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        河南不同產(chǎn)區(qū)烤煙代謝物區(qū)域特征分析

        2023-12-20 13:50:08周漢紅孫書斌羅先學(xué)肖金勝方武軍
        湖北畜牧獸醫(yī) 2023年11期
        關(guān)鍵詞:社旗縣宜陽縣泌陽縣

        周漢紅,孫書斌,羅先學(xué),肖金勝,甘 韜,方武軍

        (1.湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司,武漢 430040;2.湖南省煙草專賣局張家界市公司,湖南 張家界 427000)

        河南產(chǎn)區(qū)烤煙年生產(chǎn)量在10 萬t 以上,是全國重要的濃香型卷煙優(yōu)質(zhì)產(chǎn)區(qū),在卷煙品牌中發(fā)揮重要的配方作用,但河南各產(chǎn)區(qū)空間跨度大,土壤和氣候條件也存在較大區(qū)別,導(dǎo)致煙葉風(fēng)格在產(chǎn)區(qū)間存在一定的差異。學(xué)者對(duì)河南煙葉進(jìn)行了大量研究,但主要集中在施肥、烘烤等煙葉生產(chǎn)方面[1-5]以及物理特性、化學(xué)成分等質(zhì)量方面[6-13],對(duì)各產(chǎn)區(qū)煙葉代謝物質(zhì)方面的研究比較少。

        煙葉在成熟和烘烤過程中存在一系列復(fù)雜的生化反應(yīng),其中代謝物的種類和含量對(duì)烤煙的感官質(zhì)量有重要的影響[14]。非靶向代謝組學(xué)旨在通過考慮數(shù)據(jù)集中存在的所有信息,在生物系統(tǒng)中收集盡可能多的代謝物的信息,廣泛應(yīng)用于植物代謝組學(xué)分析。其主要技術(shù)有液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)和毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用(CE-MS)等[15-17],其中液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)具有可靠的靈敏度、較高的精度和分析方法的魯棒性,是靈敏度和選擇性的最佳組合,因此在大多數(shù)代謝組學(xué)方法中必不可少。本研究運(yùn)用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)方法對(duì)河南省駐馬店市泌陽縣、南陽市社旗縣、信陽市羅山縣、洛陽市宜陽縣和三門峽市盧氏縣5 個(gè)產(chǎn)區(qū)的C3F 進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)分析,探索不同產(chǎn)區(qū)煙葉的關(guān)鍵差異代謝產(chǎn)物差異,旨在更好地指導(dǎo)煙葉生產(chǎn)和工業(yè)調(diào)撥。

        1 材料與方法

        1.1 試驗(yàn)樣品

        試驗(yàn)對(duì)象為河南省駐馬店市泌陽縣、南陽市社旗縣、信陽市羅山縣、洛陽市宜陽縣、三門峽市盧氏縣5 個(gè)產(chǎn)區(qū)2021 年的C3F 樣品(表1),把剛調(diào)制完下炕的煙葉樣品立即放入液氮中冷凍,樣品郵寄到北京諾禾致源科技股份有限公司實(shí)驗(yàn)室,-80 ℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

        表1 樣本詳情

        1.2 試驗(yàn)儀器

        本試驗(yàn)委托北京諾禾致源科技股份有限公司檢測(cè)。Q Exactive?HF-X 質(zhì)譜儀、Vanquish UHPLC 色譜儀,德國賽默飛世爾科技公司;Hypesil GOLD Column 色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.9 μm),美國賽默飛世爾科技公司;D3024R 型低溫離心機(jī),美國Scilogex品牌。甲醇、甲酸、醋酸銨均購于美國賽默飛世爾科技公司,超純水購于德國Merck 公司,以上試劑純度均為色譜級(jí)。

        1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

        本項(xiàng)目基于液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)技術(shù)進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)研究,試驗(yàn)設(shè)計(jì)主要包括樣本的代謝物提取、LC-MS/MS 檢測(cè)以及數(shù)據(jù)分析等。由于同一種代謝物可能帶正電荷或者負(fù)電荷,所以分別對(duì)帶正電荷和負(fù)電荷的代謝物進(jìn)行檢測(cè)和分析。

        1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

        首先將質(zhì)譜檢測(cè)得到的原始文件(.raw)導(dǎo)入Compound Discoverer 3.1(CD)軟件進(jìn)行譜圖處理及數(shù)據(jù)庫搜庫,得到代謝物的定性定量結(jié)果,然后對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控,保證數(shù)據(jù)結(jié)果的準(zhǔn)確度、可靠性。再對(duì)代謝物進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析,包括主成分分析(PCA)、偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)等,揭示不同組別代謝物的差異。利用層次聚類(HCA)和代謝物相關(guān)性分析,揭示樣本之間及代謝物之間的關(guān)系。最后,通過代謝通路等功能分析解釋代謝物相關(guān)的生物學(xué)意義。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 各區(qū)域C3F 等級(jí)煙葉代謝組的多元統(tǒng)計(jì)分析

        為了探究C3F 代謝物在泌陽縣、社旗縣、羅山縣、宜陽縣和盧氏縣的區(qū)域特征,對(duì)烘烤后的煙葉進(jìn)行代謝組測(cè)序和分析。正離子代謝物和負(fù)離子代謝物的主成分分析結(jié)果如圖1 所示。由圖1 可知,5 個(gè)地區(qū)間的煙葉代謝物特征差異明顯,但各地區(qū)內(nèi)部樣本差異較小,且分離趨勢(shì)均處在95%置信區(qū)間內(nèi)。比較5 個(gè)地區(qū)發(fā)現(xiàn),泌陽縣和社旗縣的煙葉代謝物主成分比較相近,宜陽縣和盧氏縣的煙葉代謝物主成分比較相近,而羅山縣與其他地區(qū)的煙葉代謝物主成分相對(duì)差異較大。

        圖1 帶正電荷代謝物(a)與帶負(fù)電荷代謝物(b)主成分分析結(jié)果

        2.2 主要代謝物及各區(qū)域特異代謝物表達(dá)分析

        基于所有代謝物的表達(dá)豐度數(shù)據(jù),利用單因素方差分析對(duì)樣本組間進(jìn)行差異比較,按照標(biāo)準(zhǔn)差(s)進(jìn)行排序,以P<0.05 為閾值,對(duì)代謝物進(jìn)行差異表達(dá)的篩選,得到各區(qū)域差異表達(dá)代謝物數(shù)量(表2),泌陽縣、社旗縣、羅山縣、宜陽縣和盧氏縣的差異代謝物分別為477、411、319、186 和227 種,其中差異代謝物為正離子代謝物和負(fù)離子代謝物總和。圖2 為差異表達(dá)代謝物可視化熱圖,由圖2 可以看出,泌陽縣和社旗縣的差異代謝物的豐度比較相似,宜陽縣和盧氏縣代謝物比較相似(黑框標(biāo)識(shí))。基于差異代謝物豐度,通過皮爾森相關(guān)性分析(表3)發(fā)現(xiàn),泌陽縣和社旗縣、宜陽縣和盧氏縣煙葉代謝物相關(guān)性較高(P<0.05)。

        圖2 差異表達(dá)代謝物豐度可視化結(jié)果

        表2 各區(qū)域差異表達(dá)代謝物數(shù)量(單位:種)

        表3 各區(qū)域煙葉代謝物皮爾森相關(guān)性分析

        基于以上差異分析的結(jié)果,得到前20 種差異表達(dá)正離子代謝物(表4)和前20 種差異表達(dá)負(fù)離子代謝物(表5)。其中前20 種差異表達(dá)正離子代謝物包括14 種酸,分別為DL-色氨酸、葡萄糖酸、檸檬酸、L-蘇糖酸、琥珀酸、水楊酸、富馬酸、D-α-羥基戊二酸、2R-2,3-二羥基丙酸、DL-4-羥基苯乳酸、檸康酸、2-羥基己酸、N-乙?;?D-別異亮氨酸和N-乙酰-DL-丙氨酸;1 種亞胺;1 種酚;1 種醇;1 種酰胺和2 種內(nèi)酯。前20 種差異表達(dá)負(fù)離子代謝物包括7 種酸類,3 種堿,2 種酮等物質(zhì)。

        表4 前20 種差異表達(dá)正離子代謝物

        表5 前20 種差異表達(dá)負(fù)離子代謝物

        圖3 為葡萄糖酸、L-蘇糖酸、富馬酸、D-甘露醇、D-谷氨酰胺、N-乙?;?D-別異亮氨酸的豐度柱狀圖。通過L-蘇糖酸和富馬酸的豐度圖可以看出,其在泌陽縣和社旗縣的豐度比較相近。結(jié)果支持本文前述猜想。

        圖3 6 種差異代謝物豐度

        2.3 基于KEGG 數(shù)據(jù)庫的代謝通路分析

        為確定5 個(gè)區(qū)域C3F 等級(jí)煙葉差異代謝物的主要生物學(xué)功能,對(duì)這些差異代謝物進(jìn)行了KEGG 通路富集分析(以P≤0.05 為閾值),如圖4 所示。結(jié)果表明,差異代謝物主要富集在氨基酸代謝相關(guān)通路中。圖5 以三門峽市盧氏縣C3F 等級(jí)煙葉為例,色胺酸代謝通路表達(dá)差異最顯著,該條代謝通路富集到的差異代謝物為吲哚和吲哚酚,主要集中在吲哚和吲哚酚生物合成上(圖6)。

        圖4 KEGG 通路富集分析

        圖5 三門峽市盧氏縣C3F 等級(jí)煙葉KEGG 富集氣泡

        圖6 富集差異代謝物代謝路徑

        3 結(jié)論

        1)泌陽縣和社旗縣煙葉代謝物相關(guān)性比較高,宜陽縣和盧氏縣相關(guān)性比較高,羅山縣與其他區(qū)域代謝物均相差較大??梢姷乩砦恢孟嘟?,氣候相近,代謝物相關(guān)性高;地理位置遠(yuǎn),氣候相差較大,代謝物相關(guān)性低。

        2)KEGG 富集結(jié)果顯示,差異代謝物主要富集在氨基酸代謝相關(guān)通路中。以三門峽市盧氏縣C3F等級(jí)煙葉為例,以色氨酸為底物合成吲哚和吲哚酚生物合成途徑是三門峽市盧氏縣C3F 等級(jí)煙葉差異最顯著的代謝途徑。

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