(東北林業(yè)大學(xué)野生動物資源學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040)

貓免疫缺陷病毒的病毒載體研究進展

艾有為，王亞君，潘美喬，馬建章

(東北林業(yè)大學(xué)野生動物資源學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040)

Niels Pedersen等人于1987年在家貓體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了貓免疫缺陷病毒，并證實該病毒是貓艾滋病(AIDS)的病原。該病毒在形態(tài)學(xué)、Mg2+依賴的逆轉(zhuǎn)錄酶活性、在貓體內(nèi)的持續(xù)感染性以及基因組結(jié)構(gòu)等方面的特點，都與慢病毒極其相似，因此將之分為慢病毒的一員。由于該病毒引起貓科動物的免疫缺陷綜合征與人1型免疫缺陷病毒(HIV－1)引起的艾滋病的密切相關(guān)性，可以將貓作為研究HIV－1的動物模型。因此，貓免疫缺陷病毒(FIV)開始受到廣泛的關(guān)注［1］。

1 FIV基因組結(jié)構(gòu)

FIV基因組RNA由大約9 500個核糖核苷酸組成?；蚪M兩端為長末端重復(fù)序列(LTR)，長355 bp到361 bp，分成U3、R和U5這3個部分。同其他慢病毒一樣，F(xiàn)IV的3個主要開放閱讀框(ORF)，分別是gag、pol和env。gag基因長約1 350 bp，先翻譯形成大約50 kD的核心蛋白前體，隨后在病毒蛋白酶的作用下該蛋白前體被水解為基質(zhì)蛋白(MA)、衣殼蛋白(CA)和核衣殼蛋白(NA)。pol基因與gag基因的3'末端重疊109 bp，編碼病毒生命周期中需要的幾種酶。env基因編碼囊膜表面蛋白(SU)和穿膜蛋白(TM)。除了3個主要ORF外，F(xiàn)IV還含幾個類似HIV的小ORF，Vif、orf2和rev［2－3］。

2 FIV常見的兩種病毒載體

所謂病毒載體，是指利用分子克隆的方法將病毒基因連接到特殊的表達載體上，構(gòu)建的載體可以用于病毒拯救。即在載體的驅(qū)動下病毒基因獲得轉(zhuǎn)錄或翻譯等過程，一方面生成病毒遺傳物質(zhì)，另一方面翻譯病毒蛋白裝配成病毒。這是我們常說的反向遺傳操作技術(shù)。這種研究方法與經(jīng)典病毒學(xué)研究方法思路相反，能夠?qū)崿F(xiàn)從基因型到表型的研究。目前絕大部分FIV載體的構(gòu)建主要都是基于34TF10質(zhì)粒或以改造的34TF10為參照進行操作［4－5］。

常見的病毒載體分為病毒報告系統(tǒng)和基因治療系統(tǒng)兩種。為提供具有進入和整合能力的病毒又減少病毒部分的加入，同時攜帶外源基因的一套系統(tǒng)，這套系統(tǒng)往往由3個質(zhì)粒構(gòu)成:包裝質(zhì)粒提供病毒結(jié)構(gòu)蛋白、穿梭質(zhì)粒提供精簡的基因組以及修飾基因，還有一個表達廣嗜性細胞進入的囊膜蛋白VSV－G的質(zhì)粒，又稱為in trans載體系統(tǒng)［6］。

2．1 基因治療載體的構(gòu)建

C載體為包裝質(zhì)粒，為病毒提供蛋白結(jié)構(gòu)。D載體為穿梭質(zhì)粒，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物通過奇特的發(fā)卡結(jié)構(gòu)與gag蛋白相互作用包裝進病毒樣顆粒中，如圖1所示。

C載體將病毒LTR換成強活動性的CMV(人巨細胞病毒啟動子)使FIV病毒蛋白在人細胞中高效表達。在gag前端添加了一個常規(guī)的拼接捐贈位點(9 bp)，在pol和rev間選擇性插入拼接捐贈位點和拼接接受位點，使得rev蛋白的表達不受gag－pol多聚蛋白的干擾;病毒序列起始于gag的ATG，終止于rev的TAA。Rev兩個表達序列中間為RRE，調(diào)節(jié)病毒結(jié)構(gòu)蛋白的表達。在rev后具有poly(A)的尾巴的BGH結(jié)構(gòu)提供翻譯終止信號。

D載體中由R、U5及后續(xù)非編碼區(qū)和gag蛋白的前230 bp組成病毒基因的包裝信號，更換啟動子的時候，保留R、U5的部分而替換U3部分。在RRE和第二個啟動子間插入了cPPT－CTS(central DNA flap)，此區(qū)域不僅對反轉(zhuǎn)錄很重要，而且參與整合前復(fù)合物(PIC)的核輸入分裂或者非分裂細胞的過程。其中，gene1可以根據(jù)需要進行克隆或者替換，用于基因治療時常將eGFP換成需要修飾的基因，通過載體輸入目的細胞獲得表達。Gene2通常為一些抗性基因，用于建立穩(wěn)定表達細胞系的篩選。在gene1和gene2之間的小RNA病毒內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)的插入使得兩段基因同時獲得表達。

圖1 包裝質(zhì)粒和穿梭質(zhì)粒

具有包裝質(zhì)粒和穿梭質(zhì)粒后，還需要一個表達非慢病毒囊膜糖蛋白的質(zhì)粒VSV－G(水泡型口角炎病毒糖蛋白)提供病毒包膜構(gòu)成三質(zhì)粒系統(tǒng)。將C質(zhì)粒、D質(zhì)粒和囊膜表達質(zhì)粒按照3∶3∶1的比例用標(biāo)準的磷酸鈣法轉(zhuǎn)染293T細胞可以獲得大量的缺陷病毒的產(chǎn)生［9－10］。

2．2 病毒報告系統(tǒng)為了精細地分析病毒復(fù)制的特定生命過程(如進入、反轉(zhuǎn)錄、核輸入、整合、組裝、出芽等)，通常對全長基因組進行遺傳修飾的感染性分子克隆。通過對某個基因進行移碼突變或刪除獲得最小變化基因組與野生型基因組進行對比，分析變化基因的功能。FIV并沒有類似HIV－1系統(tǒng)中的區(qū)域供報告基因的插入，作者在刪除的env中進行了報告基因的插入。圖2中載體的骨架來源于34TF10，將U3替換成CMV，能夠在人的細胞中高效傳染和表達。該載體orfA中間有一個自然存在的預(yù)終止密碼，通過點突變使TGA變成TGG，得到orfA陽性版本。由于FIV env對感染非貓細胞的低效性，作者將env中間部分進行刪除并替換成報告基因(如eGFP)，同時提供一個外源VSV－G表達質(zhì)粒。為防止插入基因與env前端融合表達，在env前端插入一個2A表位，待env N端152個aa表達后斷裂，再表達報告基因。

圖2 報告病毒系統(tǒng)

3 貓免疫缺陷病毒載體的應(yīng)用

FIV可以感染家養(yǎng)貓在內(nèi)的多種貓科動物。國外對家養(yǎng)貓FIV流行情況調(diào)查發(fā)現(xiàn):健康貓群中，F(xiàn)IV的血清陽性率很低，大約為1%左右;患病貓群中陽性率很高，可以達到30%，有的地方甚至報道42%的陽性率。FIV感染過程中并沒有特異性臨床癥狀，但病毒在體內(nèi)復(fù)制的過程逐步地引起宿主免疫抑制，從而引起包括其他病毒、細菌、寄生蟲等在內(nèi)的機會感染。慢病毒的易變性導(dǎo)致疫苗研發(fā)非常困難，病毒攻擊免疫系統(tǒng)又繼發(fā)其他疾病而束手無策［11］。由于很難從發(fā)病動物體內(nèi)分離到慢病毒，同時FIV在培養(yǎng)的細胞系中很難產(chǎn)量化繁殖，而構(gòu)建病毒載體后通過細胞轉(zhuǎn)染能有效解決病毒來源的問題。隨著近些年先天免疫學(xué)的發(fā)展，人們已經(jīng)從宿主細胞內(nèi)定義出包括APOBEC3、Tetherin、SAMHD1以及MOV10等在內(nèi)的細胞內(nèi)抗病毒蛋白［12－14］。通過特定的功能在某一特定的過程對病毒進行攻擊，阻止病毒復(fù)制，控制病情發(fā)展。例如APOBEC3在病毒組裝的過程中包裝進入病毒粒子，在反轉(zhuǎn)錄時APOBEC3通過其胞嘧啶脫氨基酶活性將病毒cDNA中C(胞嘧啶)脫氨基轉(zhuǎn)變成U(尿嘧啶)，導(dǎo)致病毒基因降解或者翻譯出預(yù)終止蛋白［15］。而Tetherin則在病毒出芽的過程中通過細胞外功能區(qū)將病毒錨定于細胞膜，切斷病毒的傳播［16］。

多年的觀察和研究結(jié)果均表明，F(xiàn)IV能利用人細胞表面的趨化因子受體進入細胞，但并且不造成人體感染和患病。同時，由于慢病毒在進入細胞后通過自身編碼整合酶的催化活性作用下將前病毒DNA整合進宿主細胞進行基因修飾。例如，小孩遺傳性γ－鏈缺陷癥時，修飾后的細胞活力明顯強于非修飾細胞。同樣，慢病毒的基因治療對青光眼患者也有很好的效果。因此FIV作為載體對慢性疾病或遺傳缺陷病進行基因治療具有潛在的應(yīng)用價值。

在基因治療載體的研究中，最關(guān)鍵的幾個問題無非是:怎樣去除病毒蛋白的表達序列、怎樣去除病毒致病區(qū)而又要保證病毒基因的包裝、整合和驅(qū)使目的基因的表達。即在要能保證病毒成功的進入宿主基因組中的前提下去除對人體而言有害的、增加有益的成分［17］。但是要應(yīng)用于臨床還有很長的路要走。

［1］Bendinelli M，Pistello M，Lombardi S，et al．Feline immunodeficiency virus:an interesting model for AIDS studies，and an important cat pathogen［J］．Clin Microbiol Rev，1995，8:87-112．

［2］Kashiwase H，Katsube T，Kimura T，et al．8－Difluoromethoxy－4－quinolone derivatives as anti－feline immunodeficiency virus (FIV)agents:important structural features for inhibitory activity of FIV replication［J］．J Vet Med Sci，2000，62:499-504．

［3］Kenyon J C，Lever A M．The molecular biology of feline immunodeficiency virus(FIV)［J］．Viruses，2011，3:2192-2213．

［4］Talbott R L，Sparger E E，Lovelace K M，et al．Nucleotide sequence and genomic organization of feline immunodeficiency virus［J］．Proc Natl Acad Sci U S A，1989，86:5743-5747．

［5］Saenz D T，Poeschla E M．FIV:from lentivirus to lentivector［J］．J Gene Med，2004，6 Suppl 1:S95-104．

［6］Fadel H J，Saenz D T，Poeschla E M．Construction and testing of orfA+/－FIV reporter viruses［J］．Viruses，2012，4:184-198．

［7］Saenz D T，Barraza R，Loewen N，et al．Feline immunodeficiency virus－based lentiviral vectors［J］．Cold Spring Harb Protoc，2012 Jan(1):71-76．

［8］Saenz D T，Barraza R，Loewen N，et al．Titration of feline immunodeficiency virus－based lentiviral vector preparations［J］．Cold Spring Harb Protoc，2012 Jan(1):126-128．

［9］Saenz D T，Barraza R，Loewen N，et al．Production and harvest of feline immunodeficiency virus－based lentiviral vector from cells grown in T75 tissue－culture flasks［J］．Cold Spring Harb Protoc，2012 Jan(1):124-125．

［10］Saenz D T，Barraza R，Loewen N，et al．Production，harvest，and concentration of feline immunodeficiency virus－based lentiviral vector from cells grown in CF10 or CF2 devices［J］．Cold Spring Harb Protoc，2012 Jan(1):118-123．

［11］Hosie M J，Addie D，Belak S，et al．Feline immunodeficiency．ABCD guidelines on prevention and management［J］．J Feline Med Surg，2009，11:575-584．

［12］Zheng Y H，Jeang K T，Tokunaga K．Host restriction factors in retroviral infection:promises in virus－h(huán)ost interaction［J］．Retrovirology，2012，9:112．

［13］Ai Y，Ma J．Multiple lysines combined in HIV－1 Vif determines the responsiveness to CBF－beta［J］．Biochemical and biophysical research communications，2015，457:385-390．

［14］Ai Y，Zhu D，Wang C，et al．Core－binding factor subunit beta is not required for non－primate lentiviral Vif－mediated APOBEC3degradation［J］．Journalofvirology，2014，88: 12112-12122．

［15］Sheehy A M，Gaddis N C，Choi J D，et al．Isolation of a human gene that inhibits HIV－1 infection and is suppressed by the viral Vif protein［J］．Nature，2002，418:646-650．

［16］Neil S J，Zang T，Bieniasz P D．Tetherin inhibits retrovirus release and is antagonized by HIV－1 Vpu［J］．Nature，2008，451:425-430．

［17］Barraza R A，Poeschla E M．Human gene therapy vectors derived from feline lentiviruses［J］．Vet Immunol Immunopathol，2008，123:23-31．

Q782

A

0529-6005(2017)01-0065-02

2016－07－04

國家自然科學(xué)基金(313172209;L1322010);中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金資助(DLBCA05)

艾有為(1990－)，男，博士，從事慢病毒與宿主天然免疫相互作用研究工作，E－mail:18246194641@163．com

王亞君(1976－)，女，副教授，博士，從事野生動物疾病診斷和防治，E－mail:1402834602@qq．com

注:王亞君與艾有為對本文具有同等貢獻

馬建章，E－mail:350946335@qq．com