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        針刺配合黃連溫膽湯加減對代謝綜合征大鼠胰島素抵抗及脂肪細胞因子的影響

        2017-03-28 07:26:30馬育軒于國強張洪財隋艷波崔健昆宣威陳洪琳
        中醫(yī)藥信息 2017年2期
        關(guān)鍵詞:溫膽溫膽湯瘦素

        馬育軒,于國強,*,張洪財,隋艷波,崔健昆,宣威,陳洪琳

        (1.黑龍江中醫(yī)藥大學,黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院,黑龍江 哈爾濱 150040)

        針刺研究

        針刺配合黃連溫膽湯加減對代謝綜合征大鼠胰島素抵抗及脂肪細胞因子的影響

        馬育軒1,于國強1,2*,張洪財1,隋艷波2,崔健昆2,宣威2,陳洪琳2

        (1.黑龍江中醫(yī)藥大學,黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院,黑龍江 哈爾濱 150040)

        目的:通過針灸配合中藥湯劑黃連溫膽湯干預MS大鼠,觀察針刺配合黃連溫膽湯加減對膳食誘導MS大鼠胰島素抵抗及脂肪細胞因子、Leptin、下丘腦Leptin受體和NPY蛋白表達的影響,探討相關(guān)作用機制。方法:以高脂高糖高鹽飼料喂養(yǎng)建立MS大鼠模型,選擇符合標準的MS大鼠隨機分為模型對照組、針刺組、黃連溫膽湯組、針刺加黃連溫膽湯組。針刺及給藥后4周檢測大鼠空腹血糖、血清TC、TG、血清胰島素、瘦素、血脂、丘腦Leptin受體與神經(jīng)肽Y(NPY),計算胰島素敏感性指數(shù)和Lee's肥胖指數(shù)。結(jié)果:針刺組、黃連溫膽湯組、針刺加黃連溫膽湯組大鼠體質(zhì)量、Lee's肥胖指數(shù)、血壓、空腹血糖(FBG)、血清胰島素(FINS)、HOMA-IR、TG、TC較模型組水平均下降(P<0.05);針刺加黃連溫膽湯組大鼠脂肪細胞因子蛋白表達較單純針刺組和黃連溫膽湯組Leptin、Leptin-R下降程度更大,NPY升高程度更大(P<0.05)。結(jié)論:通過針刺結(jié)合黃連溫膽湯的治療方案,可以通過調(diào)控JAK-STAT途徑中Leptin、Leptin-R及NPY的表達改善脂類代謝的表達,從而有效抑制胰島素抵抗,起到對MS的治療作用。

        MS;胰島素抵抗;針刺;黃連溫膽湯;脂肪因子

        代謝綜合征(Metabolic Syndrome,MS)即以肥胖、高血壓、糖代謝異常及脂代謝異常等一組代謝紊亂證候群[1-2]。其共同病理生理基礎為胰島素抵抗(Insulin Resistance,IR),IR的發(fā)生與多種因素有關(guān),如年齡、飲食、妊娠、肥胖、種族、遺傳等,其中肥胖以中心型肥胖為主。近年來研究[3]發(fā)現(xiàn),脂肪組織遠非一個能量儲存器,而是一個復雜的、重要的、功能高度活躍的內(nèi)分泌器官,其分泌的瘦素、TNF-α的信號,可分別和內(nèi)分泌神經(jīng)中樞、胰島及肌細胞進行脂腦、脂胰、脂肌及脂肝的對話,形成復雜的反饋網(wǎng)絡,調(diào)節(jié)神經(jīng)肽Y (NPY)、下丘垂體、腎上腺軸及性腺軸功能,調(diào)節(jié)胰島素分泌、肌細胞胰島素受體敏感性,以及GLUT4的表達、轉(zhuǎn)位等以維持糖脂代謝。本實驗擬用針刺配合黃連溫膽湯加減干預治療膳食誘導型MS大鼠,觀察其對IR和脂肪細胞因子瘦素(Leptin)、及下丘腦Leptin受體與神經(jīng)肽Y(NPY)蛋白表達的影響,探討相關(guān)作用機制。

        1 材料和方法

        1.1 材料及試劑

        SD大鼠(黑龍江中醫(yī)藥大學藥物安全性評價中心提供,動物合格證號:黑動字第P00102008);膽固醇(北京中山生物工程有限公司,批號20130202);Leptin放免分析藥盒(武漢博士德生物工程有限公司);血脂試劑盒(中國大連寶生物工程有限公司);Leptin受體與神經(jīng)肽Y(NPY)試劑盒(中國上海捷瑞生物工程有限公司,批號20131201)。

        1.2 儀器設備

        動物多通道無創(chuàng)血壓測定儀(瑞士Mettler公司);微量血糖儀及配套血糖試紙(德國Eppendorf公司);全自動生化儀(美國Beehman公司);γ放射免疫計數(shù)器(型號 FJ-2008PS,國營 262廠);電子天平(0.000 1 g,中國上海精密儀器儀表公司)。

        1.3 造模方法

        將健康雄性SD大鼠60只隨機分為空白組10只,給予普通飼料(骨粉3%,魚粉5%,玉米粉30%,面粉20%,麩子20%,豆餅20%,食鹽2%);實驗組50只,給予高脂高糖高鹽飼料(基礎飼料53%,豬油15%,蔗糖15%,蛋黃10%,食鹽5%,膽固醇2%);飼喂20周。檢測體質(zhì)量、血壓;用血清生化法檢測空腹血糖、血清胰島素、血脂、C肽,篩選MS成模大鼠。

        1.4 成模情況

        空白組大鼠無死亡,實驗組大鼠死亡6只,存活率90%。選擇在具備肥胖成模標準[4]基礎上符合甘油三酯水平升高、高密度脂蛋白水平降低、高血壓及胰島素敏感指數(shù)升高4項標準中任意2項者作為MS大鼠模型復制成功標準。

        1.5 動物分組

        空白組(A)大鼠10只。篩選MS模型成功大鼠36只,編號后依次登記,由隨機數(shù)字表法產(chǎn)生36個隨機數(shù)字,采用簡單隨機化分組方法,隨機分為模型對照組(B)9只、針刺組(C)9只、黃連溫膽湯組(D)9只、針刺加黃連溫膽湯組(E)9只。

        1.6 針刺及給藥

        針刺組腧穴選擇參照華興邦教授方法[5],選擇大鼠“合谷”“曲池”“后三里”“三陰交”等腧穴針刺;黃連溫膽湯組選擇黃連溫膽湯加減配伍方劑:黃連、半夏、陳皮、茯苓、葛根、決明子、甘草、竹茹、黃芪、丹參等,給藥劑量為6.7 g/(kg·d);針刺加黃連溫膽湯組按針刺組方法針刺,同時按黃連溫膽湯組方法給藥;空白組和模型組等量蒸餾水灌胃,空白組給予普通飼料,其他各組繼續(xù)給予高糖高脂高鹽飼料。4周后取材。

        1.7 標本采集

        處死前禁食12 h,乙醚麻醉后,腹主動脈取血,靜置后離心取上清,-20℃保存待測,隨即取腎周、附睪、腸系膜脂肪墊(內(nèi)臟脂肪),用電子天平稱重,并立即將附睪脂肪墊放入液氮中,-80℃保存待測。

        1.8 實驗指標檢測

        電子天平測定體質(zhì)量,大鼠血壓儀測定尾動脈收縮壓;微量血糖儀及配套試紙測定各組大鼠空腹血糖(FPG);全自動生化分析儀檢測各組大鼠血清TC、TG;放免法檢測血清胰島素、瘦素(Leptin,LP),全自動生化儀測定血脂,用免疫組化方法進行檢測下丘腦Leptin受體與神經(jīng)肽Y(NPY)蛋白表達。計算胰島素敏感性指數(shù)[3]:HOMA-IR=(FPG×FINS)/22.5;計算Lee's肥胖指數(shù)。

        1.9 統(tǒng)計學處理

        SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理,計量資料用均數(shù)±標準差(±s)表示,組間比較采用方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

        2 結(jié)果

        2.1 針刺配合黃連溫膽湯加減對MS大鼠體質(zhì)量、血壓、糖脂代謝及胰島素抵抗的影響

        模型組大鼠體質(zhì)量、Lee's肥胖指數(shù),血壓、空腹血糖(FBG)、血清胰島素(FINS)、HOMA-IR、TG、TC較空白組均明顯增高(P<0.05);針刺組、黃連溫膽湯組、針刺加黃連溫膽湯組大鼠體質(zhì)量、Lee's肥胖指數(shù),血壓、空腹血糖(FBG)、血清胰島素(FINS)、HOMAIR、TG、TC較空白組均明顯增高(P<0.05),較模型組水平均下降(P<0.05);針刺加黃連溫膽湯組大鼠體質(zhì)量、Lee's肥胖指數(shù),血壓、空腹血糖(FBG)、血清胰島素(FINS)、HOMA-IR、TG、TC較單純針刺組和黃連溫膽湯組下降程度更大(P<0.05)。見表1。

        表1 針刺配合黃連溫膽湯加減對MS大鼠體質(zhì)量、血壓、糖脂代謝及胰島素抵抗的影響(±s)

        表1 針刺配合黃連溫膽湯加減對MS大鼠體質(zhì)量、血壓、糖脂代謝及胰島素抵抗的影響(±s)

        注:與空白組(A)比較,*P<0.05;與針刺加黃連溫膽湯組(E)比較,△P<0.05。

        組別 n 體質(zhì)量(g) 收縮壓(mmHg) FBG(mmol/L) FINS(mU/L) TG(mmol/L) TC(mmol/L) Lee's肥胖指數(shù)HOMA-IR A 10 430.95±0.64 110.22±2.11 4.51±0.54 21.21±4.21 0.94±0.21 2.68±0.31 335.44±31.00 4.36±1.36 B 9 523.12±54.21*136.22±2.33*6.11±0.21*32.11±5.21*1.19±0.14*3.28±0.28*361.43±17.22*8.92±1.08*C 9 491.21±37.11△132.21±9.33△5.42±0.51△30.21±5.21△1.08±0.21△2.88±0.22△356.21±10.11△7.08±0.68△D 9 482.22±32.21△135.24±3.44△5.39±0.14△39.21±4.14△1.07±0.17△2.87±0.21△350.78±10.94△6.67±1.93△E 9 342.11±12.22 120.27±8.21 5.21±0.21 27.35±4.34 0.96±0.12 2.77±0.32 342.88±12.07 6.16±0.94

        2.2 針刺配合黃連溫膽湯加減對MS大鼠脂肪細胞因子瘦素(Leptin,LP)、Leptin受體(Leptin-R)及神經(jīng)肽Y(NPY)蛋白表達的影響

        模型組大鼠脂肪細胞因子蛋白表達較空白組Leptin、Leptin-R均明顯增高,NPY明顯降低(P<0.05);針刺組、黃連溫膽湯組、針刺加黃連溫膽湯組大鼠脂肪細胞因子蛋白表達較空白組Leptin、Leptin-R均明顯增高,NPY明顯降低(P<0.05),較模型組Leptin、Leptin-R均降低,NPY升高(P<0.05);針刺加黃連溫膽湯組大鼠脂肪細胞因子蛋白表達較單純針刺組和黃連溫膽湯組Leptin、Leptin-R下降程度更大,NPY升高程度更大(P<0.05)。見表2,圖1。

        表2 針刺配合黃連溫膽湯加減對MS大鼠脂肪細胞因子瘦素(Leptin,LP)、Leptin受體(Leptin-R)及神經(jīng)肽Y(NPY)蛋白表達的影響(±s)

        表2 針刺配合黃連溫膽湯加減對MS大鼠脂肪細胞因子瘦素(Leptin,LP)、Leptin受體(Leptin-R)及神經(jīng)肽Y(NPY)蛋白表達的影響(±s)

        注:與空白組(A)比較,*P<0.05;與針刺加黃連溫膽湯組(E)比較,△P<0.05。

        組別n Leptin Leptin-R NPY A 10 3.40±0.28 19.33±2.29 51.52±2.53 B 9 6.81±1.20*39.63±3.62*25.13±1.25*C 9 5.90±1.54△34.21±2.17△27.21±2.81△D 9 5.41±0.67△32.21±3.21△29.27±2.41△E 9 4.66±1.03 26.21±2.12 39.21±2.85

        圖1 針刺配合黃連溫膽湯加減對MS大鼠脂肪細胞因子瘦素(Leptin,LP)、Leptin受體(Leptin-R)及神經(jīng)肽Y(NPY)蛋白表達的影響

        3 討論

        黑龍江省位于亞歐大陸東部的中高緯度,冬季風來自高緯內(nèi)陸,受極地大陸氣團控制,嚴寒干燥,寒潮頻繁,冬季漫長。由于特殊的氣候特點,本地人喜高脂高鹽飲食,隨之帶來的是肥胖、高血壓、高血脂等一系列亞健康狀態(tài),并由此引發(fā)MS、心腦血管疾病等。

        肥胖及脂代謝紊亂均屬于中醫(yī)學“痰濕”范疇,中醫(yī)學在治療代謝綜合癥這一方面是運用中草藥,相對于西藥治療,中醫(yī)從臟腑辨證分析,認為MS主要與肝、脾、腎三臟的功能有關(guān),重在調(diào)理,講究辨證,而且副作用?。?-11]。另一方面,通過針灸相應穴位,并通過針灸來調(diào)理內(nèi)分泌,使之趨于正常?!鹅`樞·逆順肥瘦》曰:“此肥人也。廣肩腋,項肉薄,厚皮而黑色,唇臨臨然,其血黑以濁,其氣澀以遲”,說明了肥胖者的形態(tài)及氣血特點[12]。古人對肥胖有一定的認識,但這種認識尚不深刻,這可能也與生活條件不夠發(fā)達、肥胖者較少肥胖程度較輕有一定關(guān)系。當今社會,肥胖成為全球的流行病。隨著相關(guān)疾病(如MS)發(fā)病率的不斷升高,人們越來越清醒的認識到肥胖的危害。身體質(zhì)量控制的實質(zhì)是飲食與運動調(diào)控,但這是多數(shù)肥胖者不愿接受的。于是,采用針刺結(jié)合中醫(yī)湯藥的方案成為一種切實有效且副作用小的治療MS方法,是醫(yī)學工作者研究的一個重點。張翠彥等[13]以超聲測量內(nèi)臟脂肪厚度(VFT)作為主要評價指標,采用針刺結(jié)合飲食控制、運動方案治療單純性向心性肥胖取得確切療效;韓海榮等[14]針刺“足三里”“三陰交”“中脘”等穴位,不僅能夠降低肥胖大鼠下丘腦NPY和瘦素(Leptin)基因表達,并引起其血清含量的下降,而且能提高Leptin受體基因表達,從而增強Leptin信號傳導,抑制機體食欲,進而控制攝入量,減少脂肪蓄積,達到減肥目的。

        近幾年來關(guān)于MS發(fā)病機理及防治的研究較為深入的是obese基因(ob基因),其蛋白產(chǎn)物稱為Leptin,是潛在可用于MS治療的靶基因[15]。

        Leptin主要由脂肪細胞分泌,胰島素和腎上腺糖皮質(zhì)激素促進Leptin的分泌,再進入到血中。Leptin能跨越血腦屏障。Leptin的作用分為周圍和中樞作用,其中樞作用主要在下丘腦通過受體介導。Leptin-R長亞型受體是廣泛地分布在腦內(nèi),Leptin-R短亞型受體是分布在周圍組織。腦內(nèi)Leptin-R主要分布在脈絡叢、下丘腦、弓狀核。Leptin與弓狀核Leptin-R相互作用,給大腦帶來了體內(nèi)燃料儲存的信息。Leptin是一個有力的抑胃因素,有飽食因子的作用,可減少攝食,增加能量的消耗,增加產(chǎn)熱,至少防止能量消耗降低,增加胰島素的敏感性。給由于基因變性后,既不生產(chǎn),又不分泌Leptin的ob/ob鼠服用Leptin,它們的攝食、體質(zhì)量、大多數(shù)代謝異?;謴驼#?6]。在遺傳性肥胖的大多數(shù)肥胖的人中,循環(huán)中Leptin水平升高。這是由于高胰島素血癥和高腎上腺皮質(zhì)類固醇血癥誘導了Leptin分泌。Leptin降低血中胰島素水平,降低脂肪組織的儲存能力,增加葡萄糖的利用,Leptin引起的改變有利于氧化消耗儲存的脂肪。中樞功能障礙時,阻礙正常Leptin進入腦的特殊區(qū)域并發(fā)揮作用,不充足的中樞信號可導致胰島素抵抗。當小鼠有Leptin-R無突變,缺乏Leptin-R時,腦內(nèi)的Leptin濃度降低,在下丘腦上調(diào)開胃神經(jīng)肽,小調(diào)誘導引飽食的神經(jīng)肽,可使動物的攝食增加,產(chǎn)熱降低,能量的消耗減少,產(chǎn)生肥胖、IR和 Leptin抵抗。提高腦內(nèi)的Leptin濃度,增加胰島素敏感性。給予胰島素預處理后,Leptin引起的反應是顯著地減少。

        JAK-STAT途徑則可能是Leptin受體后信號轉(zhuǎn)導通路中目前已知的一個最主要的途徑[17]。Leptin-Leptin受體(尤其是 OBRb)-STAT3(磷酸化)-NPY-胰島素通路參與了Leptin和胰島素抵抗的中樞信號轉(zhuǎn)導過程,在MS的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮了重要的作用。

        Leptin的中樞作用通過NPY介導,Leptin降低下丘腦Leptin的濃度,或小調(diào)NPY的表達,進而降低攝食。在腦內(nèi)的有關(guān)代謝、食欲、IR等信號分子相互作用,Leptin處于NPY的上游。腦內(nèi)給予Leptin增加腰部交感神經(jīng)的興奮性,升高評價動脈壓血壓。給正常大鼠腦室內(nèi)灌注Leptin,能降低NPY水平,Leptin和NPY一同保持人體的能量平衡[18]。

        本課題擬采用針刺配合黃連溫膽湯的方法干預MS大鼠,檢測其對MS大鼠胰島素抵抗及脂肪細胞因子、Leptin、下丘腦Leptin受體NPY蛋白表達的影響,對中醫(yī)學傳統(tǒng)干預手段進行優(yōu)化組合,遴選出最佳治療方案,并探討相關(guān)作用機制,觀察OBRb-STAT3(磷酸化)-NPY-胰島素通路在肥胖的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮了重要的作用及其對脂類代謝的調(diào)控作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),針刺加黃連溫膽湯組大鼠體質(zhì)量、Lee's肥胖指數(shù),血壓、空腹血糖(FBG)、血清胰島素(FINS)、HOMA-IR、TG、TC較單純針刺組和黃連溫膽湯組下降程度更大(P<0.05);針刺加黃連溫膽湯組大鼠脂肪細胞因子蛋白表達較單純針刺組和黃連溫膽湯組Leptin、Leptin-R下降程度更大,NPY升高程度更大(P<0.05)。說明通過針刺結(jié)合黃連溫膽湯的治療方案,可以通過調(diào)控JAK-STAT途徑中Leptin、Leptin-R及NPY的表達改善脂類代謝的表達,從而有效抑制胰島素抵抗,起到對MS的治療作用。

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        R285.5

        A

        1002-2406(2017)02-0071-04

        國家自然科學基金面上項目(No.81273650);國家自然科學基金青年基金項目(No.81503495);黑龍江中醫(yī)藥大學??蒲谢鹳Y助面上項目(No.201501)

        馬育軒(1983-),男,助理研究員,博士,黑龍江中醫(yī)藥大學中藥學博士后流動站工作人員,主要研究方向:方劑藥效物質(zhì)基礎及作用機理研究。

        于國強*(1982-),男,副主任醫(yī)師,黑龍江中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合學科博士后科研流動站在站人員,主要研究方向:針刺鎮(zhèn)痛及腧穴特異性研究。

        2016-10-17

        修回日期:2016-11-10

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        The Mechanism of Regulating Leptin Resistance in Obesity and the In fluence of Adjusting Methylation of OB-R,POMC Gene Promoter of Wendan Decoction (溫膽湯)
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