賀兆偉　奚家勤　李玉娥　金洪石　金江華　宋紀(jì)真

摘要：為考察碳源、培養(yǎng)時(shí)間、溫度、起始pH等因素對(duì)產(chǎn)果膠酶疣孢青霉（Penicillium verruculosum Peyron.）菌株TS63-9發(fā)酵產(chǎn)酶的影響，對(duì)該菌株發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，并考察了最優(yōu)發(fā)酵條件下粗酶液在煙絲中的應(yīng)用效果。結(jié)果表明，TS63-9液體發(fā)酵最佳碳源為煙梗粉末，添加量7.5 g/L；最適培養(yǎng)溫度為28 ℃，最適起始pH為6.0；經(jīng)優(yōu)化后，在搖床轉(zhuǎn)速200 r/min條件下培養(yǎng)72 h，粗酶液果膠酶活性達(dá)到832.49 U/mL。將此粗酶液添加應(yīng)用于煙絲后，可顯著降低煙絲果膠含量，感官質(zhì)量得到一定程度改善；通過(guò)掃描電鏡觀察煙絲表面細(xì)胞排列特征，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞間隙變大，細(xì)胞間隙比例提高。

關(guān)鍵詞：疣孢青霉（Penicillium verruculosum Peyron.）；果膠酶；發(fā)酵條件優(yōu)化；煙絲；感官品質(zhì)

中圖分類(lèi)號(hào)：TQ925+.3：TS41 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）04-0686-05

果膠質(zhì)是組成細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的成分之一，是一種存在于相鄰細(xì)胞壁間將細(xì)胞粘著在一起的親水性膠體物質(zhì)。果膠質(zhì)對(duì)煙葉的吸濕性和彈性有一定的作用，但含量過(guò)高時(shí)會(huì)導(dǎo)致焦油生成量的增加[1]。另外，果膠是卷煙煙氣中甲醛、乙醛等揮發(fā)性羰基化合物的一種重要前體物，而甲醛是一種I類(lèi)致癌物，乙醛具有纖毛毒性，可減少肺巨噬細(xì)胞的數(shù)量[2-4]。Zhou等[5]通過(guò)模擬卷煙陰燃的條件對(duì)果膠的裂解行為進(jìn)行了分析，檢測(cè)出裂解氣體產(chǎn)物主要包括CO2、H2O、CO、甲醇、甲烷以及揮發(fā)性羰基化合物。降低煙葉中的果膠質(zhì)含量不僅可改善煙葉品質(zhì)，而且可減少焦油生成量及煙氣有害成分。采用商品化的果膠酶或者產(chǎn)果膠酶微生物及發(fā)酵液均可以降解煙草中的果膠。于建軍等[6]將果膠酶的水溶液噴于煙絲上，有效地降低了煙絲中的果膠含量，并提高了中性香味物質(zhì)的總量。鄧國(guó)賓等[7]利用從優(yōu)質(zhì)煙葉中分離的產(chǎn)果膠酶黃曲霉（Aspergillus flavus Link）DPE-005菌株發(fā)酵產(chǎn)生的酶液來(lái)處理上部烤煙，結(jié)果改善了上部煙的吸味品質(zhì)。另外，醇化片煙中的微生物在煙葉的醇化過(guò)程中起著重要的作用[8]。試驗(yàn)從醇化片煙中篩選出一株產(chǎn)果膠酶疣孢青霉（Penicillium verruculosum Peyron.）菌株TS63-9[9]，對(duì)該菌株的發(fā)酵產(chǎn)酶條件進(jìn)行了優(yōu)化，并考察了發(fā)酵粗酶液在煙絲中的應(yīng)用效果，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

1.1.1 材料 產(chǎn)果膠酶疣孢青霉菌株TS63-9[9]系本實(shí)驗(yàn)室從廣西壯族自治區(qū)賀州市生產(chǎn)的B2F醇化片煙分離而得，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)：CGMCC NO.6747。煙葉樣品為云南省昌寧縣2014年初烤煙葉，品種為紅花大金元，等級(jí)為C3L，采用QS-5實(shí)驗(yàn)室煙葉切絲機(jī)制備煙絲樣品。

1.1.2 試劑及儀器 試劑主要有果膠（美國(guó)Sigma-Aldrich公司）、D-半乳糖醛酸（純度97%，美國(guó)Sigma-Aldrich公司）、DNS試劑（3，5-二硝基水楊酸10 g，氫氧化鈉10 g、酒石酸鉀鈉200 g，苯酚2 g、無(wú)水亞硫酸鈉5 g，用去離子水定容至1 000 mL，棕色瓶貯存；苯酚重蒸，其余為化學(xué)分析純）、果膠酶（Pectinase，活性≥50 000 U/g，BioDEE）。儀器主要有UV-2300紫外分光光度計(jì)（上海天美科學(xué)儀器有限公司）、生化培養(yǎng)箱、振蕩培養(yǎng)箱、冷凍離心機(jī)（日本Hitachi公司）、AA3連續(xù)流動(dòng)分析儀（德國(guó)布朗盧比公司）、TM3000臺(tái)式掃描電子顯微鏡（日本Hitachi公司）。

1.1.3 基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基 成分為果膠5 g/L、蛋白胨 1.0 g/L、KH2PO4 2.0 g/L、（NH4）2SO4 1.4 g/L、尿素 0.3 g/L、MgSO4·7H2O 0.3 g/L、CaCl2 0.3 g/L、FeSO4·7H2O 0.005 g/L、MnSO4·H2O 0.001 56 g/L、ZnSO4·7H2O 0.001 4 g/L、CoCl2·6H2O 0.002 g/L，pH 6.0[10]。

1.2 方法

1.2.1 粗酶液的制備 疣孢青霉菌株TS63-9劃線(xiàn)接種于PDA斜面培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)48～72 h，加入無(wú)菌水振蕩后得到孢子懸浮液（孢子濃度106個(gè)/mL），將孢子懸浮液以5%的接種量接入盛有30 mL產(chǎn)酶培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在28 ℃、200 r/min的條件下?lián)u瓶發(fā)酵72 h；發(fā)酵產(chǎn)物在4 ℃、6 000 r/min條件下離心10 min，上清液即為粗酶液。

1.2.2 果膠酶活性測(cè)定 采用DNS顯色法[11]測(cè)定果膠酶活性，在10 mL具塞刻度試管中加入1.0 mL 0.5%果膠溶液（pH 4.0檸檬酸緩沖液配制），加入0.5 mL粗酶液，55 ℃水浴反應(yīng)40 min后，加入3 mL DNS溶液，沸水浴10 min，取出后用自來(lái)水迅速冷卻至室溫，定容至10 mL。以滅活酶液為對(duì)照，在540 nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算還原糖含量。在上述反應(yīng)條件下，以每小時(shí)水解果膠底物產(chǎn)生1 mg半乳糖醛酸的酶量為1個(gè)酶活性單位，用U/mL表示。

1.3 發(fā)酵條件優(yōu)化

分別以碳源、培養(yǎng)時(shí)間、溫度、起始pH為因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，比較對(duì)疣孢青霉菌株TS63-9發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。

1.3.1 碳源種類(lèi)對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 在產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，分別用5 g/L的葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、D-半乳糖醛酸、玉米粉、麩皮、橘皮粉、煙梗粉末代替果膠作為碳源，接種疣孢青霉菌株TS63-9，在28 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)72 h，測(cè)定不同碳源種類(lèi)對(duì)果膠酶活性的影響，以確定最適合碳源。

1.3.2 碳源濃度對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響 將碳源濃度分別設(shè)為2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 g/L，接種疣孢青霉菌株TS63-9，在28 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)72 h，測(cè)定不同碳源濃度對(duì)果膠酶活性的影響，以確定最佳碳源濃度。

1.3.3 培養(yǎng)時(shí)間 將疣孢青霉菌株TS63-9接種于最佳碳源的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在28 ℃、200 r/min條件下進(jìn)行液體發(fā)酵，每隔24 h測(cè)定一次果膠酶活性，比較培養(yǎng)時(shí)間對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。

1.3.4 溫度 將疣孢青霉菌株TS63-9接種于最佳碳源的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，分別于20、24、28、32、36、40 ℃環(huán)境里、搖床轉(zhuǎn)速200 r/min的條件下培養(yǎng)72 h，測(cè)定不同溫度對(duì)果膠酶活性的影響。

1.3.5 起始pH 分別調(diào)節(jié)培養(yǎng)基起始pH為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，接種疣孢青霉菌株TS63-9后，在28 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)72 h，測(cè)定不同起始pH對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。

1.4 粗酶液應(yīng)用效果分析

1.4.1 粗酶液應(yīng)用方式 煙絲于22 ℃、相對(duì)空氣濕度60%條件下平衡48 h以上，按照表1的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，用喉頭噴霧器（接空壓泵）將最優(yōu)發(fā)酵條件下獲取的粗酶液均勻噴于煙絲上，每個(gè)處理重復(fù)3次。噴后置于塑料袋內(nèi)密封，放于烘箱中40 ℃條件下處理8 h，再80 ℃處理20 min，使酶失活。

1.4.2 測(cè)定項(xiàng)目及方法 取少量樣品于40 ℃干燥12 h，磨碎過(guò)40目篩后測(cè)定果膠含量[12]，根據(jù)文獻(xiàn)[13]測(cè)定煙末含水率。參照文獻(xiàn)[14]要求，由鄭州煙草研究院評(píng)吸專(zhuān)家委員會(huì)對(duì)樣品進(jìn)行感官質(zhì)量評(píng)吸，并進(jìn)行定性描述。利用TM3000掃描電鏡觀察煙絲表面細(xì)胞排列特征，用Photoshop CS5軟件對(duì)所得電鏡圖片進(jìn)行處理，計(jì)算細(xì)胞間隙的比例[15]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用Microsoft Office Excel 2007程序處理，并用其制表和繪圖；運(yùn)用SPSS 22統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行Duncan′s 新復(fù)極差法多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 疣孢青霉菌株TS63-9發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.1.1 碳源種類(lèi)及濃度對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響 不同碳源對(duì)疣孢青霉菌株TS63-9產(chǎn)酶能力的影響情況見(jiàn)表2。從表2可見(jiàn)，TS63-9在供試碳源中均能產(chǎn)生果膠酶，但不同碳源的果膠酶活性有很大差異。以葡萄糖、蔗糖、D-半乳糖醛酸、可溶性淀粉作為惟一碳源時(shí)，發(fā)酵液的果膠酶活性均低于10 U/mL；以成分較復(fù)雜的玉米粉、麩皮作為惟一碳源時(shí)，酶活性有所提高；而以果膠、橘皮粉、煙梗粉末作為惟一碳源進(jìn)行發(fā)酵后，酶活性大大提高，尤其以煙梗粉末作為碳源的產(chǎn)酶效果最好，果膠酶活性達(dá)到了814.32 U/mL，與其他碳源的差異均達(dá)到了極顯著差異（P<0.01）。果膠酶是一種誘導(dǎo)酶，利用真菌進(jìn)行液體發(fā)酵時(shí)，一定量的含果膠底物有利于產(chǎn)果膠酶。煙梗作為煙草工業(yè)的副產(chǎn)物，較易獲得，且含有的成分和種類(lèi)與煙葉基本一致，因此選用煙梗粉末作為果膠酶液體發(fā)酵底物是最佳的選擇。

不同添加量的煙梗粉末對(duì)疣孢青霉菌株TS63-9產(chǎn)果膠酶能力的影響情況見(jiàn)圖1。從圖1可見(jiàn)，當(dāng)煙梗粉末添加量為7.5 g/L時(shí)，果膠酶活性最大；而當(dāng)添加量高于7.5 g/L時(shí)，果膠酶活性變化不大，且隨著繼續(xù)增加呈現(xiàn)出下降的變化趨勢(shì)；說(shuō)明煙梗粉末添加量在7.5 g/L時(shí)是最合適的。

2.1.2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)疣孢青霉菌株TS63-9產(chǎn)酶能力的影響情況見(jiàn)圖2。從圖2可見(jiàn)，在搖瓶發(fā)酵前期，由于孢子數(shù)量相對(duì)較少，代謝活動(dòng)較弱，酶活性非常低；隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，酶活性急劇升高，在72 h時(shí)達(dá)到最高值。隨后隨著營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗以及菌株代謝活動(dòng)的減弱，酶活性趨于穩(wěn)定，整體上呈現(xiàn)出逐漸降低的變化趨勢(shì)。

2.1.3 溫度對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響 培養(yǎng)溫度對(duì)疣孢青霉菌株TS63-9產(chǎn)酶能力的影響情況見(jiàn)圖3。從圖3可見(jiàn)，疣孢青霉菌株TS63-9在不同的培養(yǎng)溫度下產(chǎn)酶能力有較大的差異，果膠酶活性隨著溫度的升高而變化大，在28 ℃時(shí)達(dá)到最大值，此時(shí)TS63-9的產(chǎn)酶能力最強(qiáng)。但隨著培養(yǎng)溫度繼續(xù)升高，酶活性顯著降低，產(chǎn)酶能力減弱。

2.1.4 培養(yǎng)基起始pH對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響 培養(yǎng)基起始pH對(duì)疣孢青霉菌株TS63-9產(chǎn)果膠酶的影響情況見(jiàn)圖4。從圖4可見(jiàn)，菌株在pH 5.0～7.0具有較強(qiáng)的產(chǎn)酶能力，以pH為6.0時(shí)果膠酶活性最高，而pH大于7.0或者小于5.0均不利于菌株產(chǎn)果膠酶。

2.1.5 優(yōu)化的發(fā)酵條件測(cè)粗酶液果膠酶活性 將上述單因素試驗(yàn)得到的最佳條件（碳源為煙梗粉末7.5 g/L，最適培養(yǎng)溫度為28 ℃，最適起始pH為6.0，在搖床轉(zhuǎn)速200 r/min條件下培養(yǎng)72 h）組合在一起，測(cè)定疣孢青霉菌株TS63-9粗酶液的酶活性，結(jié)果粗酶液的果膠酶活性達(dá)到832.49 U/mL，比果膠為底物的果膠酶活性227.56 U/mL提高了約2.66倍。

2.2 TS63-9果膠酶在煙絲中的應(yīng)用效果

2.2.1 粗酶液對(duì)煙絲果膠含量的影響 疣孢青霉菌株TS63-9粗酶液添加應(yīng)用于煙絲后，對(duì)煙絲果膠含量的影響情況見(jiàn)圖5。從圖5可見(jiàn)，與空白對(duì)照相比，噴施TS63-9發(fā)酵粗酶液能不同程度地降低煙絲中的果膠含量。其中T2、T4、T6處理的果膠含量分別為7.99%、5.39%、4.96%，比對(duì)照的果膠含量9.03%分別減少了11.5%、40.3%、45.1%，隨著酶液添加量的增多而減少，與對(duì)照差異極顯著（P<0.01）；T1、T3、T5處理的煙絲果膠含量與對(duì)照相比幾乎沒(méi)有發(fā)生變化，差異不顯著（P>0.05），說(shuō)明高溫使酶失活，失去了降解果膠的能力。另外，T4、T6處理與T2處理相比，果膠含量變化明顯，差異極顯著（P<0.01）；而T4與T6處理之間差異不顯著（P>0.05），可見(jiàn)酶添加量達(dá)到一定的水平后，果膠含量減少的趨勢(shì)在變緩。

2.2.3 粗酶液對(duì)煙絲感官評(píng)吸質(zhì)量的影響 具有疣孢青霉菌株TS63-9粗酶液正常酶活性的處理對(duì)煙絲感官質(zhì)量的影響情況見(jiàn)表3。從表3可見(jiàn)，不同處理煙絲的感官質(zhì)量整體差異不大，屬于“中等”檔次。其中，T2處理的煙絲與對(duì)照相比感官品質(zhì)沒(méi)有發(fā)生變化；T4處理與對(duì)照相比感官質(zhì)量明顯變好，表現(xiàn)為香氣量有所增加，相對(duì)飽滿(mǎn)，濃度增加，煙氣濃郁；而T6處理與對(duì)照相比感官質(zhì)量有所下降，主要表現(xiàn)為刺激性增大，可能是由于粗酶液添加量過(guò)多、導(dǎo)致煙葉化學(xué)成分變化較大、影響了內(nèi)在成分的協(xié)調(diào)性所致。

2.2.4 煙絲表面細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)特征的掃描電鏡觀察 疣孢青霉菌株TS63-9發(fā)酵粗酶液應(yīng)用于煙絲后，果膠含量明顯降低，其表面細(xì)胞排列結(jié)構(gòu)也發(fā)生了變化；不同處理煙絲表面掃描電鏡圖像情況見(jiàn)圖6。從圖6可以看出，對(duì)照以及T1、T3、T5處理的細(xì)胞排列緊密，T2、T4、T6處理的表面細(xì)胞排列疏松，細(xì)胞間出現(xiàn)間隙，且空隙的平均大小隨粗酶液添加量的增多而變大。利用Photoshop CS5圖像處理軟件計(jì)算放大600倍的圖像中細(xì)胞間隙比例，結(jié)果見(jiàn)圖7、表4。由圖7、表4可以看出，經(jīng)粗酶液處理后，煙絲表面細(xì)胞的間隙比例明顯變大，T2、T4、T6處理的細(xì)胞間隙比例分別比對(duì)照提高了53.30%、84.14%、112.94%。

3 小結(jié)與討論

1）通過(guò)對(duì)產(chǎn)果膠酶疣孢青霉菌株TS63-9發(fā)酵條件優(yōu)化試驗(yàn)，獲得了其液體發(fā)酵優(yōu)化條件為碳源煙梗粉末7.5 g/L、培養(yǎng)溫度28 ℃、培養(yǎng)基起始pH 6.0、在搖床轉(zhuǎn)速200 r/min條件下培養(yǎng)時(shí)間72 h，其余不變。在此條件下，TS63-9果膠酶活性為832.49 U/mL，比優(yōu)化前提高了約2.66倍。說(shuō)明煙梗粉末作為碳源對(duì)TS63-9產(chǎn)果膠酶有很大的影響，能夠大大提高菌株的產(chǎn)酶能力。在微生物發(fā)酵產(chǎn)果膠酶時(shí)，以往多利用水果殘?jiān)鐧幟势16]、橘皮[17]，玉米漿[18]以及甜菜渣[19]等復(fù)合基質(zhì)代替果膠作為碳源，而以煙草基質(zhì)為底物進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)果膠酶的相關(guān)研究未見(jiàn)報(bào)道。

2）在最優(yōu)發(fā)酵條件下獲得的疣孢青霉菌株TS63-9發(fā)酵粗酶液處理煙絲后，煙絲的果膠含量明顯降低；感官品質(zhì)在一定程度上得到改善，主要表現(xiàn)為香氣量有所增加，煙氣濃度增大，飽滿(mǎn)濃郁；利用掃描電鏡觀察煙絲表面細(xì)胞排列特征，發(fā)現(xiàn)處理后煙絲細(xì)胞間隙變大，細(xì)胞排列更加疏松。

3）果膠作為一種大分子物質(zhì)，與卷煙煙氣中多種有害成分有關(guān)，關(guān)于疣孢青霉菌株TS63-9對(duì)卷煙煙氣中相關(guān)有害成分含量的影響，有待下一步深入試驗(yàn)，并且TS63-9發(fā)酵粗酶液的安全性評(píng)價(jià)也需同步研究。

4）試驗(yàn)是在實(shí)驗(yàn)室條件下對(duì)微生物降解煙絲果膠含量進(jìn)行了初步探索，作用條件及應(yīng)用范圍與實(shí)際生產(chǎn)還存在一定差異；下一步將模擬卷煙生產(chǎn)工藝，結(jié)合制絲工序，進(jìn)一步探討添加量、時(shí)間、溫度等條件對(duì)疣孢青霉菌株TS63-9果膠酶降解煙草（煙葉、煙梗等）果膠含量的影響。

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