep，5 rams separately asone breeding group，30 ewesdesigned averagely to six groupsrandomly,the estrus synchronization and superovulation of 3 group donors ewes and 3 grouprecipients ewes were administrated by melatonin implanted,progesterone sponge bolt combined with gonadotropins,melatonin implanted combined with progesterone sponge bolt and gonadotropins respectively.The results showed that the ovulation rate ofewes were increased significantly following melatonin implanted combined with progesterone sponge bolt and gonadotropins(P＞0.05)during the non-breeding seasons,the ovulation rate of ewes were not increasedonly following melatonin implanted during the non-breeding seasons.These results suggest that the ovulation of hetian sheep ewes were promoted by progesterone sponge suppository and gonadotropin treatment synergied exogenous melatonin during the non-breeding season.

melatonin;implants;non-breeding seasons;Hetian sheep;embryo transfer

S814.8

A

1003－6377（2017）01－0040-07

新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)重點(diǎn)領(lǐng)域科技攻關(guān)項(xiàng)目“非繁殖季節(jié)和田羊繁殖效率關(guān)鍵技術(shù)的研究與應(yīng)用”（2014BA010）

石長(zhǎng)青（1970-），男，碩士，副教授，從事動(dòng)物神經(jīng)內(nèi)分泌學(xué)研究。E-mail:scq926＠163.com

王連群（1977-），男，碩士，副教授，從事動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)研究。E-mail:wlq2005199＠126.com

2016-11-20

2016-11-24