孫 丹，陳為凱，何 非，王 軍，谷會巖,*

（1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，葡萄與葡萄酒研究中心，北京 100083）

HPLC-MS/MS法測定甜櫻桃花色苷與非花色苷酚的組成與含量

孫 丹1，陳為凱2，何 非2，王 軍2，谷會巖1,*

（1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，葡萄與葡萄酒研究中心，北京 100083）

應(yīng)用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測定甜櫻桃‘雷尼’、‘紅艷’、‘紅燈’3 個品種的花色苷與非花色苷酚的組成與含量?；ㄉ盏臋z測條件為：色譜柱Kromasil 100-5C18柱（250 mm×4.6 mm，6.5 μm），流動相為水-甲酸-乙腈溶液，梯度洗脫，進(jìn)樣量30 μL，流速1.00 mL/min，柱溫50 ℃，檢測波長525 nm；非花色苷酚的檢測條件為：色譜柱Zorbax SB-C18（50 mm×3.0 mm，1.8 μm），流動相為1%乙酸-1%乙酸-乙腈溶液，梯度洗脫，進(jìn)樣量2 μL，流速1.00 mL/min，柱溫25 ℃，檢測波長280 nm。結(jié)果表明，3 個品種共檢測到9 種花色苷，主要為花青素-3-蕓香糖苷和花青素-3-葡萄糖苷，其在‘紅艷’果皮、‘雷尼’果皮、‘紅燈’果皮、‘紅燈’果肉中的含量分別為5.21、2.51、75.70、7.40 mg/g和0.09、0.07、3.57、0.34 mg/g。非花色苷酚類化合物檢測出了蘆丁與山柰酚-3-蕓香糖苷這2 種化合物，其在‘紅艷’果皮、‘雷尼’果皮、‘紅燈’果皮中的含量分別為0.30、0.63、0.74 mg/g和1.17、2.91、2.37 mg/g。

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用；甜櫻桃；花色苷；非花色苷酚

櫻桃屬薔薇科（Rosaceae）櫻桃屬植物[1]。成熟的櫻桃果皮薄，顏色誘人，帶有深紅色或紫色的光澤，也有一些櫻桃品種果皮為黃色。因櫻桃誘人的顏色、特有的香氣、獨(dú)特的味道和保健功能，而備受人們喜愛[2-7]。不同顏色的品種其口感不同，紅色品種通常較酸、花色苷和總酚含量高：黃色品種通常較甜，花色苷和總酚含量低[8]。

酚類物質(zhì)是櫻桃漿果中一類重要的次生代謝產(chǎn)物，可以分為花色苷和非花色苷酚兩大類[9]?；ㄉ帐菣烟业某噬镔|(zhì)[10]。目前，國內(nèi)外對櫻桃中花色苷的研究主要集中在提取分離、結(jié)構(gòu)鑒定、穩(wěn)定性和生理功能等方面。Valentina等[11]發(fā)現(xiàn)，酸櫻桃中的花色苷主要為花青素-3-葡萄糖苷、花青素-3-葡萄糖基蕓香糖苷、花青素-3-槐糖苷和花青素-3-蕓香糖苷。而甜櫻桃的花色苷研究報道較少，尤其是針對甜櫻桃果皮與果肉分離后用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）技術(shù)檢測其酚類物質(zhì)含量的相關(guān)研究報道。櫻桃果實(shí)所含的植物多酚類物質(zhì)是櫻桃果實(shí)風(fēng)味的物質(zhì)基礎(chǔ)[12]。利用如紫外分光光度法[13]、酒石酸亞鐵比色[14]、福林酚法[15]等測定植物多酚的方法報道也很多，相對而言HPLC-MS/MS[16-20]技術(shù)其準(zhǔn)確性更強(qiáng)。據(jù)此，本實(shí)驗(yàn)以甜櫻桃‘雷尼’、‘紅艷’、‘紅燈’3 個品種果實(shí)為試材，應(yīng)用HPLC-MS/MS技術(shù)分別測定其‘雷尼’果皮、‘紅艷’果皮、‘紅燈’果皮以及‘紅燈’果肉的花色苷與非花色苷酚類物質(zhì)，為進(jìn)一步研究櫻桃多酚類物質(zhì)的構(gòu)成和含量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘紅艷’、‘雷尼’、‘紅燈’3 個甜櫻桃品種的果實(shí)采自北京市懷柔區(qū)廟城鎮(zhèn)碧野天湖生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司櫻桃園（東經(jīng)116°61′），樹齡為5 a生，砧木為‘吉塞拉3’（Gisela 3），栽植密度為（3×5） m。果園田間管理按照GB/T 19630—2005《有機(jī)產(chǎn)品》進(jìn)行。櫻桃果實(shí)樣品采于2015年，在果實(shí)成熟時每品種隨機(jī)采集300 個果實(shí)，放置于塑料盒中，并立即運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室用液氮冷凍，置于-80 ℃保存待測。

甲酸、甲醇、乙酸乙酯（均為分析純） 北京化工廠；槲皮素、二甲花翠素-3-葡萄糖苷 美國Sigma公司；甲醇、乙酸、乙腈（均為色譜級） 美國Fisher公司；超純水采用Milli-Q（Milipore, Bedford, MA）系統(tǒng)制備。

1.2 儀器與設(shè)備

902-ULTS超低溫冰箱 美國賽默飛公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；SHZ-88A水浴振蕩器 大倉市儀器有限公司；TDL-5-A低溫離心機(jī) 上海飛鴿儀器有限公司；SG3200HBT超聲波清洗機(jī) 上海冠特超聲儀器有限公司；FD-1A-50凍干燥機(jī) 北京必瑞克生物科技有限公司；1100系列LC/ MSD Trap-VL液相色譜-離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀（配有G1379A真空溶劑脫氣機(jī)、G1311A四元高壓梯度泵、G1313A自動進(jìn)樣器、G1316A柱溫箱、G1315A二極管陣列檢測器）、1200系列LC/MSD Trap-VL高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（配有G1322A真空脫氣機(jī)、G1312B二元高壓梯度泵、G1367C自動進(jìn)樣器、G1316B柱溫箱、G1314C可變波長檢測器） 美國安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 櫻桃花色苷提取檢測

將櫻桃于液氮條件下剝離果皮、果肉后，液氮保護(hù)條件下破碎成粉末狀，真空冷凍干燥24 h。準(zhǔn)確稱取0.500 g（±0.005 g）櫻桃果皮或果肉干粉，加體積分?jǐn)?shù)2%甲酸-甲醇溶液10 mL；功率100 W、頻率59 Hz條件下超聲10 min；25 ℃、130 r/min條件下?lián)u床浸提30 min，然后8 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液于100 mL圓底燒瓶中。重復(fù)提取5 次，合并上清液，25 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用花色苷定溶劑（流動相A-B體積比9∶1）定容至10 mL，提取過程全程控溫25 ℃以條件下，提取液放置于-40 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。每個樣品進(jìn)行3 組獨(dú)立的技術(shù)重復(fù)。所測物質(zhì)含量以干質(zhì)量計。

采用Agilent 1100系列的LC/MSD Trap-VL液相色譜-離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行櫻桃果皮與果肉花色苷的分析。

HPLC條件：色譜柱為Kromasil 100-5C18柱（250 mm×4.6 mm，6.5 μm）；進(jìn)樣量30 μL；樣品測定前經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾；流動相A：水-甲酸-乙腈（92∶2∶6，V/V）溶液；流動相B：水-甲酸-乙腈（44∶2∶54，V/V）溶液；洗脫程序：0～18 min，10%～25% B；18～20 min，25% B；20～30 min，25%～4 0% B；30～35 m i n，40%～70% B；35～40 min，70%～100% B；流速1.00 mL/min；柱溫50℃；檢測波長525 nm。

MS條件：電噴霧離子源；正離子模式；質(zhì)量掃描范圍m/z 100～1 000；霧化器壓力35 psi；干燥氣流速10 L/min；干燥氣溫度350 ℃[21]。

樣品的定性依據(jù)中國農(nóng)業(yè)大學(xué)葡萄酒研究中心建立的譜庫并結(jié)合文獻(xiàn)報道進(jìn)行判定，通過比對譜庫中HPLC-UV-MS/MS圖譜中的質(zhì)譜信息、光譜信息和保留時間確定花色苷種類。定量方法采用二甲花翠素-3-葡萄糖苷為標(biāo)準(zhǔn)物，建立0.5～500 mg/L之間花色苷定量回歸方程：Y=6.356 46X-5.746 04，R=0.999 5，相關(guān)系數(shù)在0.998以上，表明在標(biāo)樣質(zhì)量濃度0.5～500 mg/L范圍內(nèi)，色譜圖峰面積和二甲花翠素-3-葡萄糖苷含量有良好的線性關(guān)系，滿足定量條件。

1.3.2 櫻桃非花色苷酚提取檢測

分別準(zhǔn)確稱取5.000 g（±0.005 g）櫻桃果皮、果肉凍干粉于錐形瓶中，加入5 mL蒸餾水和45 mL乙酸乙酯，在室溫條件下，130 r/min水浴搖床萃取30 min，轉(zhuǎn)移上清液于250 mL圓底燒瓶中，重復(fù)提取5 次，合并上清液，30 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用甲醇溶解定容至5 mL，置于-40 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。每個樣品進(jìn)行3 組獨(dú)立的技術(shù)重復(fù)。樣品測定前經(jīng)0.22 μm尼龍膜過濾。所測物質(zhì)含量以干質(zhì)量計。

采用Agilent 1200系列HPLC-MSD trap VL高效液相色譜-離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀，配有G1314C可變波長檢測器。

HPLC條件：色譜柱為Zorbax SB-C18（50 mm× 3.0 mm，1.8 μm）；進(jìn)樣量為2 μL；流動相A：1%乙酸溶液；流動相B：1%乙酸-乙腈溶液；洗脫程序：0～10 min，5% B；10～18 min，8% B；18～40 min，40% B；40～50 min，15% B；50～53 min，20% B；53～58 min，30% B；58～62 min，50% B；62～66 min，100% B；流速1.00 mL/min；柱溫25 ℃；檢測波長280 nm。

MS條件：電噴霧離子源；負(fù)離子模式；質(zhì)量掃描范圍m/z 0～1 000；霧化氣壓力30 psi；干燥氣流速10 L/min；干燥氣溫度325 ℃；離子阱離子電荷控制量為30 000 units；最大累計時間為300 ms；碰撞誘導(dǎo)解離的MS/MS誘導(dǎo)碰撞電壓為1.0 V[22-23]。

定量方法：配制10 個質(zhì)量濃度水平的槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個水平重復(fù)3 次，以各組分的平均峰面積（Y）對質(zhì)量濃度（mg/L）（X）建立回歸方程。黃酮醇類采用槲皮素為標(biāo)準(zhǔn)品，回歸方程：Y=（X-9.942 8）/ 3.230 7，R=0.999 4，該種標(biāo)準(zhǔn)非花色苷酚類化合物在相應(yīng)的線性范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)均在0.998以上，表明在一定的標(biāo)樣質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，滿足定量條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 櫻桃花色苷成分檢測結(jié)果

圖1 ‘紅艷’果皮（A）、‘雷尼’果皮（B）、‘紅燈’果皮（C）和‘紅燈’果肉（D）花色苷提取物HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms of anthocyanin extracts from skins of‘Hongyan’ (A), ‘Rainier’ (B), ‘Hongdeng’ (C) cherries and pulp of ‘Hongdeng’ cherries (D)

如圖1所示，根據(jù)保留時間依次可推測出，‘紅艷’果皮花色苷的出峰時間為5.68、5.99 min，‘雷尼’果皮花色苷的出峰時間為4.00、5.48、6.79、7.97 min，‘紅燈’果皮花色苷的出峰時間為4.36、5.79、6.01、7.41、8.82、9.40、10.17 min，‘紅燈’果肉花色苷的出峰時間為5.87、6.19、8.50、9.56 min。所有檢測結(jié)果中只有峰4、5是這4 種材料的共有化合物，且為這3 個甜櫻桃品種的主要花色苷。

圖2 櫻桃不同保留時間的花色苷組分MS圖Fig.2 Mass spectra of anthocyanin components with different retention times

植物中花色素主要有6 種，即花青素、花翠素、花葵素、甲基花青素、甲基花翠素及二甲花翠素[24]。如圖2所示，由峰4、5二級質(zhì)譜信號m/z 287，可判定它們的苷元為花青素。根據(jù)母離子m/z 449，子離子m/z 287，其中162是葡萄糖失去1分子水的相對分子質(zhì)量，保留時間為5.8 min，由此可推斷峰4化合物為花青素-3-葡萄糖苷；保留時間為6.2 min的質(zhì)譜圖母離子M+的m/z 595，其子離子m/z 287，595-287=308是破碎的糖苷的m/z，初步推測此化合物為花青素-3-蕓香糖苷[25]，結(jié)合標(biāo)樣花青素-3-蕓香糖苷的譜圖，兩者的HPLC保留時間和MS中檢測到的碎片離子m/z均相同，因此斷定峰5的化合物為花青素-3-蕓香糖苷。

如表1所示，櫻桃果實(shí)中共檢測出9 種花色苷化合物。其中花青素-3-蕓香糖苷、花青素-3-葡萄糖苷在這3 個品種的果皮和‘紅燈’果肉中都存在，且含量都相對較高?；ㄇ嗨?3-蕓香糖苷在所有檢測到的花色苷中含量最高，在‘紅艷’果皮、‘雷尼’果皮、‘紅燈’果皮、‘紅燈’果肉中的含量依次為5.21、2.51、75.70、7.40 mg/g?！t艷’果皮中檢測到可定量的花色苷化合物有花青素-3-葡萄糖苷和花青素-3-蕓香糖苷?！啄帷ぶ袡z測到可定量的花色苷化合物除花青素-3-葡萄糖苷和花青素-3-蕓香糖苷外，還檢測到花葵素-3-蕓香糖苷。‘紅燈’果皮中檢測到花色苷普遍比‘紅艷’果皮、‘雷尼’果皮含量高，種類多，共有6 種：花青素-3-槐糖苷、花青素-3-葡萄糖苷、花青素-3-蕓香糖苷、花青素衍生物、花葵素-3-蕓香糖苷、甲基花青素-3-蕓香糖苷。‘紅燈’果肉中檢測到4 種花色苷化合物，分別為花青素-3-葡萄糖苷、花青素-3-蕓香糖苷、花葵素-3-蕓香糖苷、甲基花青素-3-蕓香糖苷。同一品種中，‘紅燈’皮花色苷的種類、含量除了甲基花青素-3-蕓香糖苷外，都比‘紅燈’果肉的多。

表1 櫻桃果實(shí)花色素的HPLC-MS/MS成分分析Table1 HPLC-MS/MS data and tentative identif i cation of anthocyanin composition of cherries

2.2 櫻桃非花色苷酚化合物檢測結(jié)果

圖3 ‘雷尼’（A）、‘紅艷’（B）和‘紅燈’（C）非花色苷提取物HPLC圖Fig.3 HPLC chromatograms of nonanthocyanin phenolics extracts from ’ (C)‘Rainier’ (A),‘Hongyan’ (B),‘Hongdeng

如圖3所示，保留時間42.30、47.40 min為‘紅艷’果皮、‘紅燈’果皮、‘雷尼’果皮主要的非花色苷酚化合物，‘雷尼’果肉、‘紅艷’果肉、‘紅燈’果肉沒有檢測到非花色苷酚化合物。根據(jù)保留時間及離子碎片可推測出圖中峰1、2分別為蘆丁和山柰酚-3-蕓香糖苷。

表2 櫻桃果皮中非花色苷酚的HPLC-MS/MS成分分析Table2 HPLC-MS/MS data and tentative identif i cation of nonanthocyanin phenolic composition of cherries

如表2所示，這3 個品種僅有蘆丁與山柰酚-3-蕓香糖苷這2 種化合物被檢測出來，且蘆丁與山柰酚-3-蕓香糖苷僅在櫻桃果皮中檢出。蘆丁含量最高的是‘紅燈’果皮，為0.74 mg/g，‘紅艷’果皮、‘雷尼’果皮、‘紅燈’果皮的山柰酚-3-蕓香糖苷分別為1.17、2.91 mg/g和2.37 mg/g，‘雷尼’果皮中含量最高。

3 結(jié) 論

在供試的甜櫻桃果皮和果肉中，共檢測到9 種花色苷化合物，分別為花翠素-3-葡萄糖苷、花翠素-3-蕓香糖苷、花青素-3-槐糖苷、花青素-3-葡萄糖苷、花青素-3-蕓香糖苷、花葵素-3-蕓香糖苷、甲基花青素-3-蕓香糖苷、花青素衍生物、二甲基花翠素衍生物，其中花青素-3-蕓香糖苷是這3 個櫻桃品種的主要花色苷，其在‘紅艷’果皮、‘雷尼’果皮、‘紅燈’果皮、‘紅燈’果肉中的含量分別為5.21、2.51、75.70、7.40 mg/g，在‘紅燈’果皮中的含量最高。對紅肉品種而言，其果皮和果肉中的花色苷組成和含量不同，‘紅燈’果肉中檢測到4 種花色苷，含量最多的亦為花青素-3-蕓香糖苷，其含量僅為果皮中的十分之一。

在供試的3 種甜櫻桃果皮中，共檢測到2 種非花色苷酚類化合物，分別為蘆丁和山柰酚-3-蕓香糖苷，而在果肉中未檢測到非花色苷酚類化合物，山柰酚-3-蕓香糖苷是供試的3 個甜櫻桃品種果皮中的主要非花色苷酚類化合物，其含量約為蘆丁含量的3～4 倍。

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Analysis of Anthocyanins and Nonanthocyanin Phenolics in Sweet Cherry by HPLC-MS/MS

SUN Dan1, CHEN Weikai2, HE Fei2, WANG Jun2, GU Huiyan1,*
(1. School of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China; 2. Center for Viticulture and Enology, College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

The compositions and contents of anthocyanins and nonanthocyanin phenolics in three cultivars of sweet cherry (‘Rainier’, ‘Hongyan’ and ‘Hongdeng’) were analyzed by using high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS). The separation of anthocyanins was achieved on a Kromasil 100-5C18column (250 mm × 4.6 mm, 6.5 μm) using a mobile phase consisting of water/formic acid/acetonitrile at a fl ow rate of 1.00 mL/min by gradient elution. The injection volume was 30 μL and the column temperature was set at 50 ℃. The detection wavelength was 525 nm. Meanwhile, the separation of nonanthocyanin phenolics was accomplished a Zorbax SB-C18column（50 mm × 3.0 mm, 1.8 μm）using a mobile phase consisting of 1% acetic acid aqueous solution and 1% acetic acid acetonitrile solution at a fl ow rate of 1.00 mL/min by gradient elution. The injection volume was 2 μL and the column temperature was set at 25 ℃. The detection wavelength was 280 nm. The results showed that a total of 9 anthocyanin compounds were detected in these cultivars of sweet cherry, mainly cyanidin-3-rutinoside and cyanidin-3-glucoside, their contents in the skin of ‘Hongyan’, ‘Rainier’,‘Hongyan’ cherries and the pulp of ‘Hongdeng’ cherries were 5.21, 2.51, 75.70 and 7.40 mg/g, and 0.09, 0.07, 3.57 and 0.34 mg/g, respectively. In addition, two nonanthocyanin phenolic compounds were also detected, namely quercetin-3-rutinoside and kaempferol-3-rutinoside. The contents of quercetin-3-rutinoside and kaempferol-3-rutinoside in the skin of ‘Hongyan’, ‘Rainier’and ‘Hongdeng’ cherries were 0.30, 0.63 and 0.74 mg/g, and 1.17, 2.91 and 2.37 mg/g, respectively.

high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS); sweet cherry; anthocyanin compounds; nonanthocyanin phenolic compounds

10.7506/spkx1002-6630-201704029

S662.5

A

1002-6630（2017）04-0181-06

2016-07-24

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（DL09EA03-3）；黑龍江省科技攻關(guān)項(xiàng)目（GZ11B303）

孫丹（1990—），女，碩士，研究方向?yàn)槠咸雅c葡萄酒。E-mail：qi1cai2jia3ri4@126.com

*通信作者：谷會巖（1970—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)橹参镔Y源開發(fā)利用、生物多樣性保育和干擾生態(tài)學(xué)。

E-mail：ghuiyan@nefu.edu.cn

孫丹, 陳為凱, 何非, 等. HPLC-MS/MS法測定甜櫻桃花色苷與非花色苷酚的組成與含量[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(4): 181-186. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201704029. http://www.spkx.net.cn

SUN Dan, CHEN Weikai, HE Fei, et al. Analysis of anthocyanins and nonanthocyanin phenolics in sweet cherry by HPLC-MS/MS[J]. Food Science, 2017, 38(4): 181-186. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201704029. http://www.spkx.net.cn