蘇鳳賢，張 井，鄭曉杰

（溫州科技職業(yè)學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 溫州 325006）

人參果自然發(fā)酵醪中酵母菌種篩選及其發(fā)酵性能

蘇鳳賢，張 井，鄭曉杰*

（溫州科技職業(yè)學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 溫州 325006）

為篩選適合甘肅河西走廊特產(chǎn)人參果酒精發(fā)酵的優(yōu)良酵母菌株，以人參果自然發(fā)酵醪為原料，通過(guò)鏡檢等方法從分離純化的20 株酵母菌中進(jìn)一步篩選得到11 株發(fā)酵性能良好的酵母菌，分別命名為T(mén)Y8、TY5、TY6、Y3、Y4、Y5、LY3、LY1、Y1、Y2、TY2。以葡萄酒活性干酵母作為對(duì)照菌株，通過(guò)酵母發(fā)酵力比較、耐乙醇能力、耐SO2能力、理化指標(biāo)分析及感官評(píng)價(jià)，篩選出1 株適于人參果果酒發(fā)酵的釀酒酵母TY8。以此菌株發(fā)酵生產(chǎn)的人參果果酒香氣特征明顯，酒體澄清透明，具有人參果果酒典型風(fēng)味。

釀酒酵母；篩選；發(fā)酵性能；耐SO2；耐乙醇

人參果（Solanum muricatum Ait.）又名香瓜茄、艷果，原產(chǎn)于南美洲安第斯山脈北麓[1]。人參果果實(shí)有淡雅的清香，果肉清爽多汁，風(fēng)味獨(dú)特[2]，具有高蛋白、低糖、低脂，富含多種人體必需的微量元素，尤其是硒、鈣含量大大高于其他園藝產(chǎn)品等特點(diǎn)[3-4]，有抗癌、抗衰老、降血壓、降血糖、美容等功效。因此，人參果常用來(lái)加工成各種產(chǎn)品，具有很大的市場(chǎng)開(kāi)發(fā)價(jià)值[5]。

近年來(lái)，釀酒酵母作為生產(chǎn)乙醇和高級(jí)醇的常用菌種備受矚目，微生物發(fā)酵為可持續(xù)的生物燃料生產(chǎn)提供了前途無(wú)量的替代物[6-7]。Nieuwoudt等[8]采用主成分分析和傅里葉變換紅外光譜儀法創(chuàng)造了一種在釀酒酵母主要發(fā)酵產(chǎn)品中進(jìn)行快速篩選和評(píng)價(jià)酵母菌的方法。據(jù)報(bào)道，在影響葡萄酒品質(zhì)的諸多因素中，釀酒微生物是其質(zhì)量和感官風(fēng)格的決定性因素，尤其是葡萄酒微生物（酵母菌和乳酸菌）的釀酒適應(yīng)性和釀造學(xué)特性在生產(chǎn)中的作用十分突出[9]。而目前食品發(fā)酵工業(yè)最重要的菌群，除釀酒酵母屬酵母以外，對(duì)傳統(tǒng)食品發(fā)酵工業(yè)增香方面有良好應(yīng)用前景的其他酵母菌種研究甚少，尤其是多種野生菌在葡萄酒和啤酒發(fā)酵工業(yè)上對(duì)芳香物質(zhì)的生成具有重要的作用。某些非釀酒酵母屬酵母比眾所周知的釀酒酵母更容易產(chǎn)生一些重要的芳香族化合物，諸如品質(zhì)更佳的乙酸乙酯和乙醇乙酯等[10]。資料表明，在醬油發(fā)酵過(guò)程中，主要應(yīng)用于醬油生產(chǎn)的耐鹽生香酵母，由于能夠生產(chǎn)酯類、醇類等風(fēng)味物質(zhì)，對(duì)醬油的品質(zhì)有很大影響[11]。果酒發(fā)酵過(guò)程中，不同酵母菌株的起酵、產(chǎn)酒、產(chǎn)香、耐性等特性不同，在發(fā)酵過(guò)程中發(fā)揮的作用也相差較大，且不同原料本身成分差距較大，選育發(fā)酵性能優(yōu)良、適合特定原料發(fā)酵的專用酵母已成為目前果酒釀造的研究熱點(diǎn)[12-13]。Ocón等[14]在葡萄酒廠空氣樣品和被污染葡萄酒樣品中進(jìn)行酵母篩選，得到了367 株菌株，經(jīng)鑒定，基本是酒香酵母和德克氏酵母等非酵母屬酵母。目前，分離篩選得到的發(fā)酵酵母主要應(yīng)用于白酒、葡萄酒、果酒等酒類產(chǎn)品的發(fā)酵過(guò)程，從而改善產(chǎn)品的風(fēng)味、增加其營(yíng)養(yǎng)[15]。

甘肅河西走廊地區(qū)是人參果的適栽區(qū)，人參果栽培面積較大，然而目前相關(guān)加工技術(shù)相對(duì)落后，課題組在甘肅河西地區(qū)工作期間曾長(zhǎng)期進(jìn)行人參果相關(guān)加工研究，制得了一種色澤金黃、口感清爽、果香濃郁、酒體醇厚的酒精保健飲品[16-19]，但是缺少人參果發(fā)酵相關(guān)的專用釀酒酵母，而使用葡萄酒釀酒酵母，不僅專一性不強(qiáng)，且無(wú)法適應(yīng)人參果酒的產(chǎn)業(yè)化推廣。鑒于微生物對(duì)底物利用具有選擇性[20]，本研究從河西走廊具有優(yōu)勢(shì)資源的人參果自然發(fā)酵酒的不同發(fā)酵階段，分離篩選適宜人參果發(fā)酵的優(yōu)良酵母菌株，從中分離篩選具有專一性強(qiáng)、起酵速率快、發(fā)酵活力強(qiáng)、酒精耐受力高、抗SO2能力強(qiáng)、不產(chǎn)生異味物質(zhì)、絮凝性好、酒精轉(zhuǎn)化率高和風(fēng)味獨(dú)特的優(yōu)良釀酒酵母作為專用的人參果果酒酵母，以期為實(shí)現(xiàn)人參果果酒產(chǎn)業(yè)化提供高效優(yōu)質(zhì)的釀酒酵母品種。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄酒高活性釀酒干酵母（對(duì)照菌株CK）購(gòu)自安琪酵母股份有限公司。人參果產(chǎn)自甘肅武威張義鎮(zhèn)，成熟，無(wú)腐爛變質(zhì)，可溶性固形物含量（soluble solids content，SSC）6.8%。豆芽汁培養(yǎng)基參考文獻(xiàn)[21]配制。

NaOH、HCl、無(wú)水乙醇、冰乙酸 南京化學(xué)試劑股份有限公司；瓊脂 常州通誠(chéng)化工有限公司；CuSO4?5H2O 蘇州亞太化工玻璃儀器有限公司；亞甲藍(lán)大田縣燦成化玻儀器有限公司；酒石酸鉀鈉、乳糖 常州海拓實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；乙酸鋅、亞鐵氰化鉀 天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖 濟(jì)寧宏明化學(xué)試劑有限公司；果糖 無(wú)錫亞泰聯(lián)合化工有限公司；蔗糖 天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JB-HS-1300/1300U型無(wú)菌工作臺(tái) 蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司；DHP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海柏欣儀器設(shè)備廠；YXQ-LS-100G型高壓滅菌鍋 上海道基科學(xué)儀器有限公司；722型分光光度計(jì) 上海鳳凰光學(xué)科儀有限公司；HHW-420.600型三用恒溫水浴箱 江蘇金壇市國(guó)瑞實(shí)驗(yàn)儀器廠；PHS-3C型酸度計(jì) 常州金壇市精達(dá)儀器制造廠；FA2004型電子天平 上海方瑞儀器有限公司；WYT-Ⅱ型手持糖量計(jì) 上海華光儀器儀表廠；JYZ-B550型榨汁機(jī) 九陽(yáng)股份有限公司；酒精計(jì)石家莊百亨通用儀器儀表制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 人參果釀酒酵母的篩選流程

新鮮成熟的人參果→分選→打漿→過(guò)濾→發(fā)酵→初篩→分離→純化→杜氏管復(fù)篩→發(fā)酵性能測(cè)試→優(yōu)良人參果果酒釀酒酵母。

1.3.1.1 人參果釀酒酵母的初篩

挑選新鮮人參果，不清洗，直接打漿，裝入已滅菌的250 mL錐形瓶中，裝液量60 mL，塞好棉塞于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～10 d，分別在發(fā)酵前、中、后期（分別為第2、4、7天）取發(fā)酵液進(jìn)行梯度稀釋平板涂布[22]，每一梯度做3 個(gè)平行。按姜加良[15]的方法篩選紅色菌落作為入選菌，根據(jù)菌落的顏色判定酵母產(chǎn)酒精能力。將篩選得到的菌株反復(fù)純化3～4 次，斜面試管保藏備用。

1.3.1.2 杜氏管發(fā)酵復(fù)篩

采用杜氏管發(fā)酵法[23-24]，將1.3.1節(jié)活化的酵母菌接入內(nèi)置杜氏小管的豆芽汁液體培養(yǎng)基試管中，根據(jù)酵母菌株產(chǎn)氣泡的速率及在規(guī)定時(shí)間內(nèi)產(chǎn)氣泡量，比較各株酵母菌的起酵能力和發(fā)酵能力，實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3 次。綜合評(píng)價(jià)各株酵母的起酵能力和發(fā)酵能力。

1.3.2 發(fā)酵性能測(cè)定

1.3.2.1 酵母菌發(fā)酵力測(cè)定

采用CO2失重法[25]。

1.3.2.2 酵母菌的耐乙醇、耐SO2實(shí)驗(yàn)

采用杜氏管發(fā)酵法[26]，將初篩得到的酵母菌株分別接入含不同體積分?jǐn)?shù)乙醇（8%、9.5%、11%、12.5%和14%）和不同質(zhì)量濃度SO2（50、100、150、200 mg/L和250 mg/L）的人參果果汁中，于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，觀察杜氏管產(chǎn)氣泡情況，比較各菌株對(duì)乙醇和SO2的耐受程度，進(jìn)一步確定適合人參果果酒釀造的優(yōu)良菌株。實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3 次。綜合評(píng)價(jià)各酵母菌株的乙醇耐受能力和耐SO2能力。

1.3.2.3 酒精發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

調(diào)整人參果原汁含糖量，使其達(dá)到20%，pH 4.0，SO2質(zhì)量濃度80 mg/L，將入選菌接入容量為250 mL的三角瓶（裝液量為150 mL）中，對(duì)照菌置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱發(fā)酵7 d，期間每天定時(shí)測(cè)定發(fā)酵液的SSC、A600nm、還原糖和總酸含量，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定酒精度（乙醇體積分?jǐn)?shù)）。

1.3.3 指標(biāo)測(cè)定

SSC測(cè)定采用手持折光儀法[27]；參考GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[28]，總酸（以酒石酸計(jì)）測(cè)定采用酸堿滴定法，還原糖測(cè)定采用斐林法，酒精度測(cè)定采用酒精計(jì)法；酵母生長(zhǎng)曲線采用分光光度法[29]。

2 結(jié)果與分析

2.1 初篩酵母菌的特征

酒精發(fā)酵的主要產(chǎn)物是乙醇，在2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)TTC顯色劑可以對(duì)酵母產(chǎn)物進(jìn)行顯色處理，TTC顯色劑遇乙醇會(huì)顯紅色，酒精含量高的培養(yǎng)基會(huì)顯深紅色，酒精含量低的培養(yǎng)基顯淺紅色。據(jù)此，可以選擇紅色較深的酵母菌落進(jìn)行純化。通過(guò)TTC培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)篩選得到的酵母菌生長(zhǎng)旺盛、發(fā)酵力強(qiáng)、有較好的同步性，接種后迅速進(jìn)入主發(fā)酵期，有利于發(fā)酵作用，有利于提高產(chǎn)品的產(chǎn)量和口感[15]。

圖1 TTC平板顯色篩選Fig.1 Primary screening of yeasts by TTC color development

表1 酵母菌種的分離結(jié)果Table1 Characterization of yeast strains

如圖1所示，純化得到的20 株酵母菌具有酵母菌典型的菌落特征，將其劃線接種于豆芽汁瓊脂斜面培養(yǎng)基上。根據(jù)不同酵母菌的菌落形態(tài)特征、菌落顏色、鏡檢形態(tài)以及典型氣味可分為3 大類（表1）。

2.2 酵母菌復(fù)篩實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 酵母菌復(fù)篩實(shí)驗(yàn)杜氏小管產(chǎn)氣情況Table2 Gas production capacity of yeast strains in Durham tubes

發(fā)酵的產(chǎn)物之一是CO2，所以杜氏試管實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生的氣泡數(shù)量越多，氣泡體積越大，酵母的發(fā)酵能力越強(qiáng)，酵母的發(fā)酵速率越快，酵母的發(fā)酵程度越高[15]。將初次分離得到的20 株酵母菌作為出發(fā)菌株進(jìn)行杜氏管發(fā)酵復(fù)篩實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，酵母菌于25 ℃條件下發(fā)酵48 h，產(chǎn)氣量約等于杜氏小管體積的酵母菌有11 株（不包括CK），這說(shuō)明其起酵能力較強(qiáng)，可能有較高的發(fā)酵度和發(fā)酵效率。其中TY8和CK起酵速率最快，10 h產(chǎn)氣量即達(dá)到杜氏小管滿體積；TY5起酵速度較快，16 h產(chǎn)氣量達(dá)到杜氏小管滿體積；TY6、Y3、Y4和Y5起酵速度稍慢于對(duì)照CK，24 h產(chǎn)氣量可達(dá)到杜氏小管滿體積；LY3、LY1、Y1、Y2和TY2起酵速度最慢，36 h產(chǎn)氣量才達(dá)到杜氏小管滿體積。資料表明，2 d內(nèi)產(chǎn)氣量未達(dá)到杜氏管滿體積的酵母菌的發(fā)酵度一般不能滿足果酒的釀造要求，篩選過(guò)程中應(yīng)將其舍棄[25]。將這11 株酵母菌作為出發(fā)菌株進(jìn)行下一級(jí)篩選。

2.3 酵母菌株發(fā)酵力測(cè)定結(jié)果

發(fā)酵力是衡量酵母菌株質(zhì)量最重要的一個(gè)指標(biāo)[30]。酵母發(fā)酵產(chǎn)生乙醇的同時(shí)還伴有CO2的生成，這部分CO2從發(fā)酵液中逸出，使整個(gè)發(fā)酵體系質(zhì)量減輕，據(jù)此可測(cè)定酵母菌株發(fā)酵力的強(qiáng)弱[31]。采用CO2失重法，以CO2損失質(zhì)量為縱坐標(biāo)，發(fā)酵時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制發(fā)酵力曲線[32]，以此得到待選菌株對(duì)原料果汁的適應(yīng)性、發(fā)酵峰值周期、發(fā)酵強(qiáng)度和發(fā)酵過(guò)程的動(dòng)態(tài)變化[31]。

圖2 不同酵母菌發(fā)酵速率曲線圖Fig.2 Time courses of CO2loss during the fermentation of yeast strains

由圖2可知，TY8的發(fā)酵力最強(qiáng)，明顯高于CK，發(fā)酵過(guò)程相對(duì)平穩(wěn)，發(fā)酵峰值高；LY1的發(fā)酵力與CK相當(dāng)，發(fā)酵峰高于CK；但是在4 d后出現(xiàn)了波動(dòng)，發(fā)酵過(guò)程不平穩(wěn)，穩(wěn)定性較弱；TY2、Y1、Y2、LY3、TY5、TY6、Y3、Y4和Y5菌株發(fā)酵峰值低于CK，相繼在4 d后出現(xiàn)了波動(dòng)，發(fā)酵過(guò)程不平穩(wěn)，穩(wěn)定性明顯弱于TY8和CK，說(shuō)明它們的發(fā)酵能力弱于TY8和對(duì)照菌株；TY5的發(fā)酵峰值明顯低于其他菌株，且發(fā)酵穩(wěn)定性最弱。實(shí)驗(yàn)篩選得到的11 株人參果果酒酵母發(fā)酵速率有一個(gè)共同趨勢(shì)：即前2 d發(fā)酵速度呈線性增長(zhǎng)，待稍平穩(wěn)后再緩慢下降，7 d后發(fā)酵速度降至最低，之后下降幅度變化不大。

2.4 酵母菌耐SO2、耐乙醇實(shí)驗(yàn)結(jié)果

SO2是果酒釀造過(guò)程中一種必需的食品添加劑[33]，果酒中添加適量的SO2不僅具有抑菌、抗氧化和增酸作用，還可明顯改善果酒的風(fēng)味[34]；乙醇是果酒質(zhì)量的重要組成成分，一般果酒的酒精度在8%～14%之間，因此一株優(yōu)良釀酒酵母必須兼具一定的耐SO2和耐乙醇能力。

由表3可知，實(shí)驗(yàn)菌株TY8、Y1、Y5和CK對(duì)SO2有很好的耐受性，即使在SO2質(zhì)量濃度達(dá)到250 mg/L時(shí)，起酵時(shí)間和產(chǎn)氣速率也并未受到明顯的影響，10 h內(nèi)產(chǎn)氣量便可達(dá)到杜氏小管滿體積；TY6耐SO2能力最差，在SO2質(zhì)量濃度為100 mg/L時(shí)已經(jīng)被完全抑制，在2 d之內(nèi)沒(méi)有產(chǎn)氣現(xiàn)象；而SO2質(zhì)量濃度為50 mg/L時(shí)也是48 h產(chǎn)氣量才達(dá)到杜氏管滿體積；菌株TY5、Y3、Y4、LY3、LY1、Y2和TY2的耐SO2性能介于以上兩類菌株之間，且TY6、TY5和LY1在發(fā)酵結(jié)束后有令人不愉快的氣味產(chǎn)生，因此不作為發(fā)酵菌考慮?；趪?guó)標(biāo)中對(duì)果酒釀造要求的SO2添加量一般為50～250 mg/L的規(guī)定，同時(shí)考慮菌株對(duì)SO2的耐受性，TY8、Y1、Y5和CK都符合釀造要求。

表3 酵母菌的SO2耐性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table3 SO2tolerance of yeast strains

表4 酵母菌的乙醇耐性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table4 Ethanol tolerance of yeast strains

由表4可知，TY8和CK對(duì)乙醇有很好的耐受力，在不高于12.5%酒精度的人參果發(fā)酵液中1 d內(nèi)產(chǎn)氣量便可達(dá)到杜氏小管滿體積；14%酒精度條件下3 d之內(nèi)也可以使產(chǎn)氣達(dá)到杜氏小管滿體積。Y2、TY2和LY3對(duì)乙醇有較好的耐性，在低于酒精度11%的人參果發(fā)酵液中達(dá)到杜氏小管滿體積需要3 d，而酒精度12.5%時(shí)產(chǎn)氣達(dá)到杜氏小管滿體積則需要4 d；Y2和TY2在14%酒精度條件下5 d產(chǎn)氣才達(dá)到杜氏小管滿體積。Y1和Y5在較低酒精度（不高于9.5%）的人參果發(fā)酵液中2 d內(nèi)產(chǎn)氣量可達(dá)到杜氏小管滿體積；但Y1和Y5不耐高酒精度，其中Y5在酒精度11%的人參果發(fā)酵液中即已被抑制，而Y1在酒精度12.5%的人參果發(fā)酵液中也被抑制。由于工業(yè)化生產(chǎn)一般是濃醪發(fā)酵，而在濃醪發(fā)酵時(shí)高濃度底物相應(yīng)也會(huì)生成較高濃度的酒精，過(guò)高的酒精度對(duì)酵母有毒性，甚至可能是致死性的，會(huì)抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)及發(fā)酵活性。所以酵母的發(fā)酵能力在很大程度上取決于它們自身酒精耐受力的大小[35]。據(jù)此原理，TY8菌株和Y2、TY2以及LY3菌株可能有較高的發(fā)酵度。另外，由表4可知，隨著酒精度的增加，產(chǎn)氣酵母逐漸減少，在14%酒精度的人參果發(fā)酵液中TY8和CK菌株到第3天產(chǎn)氣量才達(dá)到杜氏小管滿體積，可能是由于較高的酒精度對(duì)細(xì)胞膜的通透性產(chǎn)生了致死性的損傷，因此，隨著酒精度增加，產(chǎn)氣酵母逐漸減少，這也驗(yàn)證了前人的結(jié)論[31]。根據(jù)國(guó)際葡萄酒協(xié)會(huì)規(guī)定葡萄酒的酒精度一般在8.5%之上，所以從耐酒精性能上講，菌株TY8基本滿足人參果果酒的釀造要求。

綜上測(cè)試結(jié)果，選定TY8、Y1、Y5和對(duì)照CK 4 株菌進(jìn)行進(jìn)一步酒精發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。

2.5 酒精發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5.1 不同菌種在人參果果酒發(fā)酵過(guò)程中酵母生長(zhǎng)曲線的變化

圖3 不同菌種在人參果果酒發(fā)酵過(guò)程中酵母生長(zhǎng)曲線Fig.3 Growth curve of selected yeast strains during the fermentation of pepino fruit wine

如圖3所示，隨著人參果果酒發(fā)酵的進(jìn)行，酵母菌開(kāi)始增殖。其中TY8和CK在第1天即進(jìn)入生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，菌體量達(dá)到最大，在供試的4 株菌種中，TY8在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中生長(zhǎng)量最大，且高于對(duì)照組CK；之后酵母菌的生長(zhǎng)速度下降，酒液開(kāi)始變得澄清、透明、穩(wěn)定；而Y1和Y5酵母發(fā)酵前期生長(zhǎng)緩慢，Y5菌和Y1菌分別于發(fā)酵的第3、4天達(dá)到最大生長(zhǎng)量，之后隨著發(fā)酵的進(jìn)行生長(zhǎng)速度放慢。在剛開(kāi)始的24 h內(nèi)TY8生長(zhǎng)速度最快，其次是CK，再次是Y1和Y5。在第1天以后Y1和Y5開(kāi)始呈現(xiàn)旺盛生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)，Y1緩慢上升；Y5迅速上升到最高點(diǎn)。而此時(shí)TY8和CK生長(zhǎng)則出現(xiàn)下降趨勢(shì)，二者開(kāi)始進(jìn)入衰亡期，并于第4天后進(jìn)入穩(wěn)定期；Y1和Y5在第6天進(jìn)入穩(wěn)定期。這4株菌在主發(fā)酵后期存在不同程度的下降趨勢(shì)，這可能是由于隨著主酵的進(jìn)行，人參果果酒醪液中乙醇含量逐漸增加，達(dá)到一定程度后，對(duì)4 種酵母菌株產(chǎn)生抑制作用的緣故。由圖4可以進(jìn)一步看出，供試的4 株菌株，TY8和CK菌起酵速度較快，發(fā)酵1 d即達(dá)到最大生長(zhǎng)量；而Y1和Y5起酵速度較慢，分別在發(fā)酵第3、4天才達(dá)到較大生長(zhǎng)量；但縱觀4 株菌株在發(fā)酵后期的表現(xiàn)，TY8和CK菌達(dá)到最大生長(zhǎng)量后即迅速下降，不能在整個(gè)發(fā)酵周期維持相對(duì)較快的生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)；而Y5和Y1菌雖起酵較慢，最大生長(zhǎng)量不如TY8和CK菌，但發(fā)酵后期能始終維持相對(duì)較快的生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)，說(shuō)明此二株菌對(duì)乙醇的耐受力應(yīng)強(qiáng)于TY8和CK。

2.5.2 不同酵母發(fā)酵過(guò)程中SSC的變化

圖4 不同酵母發(fā)酵過(guò)程中SSC的變化Fig.4 Changes in SSC during the fermentation of selected yeast strains

如圖4所示，人參果酒發(fā)酵前期，TY8和CK發(fā)酵的人參果發(fā)酵液的SSC下降迅速，2 d后即漸趨穩(wěn)定；而Y1菌和Y5菌3 d內(nèi)下降趨勢(shì)較緩慢。由發(fā)酵結(jié)束時(shí)人參果果酒酒精度測(cè)試結(jié)果可知：Y1菌和Y5菌發(fā)酵結(jié)束后酒精度小于10%，因此，兩株酵母在整個(gè)發(fā)酵期間需耐酒精度較低從而能保持較高的生長(zhǎng)量；而TY8和CK菌發(fā)酵的人參果果酒酒精度較高（高于10%），所以高體積分?jǐn)?shù)乙醇對(duì)酵母抑制率較強(qiáng)，因而TY8和CK菌在達(dá)到最大生長(zhǎng)量后迅速下降，很快進(jìn)入了衰亡期。

SSC變化驗(yàn)證了生長(zhǎng)曲線結(jié)論，TY8和CK菌在發(fā)酵1 d達(dá)到最大生長(zhǎng)量，此時(shí)菌體生長(zhǎng)繁殖依靠人參果果汁中可溶性糖類作為碳源進(jìn)行自身生長(zhǎng)，SSC下降速度極快；之后SSC下降趨勢(shì)趨于穩(wěn)定；而Y1和Y5菌分別于發(fā)酵的第3、4天生長(zhǎng)量達(dá)到最大，在此期間，利用糖類作為碳源進(jìn)行自身生長(zhǎng)繁殖和乙醇轉(zhuǎn)化力較強(qiáng)；之后兩株酵母進(jìn)入衰亡期，利用碳源進(jìn)行自身生長(zhǎng)和乙醇轉(zhuǎn)化力大大降低；發(fā)酵后期，Y1和Y5菌維持一個(gè)短暫的穩(wěn)定期，在此期間，人參果發(fā)酵液中Y1和Y5菌菌體濃度達(dá)到最大，需要更多的糖源供給和用于乙醇轉(zhuǎn)化，所以SSC下降趨勢(shì)加快；之后Y1和Y5菌的發(fā)酵液乙醇體積分?jǐn)?shù)上升，酵母開(kāi)始衰亡，菌株利用糖源和乙醇轉(zhuǎn)化力有限。故發(fā)酵液中SSC趨于穩(wěn)定。

2.5.3 不同酵母發(fā)酵過(guò)程中還原糖質(zhì)量濃度的變化

在發(fā)酵過(guò)程中，每天測(cè)定不同酵母發(fā)酵人參果酒的還原糖，繪制發(fā)酵過(guò)程變化曲線。人參果果汁中的還原糖有兩部分，一部分是人參果果汁中原有的還原糖，另一部分來(lái)源于人參果營(yíng)養(yǎng)成分氧化分解和外加糖源而來(lái)。隨著主發(fā)酵的進(jìn)行，人參果汁中的非還原糖分解成還原糖，同時(shí)酵母利用人參果中的還原糖，把還原糖轉(zhuǎn)化為酒精。

圖5 不同酵母發(fā)酵過(guò)程中還原糖質(zhì)量濃度的變化Fig.5 Changes in reducing sugar during the fermentation of selected yeast strains

如圖5所示，隨著主發(fā)酵的進(jìn)行，4 組處理均于發(fā)酵第1天還原糖質(zhì)量濃度出現(xiàn)大幅度增加現(xiàn)象，此時(shí)人參果發(fā)酵液中的淀粉等多糖降解為單糖和寡糖，還原糖質(zhì)量濃度增加，所以測(cè)定的人參果發(fā)酵液中還原糖質(zhì)量濃度高于初始還原糖質(zhì)量濃度；之后，大量增殖的酵母菌開(kāi)始利用還原糖轉(zhuǎn)化為酒精，還原糖質(zhì)量濃度又大幅度下降，直至趨于穩(wěn)定。其中TY8和CK組第2天還原糖開(kāi)始迅速下降，發(fā)酵2 d后趨于穩(wěn)定；而Y1和Y5則較比下降緩慢，到發(fā)酵第5天時(shí)才趨于穩(wěn)定。這是因?yàn)榘l(fā)酵伊始，人參果發(fā)酵液中多糖等物質(zhì)水解，而酵母此時(shí)雖利用發(fā)酵液中糖源進(jìn)行自身生長(zhǎng)，但菌數(shù)尚未達(dá)到最大值，故發(fā)酵液中還原糖質(zhì)量濃度出現(xiàn)不降反增的現(xiàn)象；隨后，發(fā)酵液中菌數(shù)達(dá)到最大并進(jìn)入穩(wěn)定期和衰亡期，此時(shí)，4 種酵母菌開(kāi)始利用發(fā)酵液中的糖源進(jìn)行乙醇轉(zhuǎn)化，且發(fā)酵液中日益增高的酒精度又抑制了酵母菌的生長(zhǎng)繁殖和乙醇的轉(zhuǎn)化力，故還原糖質(zhì)量濃度在大量下降后又趨于穩(wěn)定。

2.5.4 不同酵母發(fā)酵過(guò)程中總酸含量的變化

果酒中的可滴定酸對(duì)酒的釀造與感官質(zhì)量有重要意義，它直接影響發(fā)酵液的pH值，繼而影響到酵母的繁殖能力、細(xì)胞活性、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收以及產(chǎn)物的代謝與分泌[36]。在釀造過(guò)程中，許多生化反應(yīng)也與可滴定酸有關(guān)。Na2S2O3·5H2O本身顯弱酸性，加入果汁中能增加其酸度，同時(shí)，酒精發(fā)酵過(guò)程中會(huì)伴隨一些細(xì)菌參與的蘋(píng)果酸-乳酸發(fā)酵，使果汁中酸味明顯，發(fā)酵后轉(zhuǎn)化成口感柔和的乳酸，果酒口味柔和、細(xì)膩、圓潤(rùn)[37]。

圖6 不同酵母發(fā)酵過(guò)程中總酸含量的變化Fig.6 Changes in total acid during the fermentation of selected yeast strains

如圖6所示，隨著主發(fā)酵的進(jìn)行，由Y1和Y5菌接種的人參果發(fā)酵液總酸含量迅速上升，發(fā)酵4～5 d后達(dá)到最大值，之后趨于穩(wěn)定。由TY8和CK接種的人參果發(fā)酵液總酸含量在整個(gè)發(fā)酵期間變化幅度不大，兩者最高達(dá)到3.188 g/L；而Y1和Y5發(fā)酵液中總酸含量的變化遠(yuǎn)高于TY8和CK，在前2 d 4 株菌接種的發(fā)酵液總酸含量變化趨于一致，2 d以后Y1和Y5菌總酸含量開(kāi)始迅速上升，原因可能是Y1和Y5本身能夠產(chǎn)酸且產(chǎn)酸能力大于TY8和CK。結(jié)合圖3可知，前2 d Y1和Y5生長(zhǎng)緩慢產(chǎn)酸相應(yīng)的比較少，2 d后Y1和Y5菌快速生長(zhǎng)，產(chǎn)酸量也隨之迅速上升；而隨著酒精度和總酸的升高，酵母菌活力開(kāi)始被抑制，產(chǎn)酸量也開(kāi)始趨于穩(wěn)定。

2.5.5 不同酵母發(fā)酵產(chǎn)人參果果酒的酒精度

圖7 不同酵母發(fā)酵產(chǎn)人參果果酒的酒精度Fig.7 Alcohol contents produced by selected yeast strains

如圖7所示，4 株菌中，以TY8和CK接種發(fā)酵的人參果果酒酒精度最高，可以達(dá)到10.2%和9.9%。其次是Y1，酒精度為8.9%，酒精度最低的是Y5，酒精度為8%。符合GB/T 15038—2006對(duì)果酒酒精度的規(guī)定。

2.5.6 感官評(píng)價(jià)

表5 不同酵母菌釀制人參果果酒的感官評(píng)價(jià)Table5 Sensory evaluation of pepino fruit wine produced by different yeast strains

由表5可知，由酵母TY8發(fā)酵的人參果果酒色澤金黃，酒體豐滿，富有酒香的典型性和人參果固有的果香，酒體醇厚、透明，可以與對(duì)照酵母CK發(fā)酵的人參果果酒相媲美。而其他2 株實(shí)驗(yàn)酵母Y1和Y5發(fā)酵的原酒殘?zhí)橇扛?，口感風(fēng)味弱于對(duì)照組CK，且酒體組織略顯渾濁。且因Y1發(fā)酵的人參果果酒有異味物質(zhì)生成，故不能滿足成品人參果果酒的要求；而Y5菌雖發(fā)酵后酒精度不足，略有澀味，但總體基本滿足人參果果酒酵母篩選要求；兼顧其發(fā)酵后期對(duì)乙醇耐受力較強(qiáng)，可長(zhǎng)期在發(fā)酵液中保持旺盛生長(zhǎng)，故可考慮與TY8和CK菌混合發(fā)酵，從而豐富人參果果酒口感。

3 結(jié) 論

以安琪牌葡萄酒活性干酵母CK作為對(duì)照菌株，通過(guò)對(duì)11 株自篩酵母菌發(fā)酵力比較、耐SO2、耐乙醇能力篩選，初步篩選出3 株發(fā)酵性能好的菌株。通過(guò)綜合比較、理化指標(biāo)分析及感官評(píng)價(jià)，結(jié)果表明：酵母TY8是一株釀造人參果果酒的良好菌株，具有較高的發(fā)酵力，且起酵時(shí)間只有10 h，可以耐受12.5%乙醇和250 mg/L SO2，用其發(fā)酵的人參果果酒酒精度高達(dá)10.2%，酒體澄清透明，具有人參果果酒的典型風(fēng)味。而Y5菌雖發(fā)酵后酒精度較低，酒香不足，略有澀味，但考慮其在人參果果酒發(fā)酵中能始終維持較高的生長(zhǎng)量，對(duì)乙醇耐受力較高，故可考慮用它與CK菌、TY8菌進(jìn)行混菌發(fā)酵以豐富人參果果酒口感。本研究篩選得到的菌株未進(jìn)行分類鑒定和毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)，有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證完善。

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Screening and Fermentation Characteristics of Indigenous Yeast Strains from Spontaneously Fermented Pepino Fruit (Solanum muricatum Ait.)

SU Fengxian, ZHANG Jing, ZHENG Xiaojie*
(Department of Agricultural and Biological Technology, Wenzhou Vocational College of Science and Technology, Wenzhou 325006, China)

This study aimed to obtain a yeast strain suitable for the alcoholic fermentation of pepino fruit (Solanum muricatum Ait.) from the Hexi Corridor in Gansu. A total of 20 indigenous yeast strains were isolated from spontaneously fermented pepino juice. Out of these, 11 isolates were screened for their good fermentation performance as examined by microscopy, which were named TY8, TY5, TY6, Y3, Y4, Y5, LY3, LY1, Y1, Y2 and TY2, respectively. By comparing fermentation capacity, alcohol tolerance, SO2tolerance, physicochemical properties and sensory evaluation with active dry wine yeast, TY8 was found to be suitable for the fermentation of pepino fruit wine. The wine fermented by this strain had distinct aroma characteristics and developed a typical flavor, being clear and transparent.

Saccharomyces cerevisiae; screening; fermentation characteristics; SO2tolerance; alcohol tolerance

10.7506/spkx1002-6630-201704017

TS262.7；Q935

A

1002-6630（2017）04-0100-07

蘇鳳賢, 張井, 鄭曉杰. 人參果自然發(fā)酵醪中酵母菌種篩選及其發(fā)酵性能[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(4): 100-106.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201704017. http://www.spkx.net.cn

SU Fengxian, ZHANG Jing, ZHENG Xiaojie. Screening and fermentation characteristics of indigenous yeast strains from spontaneously fermented pepino fruit (Solanum muricatum Ait.)[J]. Food Science, 2017, 38(4): 100-106. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201704017. http://www.spkx.net.cn

2016-06-28

浙江省教育廳訪問(wèn)工程師校企合作項(xiàng)目（FG2014198）；溫州市公益性科技計(jì)劃項(xiàng)目（N20140043；N20140042；N20150031）；浙江省課堂教學(xué)改革項(xiàng)目（KG2015975）；溫州市科技特派員專項(xiàng)（X20150007）

蘇鳳賢（1974—），女，副教授，碩士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：supeiecho@sina.com

*通信作者：鄭曉杰（1975—），女，教授，碩士，研究方向?yàn)檗r(nóng)特產(chǎn)品加工與綜合利用。E-mail：zxj75719@163.com