李維妮，郭春鋒，張宇翔，魏建平，岳田利

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊陵 712100）

氣相色譜-質(zhì)譜法分析乳酸菌發(fā)酵蘋果汁香氣成分

李維妮，郭春鋒，張宇翔，魏建平，岳田利*

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊陵 712100）

以乳酸菌單一菌種和多菌組合分別發(fā)酵蘋果汁，采用紫外-可見分光光度計測定發(fā)酵過程中蘋果汁光密度（optical density，OD）的變化，采用頂空固相微萃取和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測9 組發(fā)酵蘋果汁的香氣成分，結(jié)合不同香氣物質(zhì)的閾值與香氣值分析特征香氣成分，并對各組蘋果汁進(jìn)行感官評價。結(jié)果表明：在發(fā)酵過程中蘋果汁的OD值呈對數(shù)上升趨勢。各組蘋果汁中共鑒定出48 種香氣成分，主要包含醇類、酯類、醛類、酮類和酚類，其中酯類是各發(fā)酵組中種類最多且含量最大的香氣類別，其次是醇類。9 組蘋果汁的主要香氣成分和香氣值較大并有突出貢獻(xiàn)的特征香氣成分均為丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、2-甲基丁基乙酸酯和乙酸己酯等。多菌發(fā)酵和單菌發(fā)酵蘋果汁的香氣成分含量及香氣值差異顯著（P＜0.05），說明多菌發(fā)酵中醇類、酯類和其他類香氣物質(zhì)的總含量明顯高于單菌發(fā)酵，且賦予蘋果汁更強(qiáng)烈的果香、青香和花香。多菌發(fā)酵組的總體感官評分高于單菌發(fā)酵組，當(dāng)副干酪乳桿菌20241、動物雙歧桿菌6165、嗜熱鏈球菌6063、嗜酸乳桿菌6005活菌數(shù)比為1∶1∶1∶1時，感官評分最優(yōu)。研究結(jié)果為今后乳酸菌在發(fā)酵果蔬汁方面的研究和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

蘋果汁；乳酸菌；多菌發(fā)酵；香氣成分；頂空固相微萃取法；氣相色譜-質(zhì)譜法

乳酸菌是一類能夠利用可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生乳酸的細(xì)菌統(tǒng)稱，屬于益生菌的重要組成部分。有研究表明，在食品中加入益生菌對人體健康十分有益，能夠提高免疫力，維持腸道微生態(tài)平衡和降低患癌風(fēng)險[1]。蘋果汁富含糖類、有機(jī)酸、多酚、維生素等營養(yǎng)成分，是世界上最受人們歡迎的果汁之一。蘋果汁具有獨特的風(fēng)味，其中香氣成分是影響其品質(zhì)的重要因素。乳酸菌發(fā)酵果蔬汁既具有乳酸發(fā)酵的風(fēng)味，又不失果蔬原料的自然風(fēng)味，從而構(gòu)成了發(fā)酵果蔬汁的獨特風(fēng)味，而揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)是評價果蔬汁品質(zhì)的重要指標(biāo)。蘋果汁中的香氣成分很復(fù)雜，且多數(shù)含量很低，目前采用的富集和分析方法主要是頂空固相微萃取法與氣相色譜-質(zhì)譜等設(shè)備聯(lián)用，檢測揮發(fā)性香氣成分具有快捷、經(jīng)濟(jì)安全、選擇性好且靈敏度高等優(yōu)點[2]。果蔬汁的香氣特征不僅與構(gòu)成香氣的物質(zhì)及含量有關(guān)，其形成的感官風(fēng)味特征還取決于各香氣物質(zhì)的風(fēng)味閾值，所以需根據(jù)香氣閾值和香氣值共同衡量香氣強(qiáng)度。

近年來，關(guān)于乳酸菌發(fā)酵果蔬汁的研究較多，主要集中在理化指標(biāo)的分析以及工藝條件優(yōu)化上，鄭欣等[3]研究得出在保加利亞乳桿菌、干酪乳桿菌和腸膜狀明串珠菌混合發(fā)酵荔枝汁過程中，蘋果酸被消耗完全，乳酸則大量生成，而總酚、酒石酸、乙酸和檸檬酸沒有顯著變化（P＞0.05）。王德純等[4]采用開菲爾菌種（乳酸鏈球菌、乳酸桿菌、醋酸菌和酵母等）對蘋果汁進(jìn)行發(fā)酵，通過正交試驗得到最優(yōu)發(fā)酵條件為pH 4.0、15 °Bx且發(fā)酵溫度37 ℃，所得果汁含有較多的蘋果酸-乳酸發(fā)酵后的產(chǎn)物。Elena等[5]將植物乳桿菌接種入添加有乳清增長劑的蘋果汁中進(jìn)行發(fā)酵，研制出具有良好貨架期穩(wěn)定性和感官可接受性的蘋果汁。目前，對于乳酸菌發(fā)酵果蔬汁香氣成分的報道較少。林曉姿等[6]研究植物乳桿菌和副干酪乳桿菌復(fù)配發(fā)酵葡萄汁后的香氣成分，兩者是友好共生型，能夠改變葡萄汁的風(fēng)味物質(zhì)組成。葉淑紅等[7]利用乳酸菌發(fā)酵胡蘿卜汁，發(fā)酵后的產(chǎn)品比原汁增加一些獨特的風(fēng)味。周春麗等[8]將乳酸菌、酵母菌和二者混合后發(fā)酵南瓜汁，混合發(fā)酵后的南瓜汁增加了不同菌種發(fā)酵所特有的風(fēng)味物質(zhì)。熊濤等[9]分析了植物乳桿菌發(fā)酵胡蘿卜汁漿風(fēng)味物質(zhì)的變化，結(jié)果表明其中的烯萜類物質(zhì)明顯減少，醇酯類物質(zhì)明顯增加。Ellendersen等[10]利用干酪乳桿菌發(fā)酵蘋果汁，所得果汁具有焦糖色并帶蘋果特有香氣和蘋果酸味。目前，乳酸菌在發(fā)酵果蔬汁的應(yīng)用上多為單菌發(fā)酵和雙菌發(fā)酵，菌種選擇較單一，且國內(nèi)外鮮見有不同乳酸菌發(fā)酵組合對蘋果汁香氣成分影響的研究報道。本研究采用頂空固相微萃取法和氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用對乳酸菌單一菌種和多菌組合發(fā)酵蘋果汁的香氣物質(zhì)進(jìn)行萃取和檢測分析，采用紫外-可見分光光度計測定蘋果汁光密度（optical density，OD）值，并根據(jù)不同香氣化合物的閾值及香氣值比較各香氣成分對發(fā)酵蘋果汁整體香氣和感官品質(zhì)的影響及發(fā)酵過程中蘋果汁OD值的變化，為乳酸菌在發(fā)酵果蔬汁方面的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅富士（Malus pumila Mill.）蘋果，購于陜西楊陵，9月中下旬采摘，大小均一，無機(jī)械損傷，無病害或腐爛。

乳酸菌菌種：副干酪乳桿菌20241（Lactobacillus paracasei）、動物雙歧桿菌6165（Bifidobacterium animalis）、嗜熱鏈球菌6063（Streptococcus thermophilus）、嗜酸乳桿菌6005（Lactobacillus acidophilus），保存于西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院食品發(fā)酵工程與食品安全實驗室。

MRS肉湯培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；3-辛醇（標(biāo)準(zhǔn)品，純度＞98%） 日本東京化成工業(yè)株式會社；氯化鈉（分析純） 四川西隴化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

2000JP-1型離心果汁機(jī) 南通金橙機(jī)械有限公司；YXQ-LS-70A型立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；PHS-3C型pH計 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；HC-3018R型高速冷凍離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；YT-CJ-2ND型超凈工作臺北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司；HWS-80型智能恒溫恒濕箱 寧波海曙賽福實驗儀器廠；120150-T230L氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、UV-1700紫外-可見分光光度計日本島津公司；50/30 μm聚二甲基硅氧烷/二乙基苯（polydimethylsiloxane/divinylbenzene，PDMS/DVB）萃取頭 美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 蘋果汁的制備

挑選→清洗→去核→切塊→榨汁→護(hù)色→酶解→抽濾→調(diào)酸→冷凍待用（-20 ℃保存）。

1.3.2 蘋果汁的發(fā)酵

將保存于甘油管的四株乳酸菌分別置于MRS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，于37 ℃無菌環(huán)境中靜置培養(yǎng)24 h。再分別接種于100 mL蘋果汁種子液中，于37 ℃條件下靜置培養(yǎng)18 h，活菌數(shù)約達(dá)1×107CFU/mL，之后副干酪乳桿菌20241、動物雙歧桿菌6165、嗜熱鏈球菌6063和嗜酸乳桿菌6005四株菌按照單一菌種和多菌組合的配比方式，分別以體積分?jǐn)?shù)2%接種量接種于500 mL蘋果汁中，于37 ℃條件下靜置發(fā)酵24 h，期間定時取樣測定OD值，發(fā)酵結(jié)束后置于-20 ℃條件下保存待用。編號為：S1（副干酪乳桿菌20241）、S2（動物雙歧桿菌6165）、S3（嗜熱鏈球菌6063）、S4（嗜酸乳桿菌6005）、M5（副干酪乳桿菌-動物雙歧桿菌-嗜熱鏈球菌-嗜酸乳桿菌1∶2∶1∶2，活菌數(shù)比，下同）、M6（1∶1∶1∶1）、M7（1∶2∶2∶1）、M8（2∶1∶2∶1）、M9（2∶2∶1∶1）。

1.3.3 蘋果汁OD值的測定

根據(jù)呂加平等[11]對乳酸菌生長動力學(xué)的研究可知，由于菌液的OD值和其顯微鏡計數(shù)之間存在相關(guān)關(guān)系，因此可通過測定OD值的方法來評定發(fā)酵液中的活菌數(shù)。OD值直接用分光光度計進(jìn)行測定，重復(fù)3 次，取平均值，測定波長為600 nm。

1.3.4 香氣成分富集

根據(jù)葉萌祺[12]測定方法進(jìn)行改進(jìn)，采用頂空固相微萃取法進(jìn)行香氣成分的富集。用移液管移取5 mL蘋果汁樣品于20 mL進(jìn)樣瓶中，分別加入2 g氯化鈉和一定量的內(nèi)標(biāo)溶液（3-辛醇），上機(jī)測定。進(jìn)樣瓶先在45 ℃環(huán)境中平衡30 min，再用老化處理過的萃取頭插入進(jìn)樣瓶中，頂空吸附30 min，然后進(jìn)行解吸。

1.3.5 色譜條件

色譜柱：DB-17MS毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：起始溫度40 ℃，保持3 min后以4 ℃/min的速度率升溫至120 ℃，再以6 ℃/min的速率升溫至240 ℃，保持9 min；自動進(jìn)樣；進(jìn)樣口溫度250 ℃；載氣為He；流速為1.93 mL/min；不分流進(jìn)樣。

1.3.6 質(zhì)譜條件

電子電離源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；接口溫度230 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z 35～500。

1.3.7 定性與定量

1.3.8 單菌發(fā)酵組與多菌發(fā)酵組香氣成分差異性分析

利用SPSS軟件采用t檢驗法對乳酸菌單菌發(fā)酵和多菌發(fā)酵蘋果汁的香氣成分含量及香氣值的差異顯著性進(jìn)行分析。

1.3.9 感官評價

為了對單一菌種和多菌組合發(fā)酵對蘋果汁感官品質(zhì)的影響進(jìn)行評價，采用9 點快感標(biāo)度法[12]，由20 位受過感官品嘗訓(xùn)練的老師和同學(xué)組成評定小組，從顏色、酸甜度、香氣、味道、體態(tài)、風(fēng)味和整體接受性等方面分別對各個蘋果汁樣品進(jìn)行感官評價，每一項性質(zhì)都有9 種不同的等級評分，以表示評定人員對它的喜好程度，1：極度不喜歡；2：極不喜歡；3：中等不喜歡；4：輕度不喜歡；5：無所謂；6：輕度喜歡；7：中等喜歡；8：很喜歡；9：極度喜歡。

2結(jié)果與分析

2.1 蘋果汁理化指標(biāo)測定結(jié)果

所得蘋果汁固形物含量為（14.03±0.20）°Brix，pH值為5.85±0.02，總酸含量為（7.10±0.20）g/L，總糖含量為（0.29±0.00）g/100 g，總酚含量為（53.21±0.50）μg/100 μL。

2.2 蘋果汁發(fā)酵過程中OD值的變化

城市林業(yè)具有雙重屬性，即社會屬性和自然屬性。社會屬性將社會學(xué)、園林學(xué)、經(jīng)濟(jì)學(xué)、生態(tài)學(xué)等理論知識結(jié)合起來，提高城市管理水平，建設(shè)可持續(xù)發(fā)展、和諧、健康的城市，這也是生態(tài)城市建設(shè)規(guī)劃的內(nèi)容。自然屬性就是將城市林業(yè)劃分為生態(tài)系統(tǒng)的一部分，城市可以通過自然環(huán)境的改善，建設(shè)生態(tài)城市。

圖1 蘋果汁發(fā)酵過程中OD值的變化Fig.1 Changes in OD value during fermentation of apple juice

發(fā)酵過程中每隔2 h取樣，測定各菌種組合OD值的變化，如圖1所示。隨著發(fā)酵時間的延長，蘋果汁的OD值呈對數(shù)上升趨勢，這與李冬華[13]所研究的植物乳桿菌在圣女果汁中的生長趨勢相符。發(fā)酵前10 h，各發(fā)酵組的OD值沒有明顯變化，這是由于乳酸菌在蘋果汁環(huán)境中代謝系統(tǒng)需要適應(yīng)新的環(huán)境，并且合成多種產(chǎn)物，此時蘋果汁中的細(xì)胞數(shù)目沒有增加。發(fā)酵10 h后開始進(jìn)入對數(shù)期，乳酸菌大量繁殖，代謝旺盛，蘋果汁的OD值呈對數(shù)增加。發(fā)酵進(jìn)行到20 h時，總細(xì)菌數(shù)基本達(dá)到最高水平，細(xì)胞代謝產(chǎn)物的積累達(dá)到最高峰，之后活菌數(shù)保持相對穩(wěn)定，蘋果汁的OD值不再有明顯變化。發(fā)酵達(dá)到終點時，各發(fā)酵組的OD值存在一定的差異，其中M6號發(fā)酵組的OD值最高，S1號發(fā)酵組最低，OD值前四名均為多菌發(fā)酵組，分別為M6、M5、M7和M9。后兩名均為單菌發(fā)酵組，分別為S1和S4?？梢娙樗峋嗑N發(fā)酵相較單菌發(fā)酵而言在一定程度上提高了蘋果汁中的活菌數(shù)，使得菌液的OD值有所升高。

2.3 蘋果汁的香氣成分分析

2.3.1 蘋果汁的香氣成分及香氣值

如表1所示，香氣成分主要有醇類15 種，酯類24種，以及其他種類的香氣物質(zhì)9 種，共48 種。由此看出，醇類和酯類物質(zhì)在整體香氣物質(zhì)中占了較大的比重。

利用已有香氣閾值的相關(guān)報道[14-15]來計算香氣物質(zhì)的香氣值，并據(jù)此確定特征香氣成分。香氣值是某種化合物的含量與該種化合物香氣閾值的比值。香氣值大于1的是對蘋果汁香味起主要作用的芳香成分，被稱為該蘋果汁的特征香氣成分。其香氣值越大則對香氣的貢獻(xiàn)越大。如表2所示，9 個蘋果汁發(fā)酵組中香氣值均存在一定的差異，香氣值大于1的香氣物質(zhì)共有17 種，其中2-甲基丁酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸己酯、2-甲基丙酸乙酯、2-甲基丁基乙酸酯和2-甲基丁酸甲酯具有較高的香氣值，并對9 組蘋果汁的總體香氣有重要影響。

2.3.2 蘋果汁中的醇類香氣物質(zhì)

醇類物質(zhì)是乳酸菌發(fā)酵蘋果汁過程中一類重要的揮發(fā)性香氣成分。高級醇是指含有3 個碳原子以上的一元醇類的總稱，少量的高級醇能夠賦予蘋果汁淡雅的香氣，并且可以作為其他香氣物質(zhì)的良好溶劑，對整體香氣的形成帶來較大的貢獻(xiàn)。如表1所示，在9 個發(fā)酵組中均檢測出相同的15 種醇類物質(zhì)，各組醇類物質(zhì)含量依次為（4.706±0.28）、（4.657±0.25）、（4.818±0.24）、（4.769±0.20）、（4.857±0.27）、（5.018±0.38）、（4.729±0.31）、（4.965±0.33）、（4.864±0.20） mg/L，分別占總香氣的37.725%、40.421%、41.632%、41.749%、42.867%、42.694%、45.482%、46.298%和45.541%。由此可見，多菌發(fā)酵中除M7號樣品外醇類物質(zhì)含量均高于單菌發(fā)酵，并在一定程度上提高了醇類物質(zhì)在總香氣的占比。這與周春麗等[8]研究乳酸菌發(fā)酵南瓜汁的結(jié)果相似，與單菌發(fā)酵對比，混菌發(fā)酵南瓜汁后醇類物質(zhì)所占比重有所增加。在各組蘋果汁中含量最高的5 種物質(zhì)均依次為6-甲基-5-庚烯-2-醇、2-甲基-1-丁醇、乙醇、正丁醇和正己醇。醇類物質(zhì)在整體香氣物質(zhì)中的比例雖較大，但其香氣值并不高，由表3可知，單菌發(fā)酵和多菌發(fā)酵中的M5號和M7號發(fā)酵組均僅有2種特征香氣成分，即芳樟醇和2-甲基-1-丁醇，多菌發(fā)酵中M6、M8號和M9號則有3 種，除此2 種外，香茅醇也是其特征香氣成分。

研究表明，6-甲基-5-庚烯-2-醇具有明顯的焦甜香[16]，香氣閾值高，香氣值較低。2-甲基-1-丁醇是蘋果常見的風(fēng)味特征物之一，在所分析的醇類物質(zhì)中其含量和香氣值均較高，賦予蘋果汁青香。乙醇可以通過蘋果汁中的葡萄糖和果糖在乳酸菌發(fā)酵過程中經(jīng)糖酵解途徑和乙醛途徑代謝而生成[17]，香氣柔和甜潤，香氣閾值很高，香氣值非常低，對整體香氣貢獻(xiàn)很少。正丁醇帶有辛辣氣息。正己醇是高級脂肪醇，帶有水果芬芳的誘人香氣[18]。除了這些含量比較豐富的物質(zhì)外，蘋果汁中還存在一些含量較低但對整體香氣有貢獻(xiàn)的醇類，例如芳樟醇、香茅醇、正辛醇和1,3-辛二醇等。芳樟醇屬于鏈狀萜烯醇類，廣泛存在于植物中，香氣閾值很低，香氣值高，賦予蘋果汁濃青帶甜的木青氣息，是貢獻(xiàn)最大的醇類。熊濤等[9]利用植物乳桿菌發(fā)酵胡蘿卜漿后生成芳樟醇等物質(zhì)，且是主要的香氣成分，賦予胡蘿卜漿青香，這與本研究相似。香茅醇是另一種萜烯醇類化合物，帶有玫瑰和柑橘類花香[12]。多菌發(fā)酵中這2 種香氣成分的平均含量和平均香氣值均高于單菌發(fā)酵。在各發(fā)酵組中，正辛醇含量最高的是M8號，1,3-辛二醇含量最高的是M7號，2 組均為多菌發(fā)酵。所檢測到的醇類物質(zhì)中含量最低的是3-環(huán)己烯-1-甲醇，含量為（0.024±0.00）～（0.028±0.00） mg/L。

2.3.3 蘋果汁中的酯類香氣物質(zhì)

酯類物質(zhì)是蘋果汁中一類含量多且種類豐富的香氣成分，具有花香和果香，對蘋果汁香氣的形成有重要貢獻(xiàn)。趙峰等[19]從紅富士蘋果中檢測出55 種香氣成分，其中酯類物質(zhì)的種類和含量均為最高，研究者將紅富士蘋果歸為“酯類型”品種。本研究中共檢測出的酯類物質(zhì)種類和含量均是最多的，各發(fā)酵組中酯類物質(zhì)的含量分別為（7.651±0.64）、（7.210±0.55）、（7.383±0.55）、（7.413±0.53）、（7.535±0.35）、（8.225±0.63）、（7.480±0.63）、（7.696±0.41）、（8.070±0.34） mg/L，占總香氣含量依次為61.269%、59.484%、59.195%、59.23%、58.749%、60.147%、58.514%、58.863%和60.626%，均約占總香氣的3/5，且多菌發(fā)酵的平均含量高于單菌發(fā)酵。其中丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、2-甲基丁基乙酸酯、乙酸丁酯和乙酸己酯是蘋果汁中檢測到的主要酯類物質(zhì)，香氣值高，賦予蘋果汁強(qiáng)烈的果香，是9 個發(fā)酵組中共有的特征香氣成分。

在所有分析的香氣物質(zhì)中，丁酸乙酯和2-甲基丁酸乙酯的含量和香氣值在9 個發(fā)酵組里均是最高的，平均含量均超過（1.590±0.04） mg/L，兩者之和占總香氣含量均超過24%，對蘋果汁整體香氣貢獻(xiàn)最大，而李俊

芳[20]利用乳酸菌發(fā)酵桑椹汁后得到的這2 種物質(zhì)含量極低，且酯類物質(zhì)的總含量均較低，可見發(fā)酵蘋果汁較桑椹汁具有更典型的酯香和果香。有研究表明，乙酸乙酯含量若過高，會帶來不愉快的溶劑氣味，過低則對樣品的香氣沒有影響[21]。在各發(fā)酵組中乙酸乙酯的含量在（0.539±0.01）～（0.615±0.03） mg/L之間波動，香氣值較低，對整體香氣沒有不良影響。除了上述含量較高的酯類香氣物質(zhì)外，蘋果汁中還檢測到了一些含量較低如山梨酸乙酯、惕各酸乙酯和3-羥基丁酸乙酯等支鏈酯類。蘋果香氣成分中的支鏈酯類主要來自氨基酸代謝，氨基酸經(jīng)轉(zhuǎn)氨作用形成支鏈酮酸，再經(jīng)脫羧或脫氫反應(yīng)，形成支鏈醇和?；?CoA，最后通過相關(guān)酶的催化而形成支鏈酯類物質(zhì)[22]。山梨酸乙酯是多個品種葡萄酒中的特征香氣物質(zhì)[23]，具有獨特香氣，可作為香料、防腐防霉劑。各發(fā)酵組中其檢出含量均較低，在（0.039±0.00）～（0.055±0.01） mg/L之間。惕各酸乙酯具有優(yōu)雅的花香氣味，在各發(fā)酵組中的含量與山梨酸乙酯相近，且多菌發(fā)酵中這2 種物質(zhì)的平均含量均高于單菌發(fā)酵。2-甲基丁酸己酯也是常見的蘋果香氣成分之一，帶有似未成熟草莓香味，但在本研究中檢出量很低，其中S4、M5號和M7號樣品中均未檢測出。蘋果汁中還檢測出了一些含量非常低，但香氣值高，對整體香氣有影響的特征香氣成分，如丙酸乙酯、2-甲基丙酸乙酯、2-甲基丁酸甲酯和戊酸乙酯，且多菌發(fā)酵中這4 種成分的平均含量和平均香氣值均高于單菌發(fā)酵。在所檢出的香氣物質(zhì)中含量最低的是丙酸丁酯，在各發(fā)酵組中的含量均在（0.012±0.00）mg/L上下波動。

表1 不同蘋果汁發(fā)酵組的香氣成分和含量Table1 Aroma compounds and their contents in different fermented apple juices

表2 不同蘋果汁發(fā)酵組香氣成分的香氣值Table2 OAV of aroma compounds in different fermented apple juices

2.3.4 蘋果汁的其他類香氣物質(zhì)

除了醇類、酯類等主要的香氣物質(zhì)，蘋果汁發(fā)酵過程中還會產(chǎn)生其他種類的一些揮發(fā)性香氣成分，如醛類、酮類和酚類等，它們的含量雖然較低，但卻對蘋果汁的香氣也有貢獻(xiàn)，是使蘋果汁具有特征風(fēng)味的重要物質(zhì)[12]。本研究中共檢測出其他類化合物共9 種，其中醛類2 種、酮類5 種、酚類2 種，分別為乙醛、反-2-己烯醛、甲基庚烯酮、4-羥基-2-甲基苯乙酮、大馬酮、香葉基丙酮、乙偶姻、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚和2,4-二叔丁基苯酚，其中，乙醛和甲基庚烯酮在各發(fā)酵組中的香氣值均大于1，是蘋果汁的特征香氣成分。這9 種物質(zhì)的含量分別為（0.257±0.06）、（0.254±0.05）、（0.271±0.08）、（0.382±0.08）、（0.434±0.06）、（0.432±0.06）、（0.369±0.06）、（0.368±0.08）、（0.377±0.03） mg/L，占總香氣含量依次為2.005%、2.096%、2.173%、3.024%、3.382%、3.16%、3.003%、2.838%和2.832%。由此可知，除S4號樣品外，多菌發(fā)酵中其他類香氣物質(zhì)的含量均高于其他3 組單菌發(fā)酵。

乙醛是乳酸菌進(jìn)行糖代謝的中間產(chǎn)物，在各發(fā)酵組中均有檢測到且含量較低，與劉磊等[24]所研究的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌發(fā)酵龍眼果漿后所得乙醛的含量相差約50 倍，這與所用菌株有關(guān)[25]。反-2-己烯醛具有令人愉快的綠葉清香和消費者習(xí)慣的水果香氣，在各發(fā)酵蘋果汁中的含量差異較大，其中S4樣品中沒有檢測出該物質(zhì)，且除S2號和S4號外，7 個發(fā)酵組中該物質(zhì)的香氣值均大于1，是其特征香氣成分。甲基庚烯酮是合成芳樟醇的中間體，具有檸檬草般的香氣，在各組中的含量在（0.080±0.02） mg/L上下波動。4-羥基-2-甲基苯乙酮屬于芳香酮類化合物，是合成多種醫(yī)藥和香料的中間體。單菌發(fā)酵中僅有S4號樣品檢出該物質(zhì)，而所有多菌發(fā)酵組中均有該物質(zhì)檢出。大馬酮帶有與玫瑰相似的強(qiáng)烈味道[26]，該物質(zhì)在所有蘋果汁中都有檢出。此外，蘋果汁中還檢測出了香葉基丙酮，但9 個發(fā)酵組中僅在S1號和S4號2 個單菌發(fā)酵組里有檢出，且含量極低，分別為（0.017±0.00） mg/L和（0.016±0.00） mg/L。王陽等[27]研究的蘋果渣發(fā)酵后同樣也檢測出該物質(zhì)，此物質(zhì)曾在芒果酒和葡萄酒中有過報道，是一種帶有甜味、青草味和水果香味的揮發(fā)性香氣成分[28-30]。乙偶姻具有令人愉快的奶香氣，廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)，在蘋果酸-乳酸發(fā)酵過程中乳酸菌可將檸檬酸分解成丙酮酸，其代謝中間產(chǎn)物還能產(chǎn)生乙偶姻等風(fēng)味化合物[17]。多菌發(fā)酵中的M5、M6號和M7號里檢測到乙偶姻，單菌發(fā)酵中僅S4號樣品有檢出，含量極低，但香氣值較高，對整體香氣貢獻(xiàn)較少。

2.3.5 香氣成分含量及香氣值t檢驗分析

為進(jìn)一步分析與比較單菌發(fā)酵和多菌發(fā)酵蘋果汁整體香氣成分的差異性，根據(jù)香氣成分含量及香氣值進(jìn)行t檢驗。利用SPSS軟件得到P值。如表3所示，單菌發(fā)酵組與多菌發(fā)酵組蘋果汁香氣成分含量及香氣值的P值均小于0.05，證明2 種發(fā)酵方式所得的蘋果汁芳香成分差異顯著，說明多菌發(fā)酵中醇類、酯類和其他類香氣的總含量明顯高于單菌發(fā)酵，多菌發(fā)酵賦予蘋果汁更強(qiáng)烈的果香、花香和青香。

表3 香氣成分含量及香氣值t檢驗結(jié)果Table3t Test results of aroma contents and aroma value

2.4 蘋果汁的感官評價

由表4可知，顏色方面，各發(fā)酵蘋果汁的顏色主要呈橘黃色，平均得分比較接近，均在6.00 分以上；酸甜度方面，由于大眾喜好酸甜度適中的蘋果汁，所以偏酸或偏甜都會導(dǎo)致得分較低，可看出多菌發(fā)酵組的得分均高于單菌發(fā)酵，其中得分最高的是M9號；香氣方面，多菌發(fā)酵的得分均高于單菌發(fā)酵，M6號得分最高，香味柔和，具有典型蘋果酯香；味道方面，相較單菌發(fā)酵而言，多菌發(fā)酵組給人更清爽的感覺，沒有苦澀等不佳的口感，得分更高；體態(tài)方面，得分最高的是M8號，得分較低者主要是因為蘋果汁中有殘留的菌體沉淀物，果汁較渾濁；風(fēng)味方面，各多菌發(fā)酵組得分差異不大，平均高于單菌發(fā)酵，口感和氣味結(jié)合得更令人愉快；整體接受性是對蘋果汁的總體印象和可接受程度，可看出多菌發(fā)酵的平均得分高于單菌發(fā)酵，更易讓人接受，此項得分最高的是M6號和M7號并列。M6號所得的蘋果汁，顏色（7.73±0.90） 分，酸甜度（6.91±0.94） 分，香氣（7.35±1.04） 分，味道（7.25±1.19） 分，體態(tài)（6.18±0.82） 分，風(fēng)味（6.84±1.08） 分，整體接受性（7.18±0.98）分，是所有蘋果汁中得分情況最優(yōu)的，其次是M8號。總體來說，多菌發(fā)酵的蘋果汁比單一菌種發(fā)酵的蘋果汁得分更高。相較單菌發(fā)酵而言，多菌發(fā)酵在一定程度上改善了蘋果汁的感官品質(zhì)，使得蘋果汁口感更佳，更受人們歡迎。

表4 不同發(fā)酵蘋果汁的感官評價結(jié)果Table4 Sensory evaluation results of different fermented apple juices

3 結(jié) 論

在乳酸菌發(fā)酵蘋果汁過程中，蘋果汁的OD值呈對數(shù)上升趨勢，且多菌發(fā)酵較單菌發(fā)酵而言在一定程度上提高了蘋果汁的OD值。

采用固相微萃取法，通過氣相色譜-質(zhì)譜分析發(fā)酵后蘋果汁的香氣成分，共檢測出48 種香氣物質(zhì)，各發(fā)酵組中含量最高的均為丁酸乙酯，在多菌發(fā)酵中醇類、酯類和其他類香氣物質(zhì)的平均含量均高于單菌發(fā)酵。通過對香氣化合物閾值與香氣值分析，各發(fā)酵蘋果汁中的特征香氣成分主要有2-甲基丁酸乙酯、丁酸乙酯和乙酸己酯等，較單菌發(fā)酵而言，多菌發(fā)酵蘋果汁中香氣化合物賦予更強(qiáng)烈的果香、花香和青香。

采用9 點快感標(biāo)度法對9 組蘋果汁進(jìn)行感官評價，多菌發(fā)酵組的得分高于單菌發(fā)酵組，其中M6號樣品，即當(dāng)副干酪乳桿菌、動物雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌活菌數(shù)比1∶1∶1∶1時，是得分情況最優(yōu)的。

總體來看，各發(fā)酵組香氣成分的含量、種類和特征香氣以及蘋果汁的感官特性均有一定的差異。通過t檢驗可知，單菌發(fā)酵和多菌發(fā)酵蘋果汁香氣成分含量及香氣值均差異顯著（P＜0.05），多菌發(fā)酵在一定程度上改善了蘋果汁的感官品質(zhì)。本研究為后續(xù)研究乳酸菌發(fā)酵果蔬汁的香氣成分提供了一定的實踐經(jīng)驗，對于其中具體香氣成分形成和轉(zhuǎn)化的機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

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GC-MS Analysis of Aroma Components of Apple Juice Fermented with Lactic Acid Bacteria

LI Weini, GUO Chunfeng, ZHANG Yuxiang, WEI Jianping, YUE Tianli*
(College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, China)

In this study, changes in optical density (OD) during the fermentation of apple juice with pure and mixed cultures of lactic acid bacteria were monitored by a UV-Vis spectrophotometer. The aroma components of nine fermented apple juices were identif i ed by head-space solid phase micro-extraction (HS-SPME) combined with gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS), and the characteristic aroma components were evaluated by odor activity value (OAV) and odor threshold value (OTV). Sensory evaluation was also carried out on the samples. The results showed that the OD value of apple juice increased logarithmically with time. Forty eight aroma components were identif i ed from nine fermented apple juices, mainly including alcohols, esters, aldehydes, ketones and phenols. Esters were the most abundant components with the highest species diversity, followed by alcohols. In addition, according to their aroma values, butyric acid ethyl ester, ethyl-2-methylbutyrate, 2-methylbutyl acetate and hexyl acetate were the main aroma components in all the fermented samples. The contents of aroma components and aroma values from single and mixed culture fermentation of apple juice were signif i cantly different (P ＜ 0.05). It was shown that the total contents of alcohols, esters and other aroma components with mixed culture fermentation were signif i cantly higher than those of single culture fermentation and apple juice fermented with single cultures had a stronger fruity, green and flowery aroma. The overall sensory score of apple juice fermented with mixed cultures was higher than that of single culture fermentation. A mixed culture of Lactobacillus paracasei 20241, Bif i dobacterium animalis 6165, Streptococcus thermophilus 6063 and Lactobacillus acidophilus 6005 at a ratio of 1:1:1:1 was the optimal combination in sensory acceptance. These results can provide a theoretical basis for the research and application of lactic acid bacteria in fermented fruit and vegetable juice.

apple juice; lactic acid bacteria; mixed-strain fermentation; aroma components; head-space solid phase microextraction (HS-SPME); gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)

10.7506/spkx1002-6630-201704024

TS255.4

A

1002-6630（2017）04-0146-09

2016-07-02

國家自然科學(xué)基金面上項目（31371814）

李維妮（1990—），女，碩士研究生，研究方向為食品科學(xué)。E-mail：18700942939@163.com

*通信作者：岳田利（1965—），男，教授，博士，研究方向為食品生物技術(shù)及食品安全控制。E-mail：yuetl@nwafu.edu.cn

李維妮, 郭春鋒, 張宇翔, 等. 氣相色譜-質(zhì)譜法分析乳酸菌發(fā)酵蘋果汁香氣成分[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(4): 146-154.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201704024. http://www.spkx.net.cn

LI Weini, GUO Chunfeng, ZHANG Yuxiang, et al. GC-MS analysis of aroma components of apple juice fermented with lactic acid bacteria[J]. Food Science, 2017, 38(4): 146-154. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201704024. http://www.spkx.net.cn