叢霞，曲明媚，王龍光，張東君，田文儒，李華濤

(1．青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東青島266109;2．山東省肥城市畜牧獸醫(yī)局，山東肥城271600)

熱應(yīng)激脂多糖谷氨酰胺誘導(dǎo)牛睪丸支持細(xì)胞HSP72時效表達(dá)

叢霞1，曲明媚1，王龍光1，張東君2，田文儒1，李華濤1

(1．青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東青島266109;2．山東省肥城市畜牧獸醫(yī)局，山東肥城271600)

為了探討溫和熱應(yīng)激、脂多糖(LPS)和谷氨酰胺(Gln)誘導(dǎo)牛睪丸支持細(xì)胞(bSCs)HSP72的時效表達(dá)規(guī)律，本試驗將傳至第3代bSCs分成熱應(yīng)激、LPS和Gln處理組，用CCK－8試劑盒檢測細(xì)胞活性，用RT－PCR和Western－Blot方法分別檢測處理后0、2、4、6、8、12、14h和16 h時細(xì)胞內(nèi)HSP72 mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，3種方式均能誘導(dǎo)HSP72表達(dá)，且HSP72蛋白分別在熱應(yīng)激、Gln和LPS預(yù)處理后2、4h和12 h時表達(dá)量最高。結(jié)果表明，熱應(yīng)激或Gln均比LPS誘導(dǎo)牛睪丸支持細(xì)胞HSP72表達(dá)的時間早，提示可考慮用Gln減少由LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。

牛睪丸支持細(xì)胞;HSP72時效表達(dá);脂多糖;谷氨酰胺;熱應(yīng)激

牛睪丸支持細(xì)胞(bSCs)可為包括精原干細(xì)胞在內(nèi)的各級生精細(xì)胞提供物理支架，對精子生成具有至關(guān)重要的作用。高溫環(huán)境、內(nèi)毒素、微生物、炎癥反應(yīng)及理化因素刺激都會使睪丸間質(zhì)細(xì)胞損傷，從而影響生精細(xì)胞的發(fā)育和精子生成，導(dǎo)致雄性成年家畜繁殖力顯著下降。HSPs對細(xì)胞炎癥和熱應(yīng)激等造成的損傷中發(fā)揮著十分重要的作用。有研究表明，熱應(yīng)激［1］、脂多糖(LPS)［2］和谷氨酰胺(Gln)［3］均可以誘導(dǎo)HSP72的表達(dá)，保護(hù)細(xì)胞和器官存活，降低機體死亡率。但是，熱應(yīng)激、LPS和Gln誘導(dǎo)牛睪丸支持細(xì)胞HSP72時效表達(dá)情況還不清楚。如果能證明HSP72時效表達(dá)的時間差異，也許可以利用HSP72分子伴侶作用。本研究以熱應(yīng)激、LPS和Gln為誘導(dǎo)因素刺激bSCs，誘導(dǎo)其HSP72表達(dá)，以探討HSP72的時效表達(dá)規(guī)律，為進(jìn)一步研究HSP72抗熱應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的調(diào)控機制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料和試劑原代培養(yǎng)的奶牛犢睪丸支持細(xì)胞;CCK－8細(xì)胞活力檢測試劑盒(南京建成生物工程公司);Gln(BioBasic Inc);RNA提取試劑盒(原平皓);反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司);LightCycler 480 SYBR Green I Master(Roche);HSP70(sc－1060)和GAPDH(sc－48166)抗體，購自Santa Cruze;兔抗羊IgG HRP和羊抗兔IgG HRP二抗(Jackson ImmunoResearch);Western及IP細(xì)胞裂解液(碧云天生物技術(shù)研究所);其他試劑均為化學(xué)分析純試劑。

1．2 試驗方法

1．2．1 熱應(yīng)激、LPS和Gln對細(xì)胞活力的影響通過檢測細(xì)胞活力篩選熱應(yīng)激、LPS和Gln的作用條件。熱應(yīng)激組:以34℃為空白對照組，37℃、39℃和41℃熱應(yīng)激1 h后恢復(fù)4 h，立即檢測為0 h時間點。Gln組:分別用濃度為0、0．5、1、2、4 mmol/L和8 mmol/L的Gln與細(xì)胞在34℃下培養(yǎng)12 h。LPS組:分別用濃度為0、0．1、1、10、50 μg/mL和100 μg/mL的LPS與細(xì)胞在34℃下培養(yǎng)12 h。以細(xì)胞生長抑制率小于或接近10%為標(biāo)準(zhǔn)篩選誘導(dǎo)條件。

1．2．2 qT－PCR法檢測HSP72基因表達(dá)根據(jù)1．2．1篩選得到的條件，分別檢測熱應(yīng)激、Gln和LPS處理0、2、4、6、8、10、12、14 h和16 h后細(xì)胞HSP72基因表達(dá)量(引物序列見表1)。采用2－ΔΔCt方法分析HSP72 mRNA表達(dá)量的相對變化。

表1 試驗中使用的RT－PCR引物

1．2．3 Western－Blot檢測HSP72蛋白提取各組細(xì)胞總蛋白，利用Western－Blot方法檢測和Image J軟件進(jìn)行灰度分析。HSP72與GAPDH的灰度比值作為HSP72的表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2．1 熱應(yīng)激、LPS和Gln對bSCS活力的影響根據(jù)CCK－8檢測原理，吸光度值越高表示活細(xì)胞數(shù)越多，結(jié)合本試驗結(jié)果(表2)，選擇對細(xì)胞傷害程度較小的39℃溫和熱應(yīng)激、濃度為2 mmol/L Gln和0．1 μg/mL的LPS為誘導(dǎo)條件。

表2 熱應(yīng)激/℃、LPS(μg/mL)和Gln(mmol/L)對細(xì)胞活力的影響

2．2 熱應(yīng)激對細(xì)胞HSP72基因和蛋白時效表達(dá)的影響熱應(yīng)激后6 h內(nèi)，顯著升高了細(xì)胞HSP72 mRNA和蛋白表達(dá)(P＜0．01)，并且二者均呈先高后低的趨勢，其中在熱應(yīng)激后0 h，HSP72基因表達(dá)最高，熱應(yīng)激后2 h其蛋白表達(dá)量最高(圖1)。

2．3 LPS對HSP72基因和蛋白時效表達(dá)的影響

LPS能誘導(dǎo)細(xì)胞HSP72基因和蛋白表達(dá)，并呈先高后低的趨勢。LPS處理后，細(xì)胞HSP72 mRNA表達(dá)在8～10 h顯著升高(P＜0．01)，而HSP72蛋白表達(dá)在處理后12 h表達(dá)最高(圖2)。

2．4 Gln對HSP72基因和蛋白時效表達(dá)的影響

Gln能使細(xì)胞HSP72基因和蛋白表達(dá)顯著升高，并呈先高后低的趨勢(圖3)。其中，Gln處理后2～6 h，細(xì)胞HSP72 mRNA表達(dá)最高，而細(xì)胞HSP72蛋白表達(dá)則在Gln處理后4 h時表達(dá)量最高(P＜0．01)。

圖1 熱應(yīng)激對HSP72基因和蛋白時效表達(dá)的影響

圖2 LPS對HSP72基因和蛋白時效表達(dá)的影響

圖3 Gln對HSP72基因和蛋白時效表達(dá)的影響

3 討論

HSP72是熱休克蛋白家族(HSPs)中研究最多、最受關(guān)注的一種，其在正常細(xì)胞［4］和胚胎［5］內(nèi)以低水平表達(dá)，而在熱應(yīng)激情況下會迅速高表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腸黏膜HSP72蛋白表達(dá)水平隨著熱應(yīng)激溫度的升高而增加，且呈現(xiàn)一定的溫度依賴效應(yīng)［6］。本試驗以不同溫度熱休克處理bSCs發(fā)現(xiàn)，在39℃處理時，細(xì)胞存活率最接近90%，并且在2 h內(nèi)誘導(dǎo)bSCs高表達(dá)HSP72。

大量醫(yī)學(xué)報道發(fā)現(xiàn)，HSP70表達(dá)和炎癥反應(yīng)關(guān)系密切，HSP70表達(dá)增加后有明顯的抗炎癥作用。研究還表明，細(xì)胞內(nèi)HSP72能降低LPS誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)合成與釋放［7］。LPS又可降低細(xì)胞存活率或抑制細(xì)胞增殖，低濃度的LPS還能夠誘導(dǎo)HSP72的表達(dá)［4］。而與熱應(yīng)激或Gln誘導(dǎo)HSP72表達(dá)不同的是，LPS誘導(dǎo)HSP72基因和蛋白表達(dá)的高峰分別出現(xiàn)在處理后的6 h和8 h，而LPS在6 h以前就已經(jīng)能誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥因子表達(dá)并使其出現(xiàn)炎癥反應(yīng)［4］。這些結(jié)果說明，細(xì)胞受LPS刺激后先發(fā)生炎性反應(yīng)，后引起HSP72表達(dá)，這就延緩了炎癥反應(yīng)中HSP72的抗炎作用。

有研究表明，Gln可以誘導(dǎo)HSP70的表達(dá)［8］，可作為誘導(dǎo)多種細(xì)胞HSP70表達(dá)的誘導(dǎo)劑。早在果繩Kc細(xì)胞上試驗就發(fā)現(xiàn)，在Gln作用下，細(xì)胞才能最大量的表達(dá)HSP。在熱應(yīng)激條件下，Gln能使果繩Kc細(xì)胞HSP表達(dá)量提高100倍。并且，Aln－Gln具有減輕全身炎癥反應(yīng)的功能［9］。本試驗中，Gln誘導(dǎo)HSP72基因和蛋白表達(dá)的時間均早于LPS處理的細(xì)胞。因此，可以推測，用Gln預(yù)處理細(xì)胞可增加其抗炎作用。當(dāng)然，Gln通過增加HSP72抗炎的機制還不清楚，以及其對機體組織是否具有和體外培養(yǎng)細(xì)胞一樣的作用效果等，都需要進(jìn)一步深入研究加以驗證。

［1］Zhang B Z，Guo X T，Chen J W，et al．Saikosaponin－d attenuates heat stress－induced oxidative damage in LLC－PK1cells by increasing the expression of antioxidant enzymes and HSP72［J］，American journal of Chinese medicine，2014，42(5):1261－1277．［2］史琨．脂多糖所致小鼠睪丸支持細(xì)胞GDNF表達(dá)減少對精原干細(xì)胞的影響［D］．濟南:山東大學(xué)，2013，25－36．

［3］梁夢凡，王學(xué)敏，江偉，等．谷氨酰胺誘導(dǎo)熱休克蛋白對急性肺損傷的保護(hù)作用［J］．上海交通大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2007，27 (1):114－116．

［4］Yang W，Li H，Xia C，et al．Baicalin attenuates lipopolysaccharide induced inflammation and apoptosis of cow mammary epithelial cells by regulating NF－κB and HSP72［J］．Int Immunopharmacol．，2016，30(40):139－145．

［5］Qi X，Li H，Cong X，et al．Baicalin increases developmental competence of mouse embryos in vitro by inhibiting cellular apoptosis and HSP70 expression and improving DNA methylation［J］．J Reprod Dev，2016，29:DOI:10．1262/jrd．2016－047．

［6］王丹妹，何佟，吉麗敏，等．全身熱應(yīng)激預(yù)處理對大鼠腸缺血－再灌注損傷程度的影響及機制［J］．山東醫(yī)藥，2012，52(38): 14－16．

［7］Wischmeyer P E．Glutamine and heat shock protein expression［J］．Nutrition，2002，18:225－228．

［8］張志宏，田文儒，李輝輝，等．谷氨酰胺誘導(dǎo)小鼠熱休克蛋白70表達(dá)的研究［J］．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，42(4):1428－1434．

［9］李春燕，廖東平，李仕強，等．丙氨酰－谷氨酰胺對重癥急性胰腺炎患者IL－6、TNF－α、D－二聚體的影響及臨床意義［J］．胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2015，24(3):351－353．

HSP72 aging expression induced by pretreatments with heat stress，LPS and Gln in bovine testicular sertoli cells

CONG Xia1，QU Ming-mei1，WANG Long-guang1，ZHANG Dong-jun2，TIAN Wen-ru1，LI Hua-tao1
(1．College of Animal Science and Veterinary Medicine，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China; 2 Veterinary and Animal Husbandry Department，F(xiàn)eicheng 271600，China．)

This study was aimed to investigate HSP72 aging expression pattern of bovine Sertoli cell(bSCs)induced by pretreatments with mild heat stress，LPS and Gln．The bSCs on their third generation were used and divided into heat stress，LPS and Gln stimulating groups．The cell viability was detected by CCK－8．The cellular HSP72 mRNA and its protein expression levels were detected at 0，2，4，6，8，10，12，14 and 16 h after treatments by RT－PCR and Western－Blot，respectively，The results showed that three measures of pretreatment could all induce HSP72 expression，and the highest protein expression levels were appeared at 2，4 and 12 h after heat stress，Gln and LPS pretreatment，respectively．From the above results we concluded that heat stress and Gln prestimulation can induce HSP72 expression in advance in bovine Sertoli cells，which indicate that Gln may be used for ameliorates LPS induced cellular injury．

bovine Sertoli cells;aging expression of HSP72;lipopolysaccharide;glutamine;heat stress

LI Hua-tao

S853．72

A

0529-6005(2017)01-0020-03

2016－05－26

國家自然科學(xué)基金(31572590;31502138);山東省自然科學(xué)基金(BS2015NY001);山東省高等學(xué)?？萍加媱濏椖?J15LF03)

叢霞(1962-)，女，高級實驗師，本科，從事獸醫(yī)臨床工作，E-mail:wrtian@126．com

李華濤，E-mail:htli1986@hotmail.com