孫 葉，包建忠，劉 紅，馬 輝，張 甜，陳秀蘭**

（1.江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 揚(yáng)州 225007；2.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；3.揚(yáng)州循天嶺生物科技有限公司，江蘇 揚(yáng)州 225007）

DOI：10.13629/j.cnki.53-1054.2017.02.013

蛹蟲草產(chǎn)量及主要活性物質(zhì)的影響因素研究*

孫 葉1，2，包建忠1，劉 紅3，馬 輝1，張 甜1，陳秀蘭1**

（1.江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 揚(yáng)州 225007；2.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；3.揚(yáng)州循天嶺生物科技有限公司，江蘇 揚(yáng)州 225007）

以提高蛹蟲草子實(shí)體產(chǎn)量、活性物質(zhì)含量為研究目的。以小麥為基本培養(yǎng)基固體培養(yǎng)蛹蟲草子實(shí)體，采用單因素、二因素試驗(yàn)研究碳源、氮源和菌種對(duì)蛹蟲草實(shí)體產(chǎn)量、活性物質(zhì)含量的影響。產(chǎn)量單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，每瓶添加1 g蠶蛹粉、營(yíng)養(yǎng)液中白砂糖濃度為20 g·L-1的培養(yǎng)基培養(yǎng)子實(shí)體產(chǎn)量最高；但不同水平的蠶蛹粉、黃豆粉對(duì)子實(shí)體產(chǎn)量影響差異不顯著。二因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)液中白砂糖濃度為20 g·L-1，蠶蛹粉添加量為2 g·瓶-1時(shí)，子實(shí)體產(chǎn)量最高；碳源、氮源及碳源和氮源的互作對(duì)蛹蟲草的產(chǎn)量有極顯著的影響?；钚晕镔|(zhì)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)液中蔗糖濃度為10 g·L-1時(shí)腺苷和蟲草素含量最高；每瓶培養(yǎng)基中添加1 g土豆粉時(shí)，子實(shí)體多糖含量最高，與其他營(yíng)養(yǎng)添加物質(zhì)有顯著差異；不同菌種對(duì)產(chǎn)量和主要活性物質(zhì)含量的影響差異顯著。

蛹蟲草；產(chǎn)量；活性物質(zhì)

蛹蟲草（Cordyceps militarisLink），又名北冬蟲夏草、北蟲草，無(wú)性型屬于蛹草擬青霉 （Paecilomyces militarisLiang），有性世代屬于蟲草屬（Cordyceps），與冬蟲夏草（Cordyceps sinensis）同屬異種，是蟲草屬的模式種?，F(xiàn)代研究表明，蛹蟲草和冬蟲夏草有相似的活性成分和藥理作用，能增強(qiáng)人體免疫功能、造血能力和抗輻射能力，有抗腫瘤、抗氧化、抗衰老等作用。隨著蛹蟲草保健功能逐步被消費(fèi)者認(rèn)可，相關(guān)產(chǎn)品逐步實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)子實(shí)體的培養(yǎng)技術(shù)越來(lái)越成為研究的熱點(diǎn)[1-2]，這些研究能增強(qiáng)蛹蟲草產(chǎn)業(yè)的競(jìng)爭(zhēng)力，實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)材料

菌種：2015年春通過(guò)孢子分離方法選育出的母種、原種和栽培種，由揚(yáng)州循天嶺生物科技有限公司提供。

1.1.2 試劑

蛋白胨（北京奧博星）、蟲草素（Sigma）、腺苷（Sigma）、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、檸檬酸三氨、葡萄糖、蔗糖、葡萄糖標(biāo)品、苯酚、濃硫酸、甲醇、無(wú)水乙醇等均為國(guó)產(chǎn)分析純；白砂糖、黃豆粉，購(gòu)置于大潤(rùn)發(fā)超市；土豆粉、蠶蛹粉淘寶網(wǎng)購(gòu)。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-16M低溫高速離心機(jī)，上海滬湘儀；RE-201D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，鄭州特爾儀器設(shè)備有限公司；CU600型電熱恒溫水箱，上海越平科學(xué)儀器有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科技有限公司；BS124S電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司；SOW-25DI冷凍高速微粉機(jī)，山東三清不銹鋼設(shè)備有限公司；Ps-250萬(wàn)能破碎機(jī)，南京威利朗食品機(jī)械有限公司；RY-NSG-20LC超聲波提取濃縮機(jī)，海銳元機(jī)械設(shè)備有限公司；Multiskan Go、Thermo酶標(biāo)儀、高效液相色譜儀上海匯興儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)蛹蟲草產(chǎn)量的影響

保證雞群都能定期喂料、飲水等，這些工作間隔的時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，避免雞感受到饑渴感，最好為雞提供充足的料槽和水槽等，使用的比例為1∶1，如果為1 000只雞，準(zhǔn)備的水槽和料槽最好各10個(gè)。雞舍內(nèi)要保證充足通風(fēng)，保證有害氣體的排出；光照也要充足，夏季時(shí)，一定要避免強(qiáng)光直接照射雞舍。此外，還要保證墊料的充足性，保證飼料密度適宜，夏天少、冬天多，最好為每平方米5～10只。如果為不同類型的雞，要禁止混合養(yǎng)殖。夏季時(shí)，要加強(qiáng)防暑和降溫工作；冬季時(shí)，在雞舍內(nèi)噴水，確保雞舍內(nèi)的濕度適宜。針對(duì)產(chǎn)蛋雞，也要為其提供充足的產(chǎn)蛋箱，增加撿蛋的次數(shù)，發(fā)現(xiàn)破殼蛋要及時(shí)挑出。

單因素試驗(yàn)研究培養(yǎng)基氮源、碳源等對(duì)蛹蟲草產(chǎn)量的影響。氮源黃豆粉、土豆粉、蠶蛹粉、蛋白胨添加量分別設(shè)置為為1 g·瓶-1、2 g·瓶-1、3 g·瓶-1，各3個(gè)水平；碳源蔗糖、葡萄糖、白砂糖添加量分別設(shè)置為3 g·L-1、5 g·L-1、7 g·L-1、9 g·L-1、15 g·L-1、20 g·L-1，各6個(gè)水平，基本培養(yǎng)基為小麥28 g，水或糖營(yíng)養(yǎng)液50 mL。

二因素試驗(yàn)研究氮源和糖源對(duì)產(chǎn)量的影響。氮源黃豆粉、土豆粉、蠶蛹粉的添加量分別設(shè)置為1 g·瓶-1、2 g·瓶-1、3 g·瓶-1，各3個(gè)水平，蛋白胨添加量分別設(shè)置為5 g·L-1、10 g·L-1、15 g·L-1，3個(gè)水平，糖源白砂糖添加量分別設(shè)置為2.5 g·L-1、5 g·L-1、10 g·L-1、15 g·L-1、20 g·L-1，各5個(gè)水平，5個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)菌種為B6栽培種，基本培養(yǎng)基為小麥28 g，營(yíng)養(yǎng)液或水50 mL。

1.3.2 菌種和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)蛹蟲草主要活性物質(zhì)影響

營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)蛹蟲草主要活性物質(zhì)的影響：黃豆粉、土豆粉、蠶蛹粉添加量均分別設(shè)置為1 g·瓶-1、2 g·瓶-1、3 g·瓶-1；營(yíng)養(yǎng)液中葡萄糖、白砂糖、蛋白胨添加量分別設(shè)置為5 g·L-1、10 g·L-1、15 g·L-1、20 g·L-1，各4個(gè)水平，5個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)菌種為B6栽培種，基本培養(yǎng)基為小麥28 g，營(yíng)養(yǎng)液50 mL。

菌種對(duì)蛹蟲草主要活性物質(zhì)的影響：測(cè)13個(gè)菌種培養(yǎng)的子實(shí)體產(chǎn)量和活性物質(zhì)含量，每個(gè)菌種培養(yǎng)10瓶子實(shí)體，基本培養(yǎng)基為小麥28 g，含無(wú)機(jī)鹽類營(yíng)養(yǎng)液50 mL，無(wú)機(jī)鹽類硫酸鎂、檸檬酸三銨、磷酸二氫鉀，濃度均為0.1%。高效液相色譜測(cè)定法測(cè)蟲草素、腺苷含量[3]，采用苯酚硫酸法（NY/T 1676-2008）測(cè)定蛹蟲草多糖含量。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行處理。單因素、二因素方差分析、正交試驗(yàn)結(jié)果極差分析、方差分析、圖表制圖采用SPSS19.0和Excel軟件制作分析。

2 結(jié)果與分析

氮源和碳源對(duì)蛹蟲草子實(shí)體產(chǎn)量的影響見表1。

表1 不同氮源添加物對(duì)蛹蟲草產(chǎn)量的影響Tab.1 Effects of nitrogen source additives in different formula on yield of Cordyceps militaris

由表1可知，每瓶添加1 g蠶蛹粉的培養(yǎng)基，蛹蟲草子實(shí)體產(chǎn)量最高，與土豆粉比較，蠶蛹粉和黃豆粉都能顯著提高蛹蟲草的產(chǎn)量，但不同水平處理的蠶蛹粉和黃豆粉對(duì)產(chǎn)量的影響差異不顯著。不同碳源添加物對(duì)蛹蟲草產(chǎn)量的影響見表2。

表2 不同碳源添加物對(duì)蛹蟲草產(chǎn)量的影響Tab.2 Effects of carbon source additives in different formula on yield of Cordyceps militaris

由表2可知，培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)液中添加20 g·L-1白砂糖的子實(shí)體產(chǎn)量最高，較葡萄糖各處理差異顯著，但不同水平處理的蔗糖和白砂糖對(duì)子實(shí)體產(chǎn)量的影響差異不顯著，不同碳源的不同水平處理對(duì)產(chǎn)量的影響差異不顯著。不同氮源和碳源添加物對(duì)蛹蟲草產(chǎn)量的影響分析見表3、圖1、表4。

由表3、圖1邊際均值（剔除其他變量影響時(shí)算出的均值）可知，隨著碳源白砂糖的添加量增加，子實(shí)體產(chǎn)量上升；氮源黃豆粉和蠶蛹粉能明顯提高子實(shí)體產(chǎn)量，且當(dāng)蠶蛹粉添加量為2 g·瓶-1、白砂糖為20 g·L-1時(shí)，子實(shí)體產(chǎn)量最高，但不同水平的蠶蛹粉、黃豆粉對(duì)子實(shí)體產(chǎn)量差異不顯著。由表4方差分析表可知，碳源、氮源及碳源和氮源的互作對(duì)子實(shí)體的產(chǎn)量具有極顯著的影響。

2.2 營(yíng)養(yǎng)添加物和菌種對(duì)蛹蟲草主要產(chǎn)量和活性物質(zhì)的影響

不同氮源和碳源對(duì)蛹蟲草主要活性物質(zhì)的影響見表5。

由表5可知，培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)液中白砂糖濃度為10 g·L-1時(shí)腺苷和蟲草素含量最高，與其他處理相比差異顯著；氮源添加物土豆粉為1 g·瓶-1時(shí)，子實(shí)體多糖含量最高，與其他處理相比差異顯著。菌種對(duì)蛹蟲草子實(shí)體產(chǎn)量和主要活性物質(zhì)的影響見表6。

由表6可知，菌種B6培養(yǎng)的子實(shí)體產(chǎn)量和多糖含量最高，多糖含量與B、B1、B3相比差異不顯著，與其他菌種相比差異顯著；菌種B1、C6培養(yǎng)子實(shí)體的腺苷含量較高，較其他菌種差異顯著；菌種C6、H1培養(yǎng)的子實(shí)體蟲草素含量較其他菌種差異顯著。

表3 不同氮源和碳源添加物對(duì)蛹蟲草產(chǎn)量的影響Tab.3 Effects of nitrogen and carbon source additives in different formula on yield of Cordyceps militaris

3 討論

蛹蟲草子實(shí)體的產(chǎn)量和品質(zhì)受很多因素的影響，目前研究熱點(diǎn)主要集中在碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽類、維生素、激素等，以往蛹蟲草培養(yǎng)基主要以大米為原料[3-4]，近年來(lái)青稞[5]、小麥[6]為原料的培養(yǎng)基越來(lái)越得到肯定，與之相關(guān)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和菌種對(duì)產(chǎn)量、品質(zhì)的影響研究也受到重視。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)菌種對(duì)蛹蟲草子實(shí)體產(chǎn)量和活性物質(zhì)含量的影響有顯著差異，目前針對(duì)腺苷、蟲草素、多糖指標(biāo)的優(yōu)良菌種的選育取得了一定進(jìn)展，選育出綜合性狀優(yōu)良的菌種，提高蛹蟲草產(chǎn)量和品質(zhì)，將愈來(lái)愈成為生產(chǎn)研究的重點(diǎn)[6-7]。以往的研究[3-5，8-11]證明蠶蛹粉、豆粕、玉米粉、蔗糖、葡萄糖能提高蛹蟲草的產(chǎn)量和活性物質(zhì)含量。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)碳源采用食用白砂糖能提高蛹蟲草產(chǎn)量，與試劑蔗糖相比無(wú)顯著差異，效果比食用葡萄糖好，從生產(chǎn)成本考慮可選擇食用白砂糖作為碳源。蠶蛹粉、豆粕[10-11]能提高蟲草素和腺苷含量，在以往的研究中已有所報(bào)道，但豆粕的品質(zhì)不容易把握，因此本試驗(yàn)直接采用食用黃豆粉，既保證了食品的安全性，在提高產(chǎn)量和活性物質(zhì)含量方面取得了很好的效果，這些結(jié)果對(duì)生產(chǎn)有一定的參考價(jià)值。土豆浸出液對(duì)食用菌菌絲的生長(zhǎng)非常有益，土豆淀粉對(duì)蟲草子實(shí)體的生長(zhǎng)影響的研究還未見報(bào)道，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)每瓶培養(yǎng)基中添加1 g土豆淀粉時(shí)，子實(shí)體多糖含量最高，較其他添加物差異顯著，但單獨(dú)添加土豆淀粉，子實(shí)體產(chǎn)量顯著降低，基于培養(yǎng)基對(duì)功能指標(biāo)的影響，配方研究還有廣闊的探索空間。

圖1 不同碳源和氮源的產(chǎn)量估算邊際均值Fig.1 Production of mean estimate the marginal about different nitrogen and carbon source

表4 不同氮源和碳源添加物對(duì)蛹蟲草產(chǎn)量影響的方差分析Tab.4 Variance analysis of the effects of different formula of nitrogen and carbon source additives on yield of Cordyceps militaris

表5 不同氮源和碳源對(duì)蛹蟲草主要活性物質(zhì)的影響Tab.5 Effects of nitrogen and carbon source additives in different formula on yield of Cordyceps militaris

表6 菌種對(duì)蛹蟲草子實(shí)體產(chǎn)量和主要活性物質(zhì)的影響Tab.6 Effects of spawn on yield and the main active substancesof Cordyceps militaris fruiting body

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Research on Influencing Factor on Yield and the Main Active Substances of Cordyceps militaris

SUN Ye1,2,BAO Jian-zhong1,LIU Hong3,MA Hui3,ZHANG Tian3,CHEN Xiu-lan1
(1.Institute of Agricultural Sciences of Lixiahe Districts,Yangzhou 225007,China; 2.College of Animal Science and Technology,Yangzhou University,Yangzhou 225009,China; 3.Company of Yangzhou Xuntianlin Biological Technology,Jiangsu 225007,China)

The research purposes of this article is to improve the yield and content of active material of Cordyceps militaris fruiting body.With wheat as the basic medium solid culturing C.militaris fruiting body,the influence of carbon source and nitrogen source on yield and main active substance through the single and two factors factor experiment were mainly studied.The single factor experiment on production results showed that the yield of the fruiting body cultured with the culture medium added 1 g silkworm chrysalis powder or nutrient solution with sugar 20 g·L-1was highest,but different levels of subsidiary entity yield difference was not significant on silkworm chrysalis powder,soybean powder.The two factor experiment on production results showed that the yield of the fruiting body cultured with the culture medium added 2 g silkworm chrysalis powder or nutrient solution with sugar 20 g·L-1was highest,and carbon source,nitrogen source and carbon source and nitrogen source against each other had significantly influence on production of C.militaris.The results of single factor experiment on active material showed that the content of adenosine and cordycepin in fruiting body of C.militaris cultured with the culture medium added nutrient solution with sugar 10 g·L-1was highest,and that the content of polysaccharide with the culture medium added 1 g of potatoes was highest,there was a significant difference with other nutritional additive substance.The influence of strains on the yield and the main active substance content was significant difference.

Cordyceps militaris;yield;active substances

S646.9

A

1003-8310（2017）02-0047-05

DOI：10.13629/j.cnki.53-1054.2017.02.013

江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金（CX(14)2137）；中央財(cái)政農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣項(xiàng)目（TG(15)109）。

孫葉（1978-），女，碩士，副研究員，主要從事作物遺傳育種和組織培養(yǎng)研究。E-mail:sunye9999@126.com

**通信作者：陳秀蘭（1956-），女，本科，研究員，主要從事輻射誘變育種研究。E-mail:yzchxl@163.com

2017-01-22