焦雪，盧玉婷，安俊花，張翔宇，張培軍，李月紅

(1．吉林農業(yè)大學動物科學技術學院，吉林長春130118;2．內蒙古烏蘭察布市農牧業(yè)綜合行政執(zhí)法支隊，內蒙古烏蘭察布012000; 3．內蒙古烏蘭察布市水產(chǎn)站，內蒙古烏蘭察布012000;4．吉林省衛(wèi)生檢測檢驗中心，吉林長春130118)

傳染性造血器官壞死病病毒G基因全長cDNA克隆及重組表達研究

焦雪1，盧玉婷1，安俊花2，張翔宇3，張培軍4，李月紅1

(1．吉林農業(yè)大學動物科學技術學院，吉林長春130118;2．內蒙古烏蘭察布市農牧業(yè)綜合行政執(zhí)法支隊，內蒙古烏蘭察布012000; 3．內蒙古烏蘭察布市水產(chǎn)站，內蒙古烏蘭察布012000;4．吉林省衛(wèi)生檢測檢驗中心，吉林長春130118)

本研究旨在克隆G基因全長并與其他傳染性造血器官壞死病病毒(IHNV)株進行分析，為IHNV的預防檢測提供依據(jù)。通過提取IHNV-G蛋白RNA并進行擴增，將其克隆到pMD-18T并與pChlamy-4載體相連，重組到萊茵衣藻中并提取總蛋白，結果可得:擴增片段長度為1 500 bp，經(jīng)SDS-PAGE電泳得到一條大約為58 kDa的蛋白條帶，Westen Blot分析結果顯示，重組萊茵衣藻所表達的蛋白可以與6×HIS標簽抗體特異性結合;并且以重組表達的G蛋白為抗原，鼠抗IHNV血清為一抗，辣根過氧化物酶標記的驢抗鼠IgG為二抗，再次進行Westen Blot檢驗，其結果顯示，經(jīng)誘導后的G蛋白能與鼠抗IHNV血清反應，并在58 kDa處出現(xiàn)了一條明顯的特異性條帶，具有良好的反應原性。表明重組萊茵衣藻表達系統(tǒng)構建成功。

傳染性造血器官壞死病病毒(IHNV);糖蛋白;Western Blot

傳染性造血器官壞死病病毒(Infectious Hematopoietic Necrosis Virus，IHNV)屬彈狀病毒科，諾拉彈狀病毒屬，主要感染鮭、鱒魚。以腎臟和脾臟等造血組織壞死為主要特征［1］。該病毒主要通過水平傳播感染宿主，幼魚時期患病未死亡的帶病魚是IHNV的主要傳播源［2］。其中，IHNV糖蛋白是病毒的主要抗原［3］，與病毒的毒力直接相關［4］，并且在細胞受體與病毒結合過程中起著十分重要的作用［5］。目前，對IHNV有效的防控措施是通過隔離病毒或是注射疫苗，但3月齡內的魚苗其免疫器官未發(fā)育成熟，所以注射疫苗往往達不到理想的效果，本研究主要以研制出安全、可靠的新型載體口服疫苗為目的，從根本上斷絕病毒的傳播，為我國的冷水漁業(yè)健康發(fā)展提供一定的技術支持。

1 材料與方法

1．1 試驗材料FHM細胞系分離培養(yǎng)的IHNV株細胞毒由吉林農業(yè)大學動科109實驗室保存，重組萊茵衣藻由實驗室構建并保存。

1．2 IHNV-G基因總RNA的提取取300 μL細胞毒加1 mL TRIZol室溫孵育5 min，12 000 r/min (4℃)離心15 min后吸取上清，加入200 μL的氯仿震蕩15 s，室溫孵育5 min;12 000 r/min(4℃)離心15 min;吸取上層轉置到一個新的EP管中，加入500 μL的異丙醇沉淀RNA，室溫孵育10 min; 12 000 r/min(4℃)離心15 min;倒掉上清，加入1 mL 75%的乙醇洗滌2次，7 500 r/min(4℃)離心5 min;室溫干燥5 min，加25 μL的無RNA酶處理水溶解并保存在－80℃。

1．3 IHNV-G基因cDNA的克隆以1 μL細胞毒為模板，按照寶生物工程(大連)有限公司提供的反轉錄試劑盒合成cDNA第一條鏈，引物根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中已公開IHNV的HLJ-09株(登錄號: JX649101)的G基因序列設計上下游引物，去掉終止密碼子后在上游引物中引入EcoR I酶切位點和下游引物中引入Kpn I酶切位點如圖2～4。IHNVG(F:5'-TAGATATCATGGACGCCATGATCAC-3';R: 5'-ATGGTACCTATTAGGACCTGTTTGCC-3')由上海生工生物工程技術服務有限公司合成;PCR反應條件為:94℃預變性5 min;94℃變性5 min;退火溫度61Tm;72℃延伸1 min，35個循環(huán);最后72℃延伸8 min，4℃保存。將PCR產(chǎn)物進行膠回收，按寶生物工程(大連)有限公司提供的膠回收試劑盒進行純化，連接至DH5α中，挑取白色菌落擴大培養(yǎng)，按照質粒DNA小量提取試劑盒提取，用EcoR I酶、Kpn I酶進行雙酶切，將陽性質粒送上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。

1．4 序列分析及構建發(fā)育樹將獲得的DNA序列使用DNAStar軟件進行同源性比對，使用MEGE5.2分析遺傳進化關系構建系統(tǒng)進化樹。

1．5 IHNV-G蛋白血清的制備抗IHNV全血清病毒的制備，取本實驗室保存的IHNV細胞毒15 mL，按照2.5 μL/mL加入40%甲醛至終濃度0．1%，37℃溫育48 h。加入等體積的弗氏佐劑混勻，采用腹腔注射，每只小鼠注射0.25 mL。每隔7 d免疫1次，第4次免疫后3 d眼球取血，每只小鼠眼球取血約0.7 mL，37℃水浴1 h，3 000 r/min(4℃)，離心10 min，最后血清量約350 μL左右置于－20℃保存。

1．6 Westen Blot將重組的萊茵衣藻表達蛋白進行SDS-PAGE電泳，電泳結束后用蒸餾水沖洗3次，置于轉膜緩沖液中平衡5 min準備轉膜;轉膜結束后，取出PVDF膜，做好標記，用PBS沖洗3次，置于5%脫脂奶中，4℃封閉過夜;次日，取出PVDF膜，用TBST漂洗3次，每次5 min，在加入1∶3 000稀釋濃度的鼠源HIS標簽抗體作為一抗，室溫孵育5 h;TBST漂洗3次，每次5 min;加入1∶2 000稀釋濃度的辣根過氧化物酶標記的驢抗鼠IgG作為二抗，37℃孵育1．5 h;TBST漂洗3次，每次5 min。按照DAB顯示試劑盒進行顯色，顯色前將10 mL反應液，200 μL溶液A，100 μL溶液B，20 μL溶液C在棕色瓶中充分混勻，再將PVDF膜浸泡在其中，37℃條件下震蕩反應5 min，棄去顯色液后用蒸餾水沖洗3次，自然干燥后觀察記錄。

1．7 重組G蛋白的反應原性以重組表達的G蛋白為抗原，鼠抗IHNV血清為一抗，辣根過氧化物酶標記的驢抗鼠IgG為二抗，再次以Westen Blot試驗測定G蛋白抗血清與病毒反應性。

2 結果與分析

2．1 IHNV-G基因總RNA提取結果待80%細胞出現(xiàn)明顯病變，按照TRIZol試劑說明書操作提取細胞毒中FHM細胞和IHNV病毒的總RNA如圖1。

圖1 FHM細胞和IHNV病毒的總RNA

2．2 IHNV-G基因RT-PCR擴增以FHM細胞和IHNV病毒的總RNA為模板，反轉錄合成cDNA第一條鏈。再以cDNA作為PCR反應的模板，經(jīng)特異性引物PCR反應后，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定結果如圖2，得到一條1 500 bp左右大小的特異性條帶。

圖2 PCR擴增結果

2．3 IHNV-G基因系統(tǒng)發(fā)育樹構建及分析將IHNV-G基因與多株IHNV參考株進行核苷酸同源性比較可得，IHNV-G基因與韓國株ChYa 07和PcKw11同源性較高，分別為97．8%和97．5%，其推導的氨基酸序列同源性為97．5%和98．2%。與其他參考株核苷酸同源性為94．8%～96．7%，推導出的氨基酸同源性為94．5%～95．8%。從G基因的進化樹上看(圖3)，CJ-13株G基因與韓國分離的2株相對較近，表明亞洲分離株與美國分離株、歐洲分離株進化關系較遠，明顯不在同一個進化分支上。

圖3 G基因核苷酸進化樹分析

2．4 IHNV-G基因重組用EcoR I和Kpn I消化pMD-18T-IHNV-G重組質粒和pChlamy-4載體，回收IHNV-G基因片段和pChlamy-4線性化載體片段，T4連接酶連接構建出表達載體。將表達載體化學轉化到大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞中進行擴增后提取質粒，進行雙酶切，酶切產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行驗證結果如圖4，得到一條1 500 bp左右大小的特異性條帶，說明線性化載體與目的片段連接成功，將質粒送至測序公司進行測序，測序結果同樣證明載體與目的片段連接成功，插入片段進行同源性比對結果同源性為99%。

2．5 SDS-PAGE電泳分析結果轉基因萊茵衣藻經(jīng)兩次抗性篩選后，離心收集轉基因萊茵衣藻，超聲波破碎萊茵衣藻提取粗蛋白，進行SDS-PAGE電泳，結果顯示，有一條大約為58 kDa的蛋白條帶(如圖5)，與理論結果相符合。

2．6 Western blot檢測結果以重組表達的目的蛋白為抗原，鼠源HIS標簽抗體為一抗，辣根過氧化物酶標記的驢抗鼠IgG為二抗，Western Blot結果顯示，目的蛋白能與鼠源HIS標簽抗體反應，在58 kDa處出現(xiàn)了一條明顯的特異性條帶，與SDS－PAGE出現(xiàn)的目的蛋白一致，如圖6。

圖4 PCR結果M1:λ-EcoT 14 I Marker;M2:250 bp DNA Marker 1:轉基因萊茵衣藻基因組DNA;2:PCR結果

圖5 pCh-IHNV-G在萊茵衣藻中表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

以重組表達的產(chǎn)物為抗原，鼠抗IHNV血清為一抗，辣根過氧化物酶標記的驢抗鼠IgG為二抗，再次進行Western Blot檢測，并在58 kDa處出現(xiàn)了一條明顯的特異性條帶(見圖7箭頭)，說明經(jīng)誘導后的G蛋白能與鼠抗IHNV血清反應。

圖6 Western Blot分析

圖7 Western Blot分析

3 討論

本試驗以IHNV-G基因、萊茵衣藻為原料進行基因重組，免疫小鼠獲得了鼠抗血清，并通過Western Blot進行免疫原性分析，結果表明，糖蛋白在萊茵衣藻中得到了表達，具有反應原性，但是表達量很低。其原因可能是由于萊茵衣藻的核基因組含有較高的GC堿基對，并具有較明顯的密碼子偏好性，密碼子的第一位和第3位多數(shù)為G或C［6－7］，而本試驗沒有對糖蛋白基因進行密碼子優(yōu)化，可能是造成蛋白表達量低;其次基因在萊茵衣藻表達高低與啟動子的選擇和mRNA的穩(wěn)定性有一定的關系［8］。Lumbreras等［9］的研究顯示，RBCS2內含子的插入可提高ble基因的表達效率，由于RBCS2中含有轉錄增強元件;Schroda等的研究發(fā)現(xiàn)，HSP70A融合到RBCS2和NIT的上游時，可提高外源基因的表達，并減少“基因沉默”。本研究選用HSP70ARbc S2融合啟動子和3'-UTR確保正常終止轉錄，保障外源基因的表達［10］。三是外界的原因，轉基因萊茵衣藻的培養(yǎng)條件也會影響外源基因的表達，如抗生素的濃度，培養(yǎng)溫度，光照強度等。本試驗對轉基因萊茵衣藻的培養(yǎng)沿用轉基因前的條件，并未對其進行摸索，可能也是其表達量低的原因。

［1］St-Hilaire S，Ribble C S，Stephen C，et al．Epidemiological investigation of infectious hematopoietic necrosis virus in salt water netpen reared Atlantic salmon in British Columbia Canada［J］．Aquaculture，2002，212(1):49-67．

［2］Ammayappan，S E La Patra，V N Vakharia．Mo Lecu Lar characterization of the viru Lent infectious hematopoietic necrosis virus(IHNV)strain 220-90［J］．Viro Logy Journa L，2010，7:10．

［3］世界動物衛(wèi)生組織(OIE)．水生動物疫病診斷手冊［M］．3版．北京:中國農業(yè)出版社，2000:45．

［4］H Schutze，P J Enzmann，E Mundt，et al．Identification of the nonvirion(NV)protein of fish rhabdoviruses vira L haemorrhagic septicaemia virus and infections haematopoietic necrosis virus［J］．Gen Viro L，1996，77:1259-1263．

［5］J H Cox，B Dietzscho Ld，L G Schneider，et al．Rabies virus g Lycoprotein．II．Bio Logica L andsero Logica L characterization［J］．Infect Immuno Logy，1977，16(3):75-759．

［6］Kurath G，Garver K A，Corbeil S，et al．Protective immunity and lack of histopathological damage two years after DNA vaccination against infectious hematopoietic necrosis virus in trout［J］．Vaccine，2006，24(3):345-354．

［7］盧玉婷，王建超．傳染性造血器官壞死病病毒(IHNV)糖蛋白基因萊茵衣藻表達載體的構建［J］．中國獸醫(yī)學報，2016，36 (11):5-9．

［8］楊星宇．含GFP基因的萊茵衣藻高效表達載體的構建及其在衣藻葉綠體中的表達［D］．青島:青島科技大學，2012．

［9］Jakubiec H．Studies on the Polish Chlamydomonadaceae［J］．Nova Hedwigia，1984，39:269-292．

［10］吉尚雷，盧玉婷．傳染性造血器官壞死病病毒CJ-13株糖蛋白的原核表達及免疫原性［J］．西北農林科技大學學報(自然科學版)，2015(7):1-7．

Cloning and recombinant expression of cDNA gene of infectious hematopoietic necrosis virus G gene

JIAO Xue1，LU Yu-ting1，AN Jun-hua2，ZHANG Xiang-yu3，ZHANG Pei-jun4，LI Yue-hong1
(1．Jilin Agriculture University，College of animal science and technology，Changchun 130118，China;2．Agriculture and animal husbandry，Wulanchabu City，Inner Mongolia comprehensive administrative law enforcement detachment，Wulanchabu 012000，China;3．Fisheries Station of Wulanchabu City，Wulanchabu 012000，China;4．Jilin provincial health inspection and Testing Center，Changchun 130118，China)

This study aimed to clone the full-length G gene and compred with other IHNV strains to provide the basis for preventive detection of IHNV．IHNV-G gene was amplified and cloned into pMD-18T pChlamy-4 and was then connected to the carrier recombination into C．reinhardtii．The amplified fragment length was 1 500bp，and SDS-PAGE electrophoresis showed that the expressed protein was about 58KDa，Westen blot analysis showed that the recombinant protein expressed by C．reinhardtii specifically bound with a 6×HIS tag antibody;westen blot analysis also shaved that the recombinant G could reacted with mouse anti-serum IHNV．Our results indicate that the recombinant expression system reinhardtii is successfully constructed．

Infectious Hematopoietic Necrosis Virus;IHNV;Glycoprotein;Western blot

LI Yue-hong

S941

A

0529-6005(2017)01-0003-04

2016-04-13

國家自然科學基金(30972191);吉林省留學人員創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目(201523);長春市農業(yè)先進實用技術的示范推廣項目(20130215);農業(yè)部948項目(2014Z34)

焦雪(1992-)，女，碩士生，主要從事動物疾病及免疫研究，E-mail:455261939@qq．com

李月紅，E-mail:liyhong@sina．com