王曉丹，陳美竹，班世棟，邱樹毅,*

（1.貴州大學(xué) 貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；3.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

茅臺大曲中酵母的分離、鑒定及其功能初探

王曉丹1,2,3，陳美竹1,2，班世棟1,3，邱樹毅1,3,*

（1.貴州大學(xué) 貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；3.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

采用可培養(yǎng)方法對醬香型白酒大曲中的酵母菌進(jìn)行計數(shù)和篩選，通過形態(tài)學(xué)特征、生理生化實(shí)驗(yàn)及酵母26S rDNA分子生物學(xué)方法鑒定酵母，并分析酵母的發(fā)酵能力和風(fēng)味成分。結(jié)果表明，醬香型大曲中酵母數(shù)量為103CFU/g；共分離鑒定6 種酵母，各酵母產(chǎn)香能力不同，編號FBKL2.0071扣囊復(fù)膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）固態(tài)發(fā)酵物具有濃郁的果香味，其中以乙酸乙酯、乙酸異戊酯、苯乙醇、乙酸苯乙酯、棕櫚酸乙酯含量較高。編號FBKL2.0082多株伯頓絲孢畢赤酵母（Hyphopichia burtonii）固態(tài)發(fā)酵物呈濃郁的花香味，其中以乙酸乙酯、乙酸異戊酯和苯乙醇含量較高。這兩株酵母固態(tài)發(fā)酵時都能產(chǎn)生大量的酯類和醇類等揮發(fā)性香味物質(zhì)，還有少量醛、酮、酚和烷類等物質(zhì)。分離得到的酵母產(chǎn)酒能力不同，總體產(chǎn)酒能力不高。

醬香型大曲；酵母；風(fēng)味成分；產(chǎn)酒性能

酵母從醬香型白酒制曲、堆積和窖池發(fā)酵整個釀造過程中均能檢出，是醬香型白酒釀造微生物家族的重要成員之一[1]。高溫制曲工藝是醬香型白酒生產(chǎn)的一大特色，曲磚發(fā)酵時間長，發(fā)酵中后期品溫高達(dá)60 ℃以上。早前研究認(rèn)為發(fā)酵制曲的前期酵母菌大量繁殖，但是中后期高溫環(huán)境不適宜酵母生長，隨著制曲發(fā)酵過程中品溫逐漸升高，酵母菌生長被抑制，在發(fā)酵中后期僅能少量或不能檢出酵母[2]。雖然利用傳統(tǒng)分離方法可從高溫成品曲中檢出酵母，但數(shù)量較低為103～105CFU/g，低于細(xì)菌數(shù)量2～3 個數(shù)量級，而免培養(yǎng)的手段能檢測出酵母數(shù)量占醬香型大曲真菌數(shù)量的2.6%[3-5]，因而在醬香型白酒高溫成品大曲中仍然存在一定數(shù)量的酵母。從醬香型大曲中檢測出的酵母包括假絲酵母屬（Candida）、酵母屬（Saccharomyces）、絲孢酵母屬（Trichosporon）、伊薩酵母屬（Issatchenkia）、地霉屬（Geotrichum）、畢赤酵母屬（Pichia）、接合酵母屬（Zygosaccharomyces）、紅酵母屬（Rhodotorula）、漢遜酵母屬（H a n s e n u l a）、復(fù)膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）、隱球酵母屬（Cryptococcus）、德巴利酵母酵母屬（Debaryomyces）、絲孢畢赤酵母屬（Hyphochia）等屬的酵母[1]。

目前，對醬香型白酒中酵母功能的研究主要包括對產(chǎn)酒酵母和產(chǎn)香酵母的篩選。產(chǎn)酒酵母主要影響醬香型白酒的產(chǎn)量，而產(chǎn)香酵母對醇和酸具有較強(qiáng)的酯化能力，產(chǎn)生的物質(zhì)對酒體風(fēng)格形成具有重要作用[6]。從醬香型白酒生產(chǎn)中分離到的卡斯特假絲酵母（Candida casterllani）、栗酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）MT-14、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、Kazachstania exigua、白地霉（Geotrichum candidum）、東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）、克柔念珠菌（Candida krusei）等酵母變現(xiàn)出較好的發(fā)酵能力[7-9]。而分離到的平常假絲酵母（Candida inconspicua）和庫德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）、東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）、意大利酵母（Saccharomyces italicus）、地生酵母（Saccharomyces telluris）、Saccharomyces cerevisiae、間型假絲酵母（Candida intermedia）、膜璞畢赤酵母（Pichia membranifaciens）、Candida krusei、拜耳結(jié)合酵母（Zygosaccharomyces bailii）、栗酒裂殖酵母（Schizosaccharomyce spombe）、Kazachstania exigua、白地霉（Galactomyces geotrichum）、絲孢酵母屬（Trichosporon）、漢遜酵母屬（Hansenula）等酵母在一定條件下表現(xiàn)出較好的產(chǎn)香能力[3,6,8,10]。

本研究對醬香型白酒高溫大曲中酵母數(shù)量、種類和功能特性進(jìn)行了分析，旨在為改善醬香型白酒生產(chǎn)挖掘優(yōu)質(zhì)功能酵母資源，為醬香型大曲的科學(xué)生產(chǎn)和管理提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與培養(yǎng)基

醬香型白酒高溫大曲為貴州茅臺酒股份有限公司釀酒車間粉碎后的生產(chǎn)用曲，取樣時間為2015年10月。

酵母DNA提取試劑盒 美國Biomiga公司；美藍(lán)染液北京諾博萊德科技有限公司；其他試劑均為分析純。

固態(tài)產(chǎn)香培養(yǎng)基[3,6]：小麥全粉碎，高粱整粒-碎粒質(zhì)量比3∶1，高粱-小麥質(zhì)量比1∶1，稱量混勻，加入95 ℃潤糧5 h（水為50%～60%），121 ℃滅菌20 min，無菌條件下按200 U/g淀粉加入糖化酶，60 ℃處理2 h，裝瓶115 ℃滅菌20 min備用。2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）上層培養(yǎng)基（培養(yǎng)基冷卻至60 ℃左右，在無菌條件下加入0.05%的TTC染色劑溶解混勻倒平板）、麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基、缺維生素培養(yǎng)基、氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基、碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基配制參照文獻(xiàn)[11-13]。葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20%，酵母膏1%，(NH4)2SO40.1%，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O 0.1%，115 ℃滅菌 20 min[14]。麥芽汁培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基、玉米粉瓊脂培養(yǎng)基和孟加拉紅培養(yǎng)基均購于上海博微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HP6890/5975C氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用儀 美國安捷倫公司；GT10-1型高速離心機(jī) 北京時代北利離心機(jī)有限公司；PTC-100型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母計數(shù)

稱取大曲樣品10 g至裝有玻璃珠的90 mL無菌生理鹽水的三角瓶中，混勻備用。無菌條件下取上清液進(jìn)行梯度稀釋，取10-1、10-2、10-3、10-4、10-5濃度梯度的菌液1 mL于孟加拉紅培養(yǎng)基，傾注法培養(yǎng)計數(shù)。培養(yǎng)條件為30 ℃培養(yǎng)2 d，計數(shù)范圍為30～300 個，做3 個平行[15]。

1.3.2 酵母分離篩選

根據(jù)計數(shù)結(jié)果，按1.3.1節(jié)進(jìn)行菌液稀釋，取1 mL 10-3梯度菌液于孟加拉紅培養(yǎng)基上，用涂布棒涂布均勻，于30 ℃培養(yǎng)2 d，挑選不同且具有典型酵母菌落形態(tài)特征的菌株在平板上劃線純化，酵母菌落質(zhì)地均勻，正面與反面以及邊緣與中央部位的顏色較一致，菌落一般較大，黏稠，隆起，表面和邊緣光滑或粗糙，多數(shù)為乳白色，少數(shù)為紅色、黑色等[16]，再挑取單菌落進(jìn)行斜面保存并編號，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次。

1.3.3 形態(tài)特征觀察

將菌株接種于PDA培養(yǎng)基，30 ℃倒置培養(yǎng)3 d，觀察并記錄菌落形狀、顏色、透明度、邊緣、質(zhì)地、濕潤程度等菌落特征；在載玻片上滴加一滴美蘭染液，用接種環(huán)涂布少許菌體并蓋上蓋玻片，100 倍油鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)特征；將酵母接種于玉米粉瓊脂培養(yǎng)基和麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)數(shù)天，分別觀察假菌絲和子囊孢子[12]。

1.3.4 生理生化實(shí)驗(yàn)

對酵母菌進(jìn)行碳源同化實(shí)驗(yàn)、氮源同化實(shí)驗(yàn)、產(chǎn)類淀粉實(shí)驗(yàn)、脲酶實(shí)驗(yàn)、產(chǎn)類淀粉實(shí)驗(yàn)[12]，并參照《酵母菌的特征與鑒定手冊》加以對比鑒定判斷[13]。

1.3.5 分子鑒定

酵母菌DNA提取以及26SrDNA D1/D2區(qū)域的PCR擴(kuò)增[17]；引物：NL1（5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAA AG-3’）/NL4（5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’），引物對合成及PCR產(chǎn)物測序由上海立菲生物技術(shù)有限公司完成；將測序數(shù)據(jù)在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源序列搜索（BLAST search，http://blast.ncb-i.nlm.nih.gov/Blast. cgi），選取同源性較高的相關(guān)菌株的26SrDNA D1/D2區(qū)域序列作為參比對象[18-19]；用MEGA5.05軟件進(jìn)行多序列比對，采用Kimura2模型計算進(jìn)化距離，并用鄰接法（Neighbor-Joining）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。進(jìn)化樹拓?fù)浞治鰹? 000 個重復(fù)取樣的結(jié)果[18]。

1.3.6 酵母產(chǎn)香特性分析

酵母產(chǎn)香初級評定：將酵母菌株接種在50 mL麥芽汁液體培養(yǎng)基，30 ℃、160 r/min培養(yǎng)48 h，對發(fā)酵液的酯、酸、酒味進(jìn)行感官評價，氣味強(qiáng)度按照數(shù)字1～10逐漸升高，數(shù)值越高接受性越強(qiáng)，篩選總體可接受性最好的酵母進(jìn)行固態(tài)產(chǎn)香實(shí)驗(yàn)。

產(chǎn)香酵母固態(tài)發(fā)酵：將篩選出的酵母接入20 mL麥芽汁液體培養(yǎng)基，30 ℃、160 r/min擴(kuò)培24 h，按4%的接種量接入固態(tài)產(chǎn)香培養(yǎng)基中，發(fā)酵5 d，篩選出產(chǎn)香最好的酵母利用GC-MS進(jìn)行揮發(fā)性成分分析[3]。

1.3.7 酵母產(chǎn)酒特性分析

酵母菌30 ℃培養(yǎng)48 h后在酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose medium，YPD）上長出單菌落，傾入融化45 ℃左右的TTC上層培養(yǎng)基，覆蓋菌落，避光保存3 h，隨時觀察菌落的顏色變化。由菌落呈色的深淺來判定酵母產(chǎn)酒精能力的大小，選取顏色較深的菌株進(jìn)行產(chǎn)酒實(shí)驗(yàn)[20]。將篩選的酵母接入20 mL麥芽汁發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃搖床160 r/min擴(kuò)培24 h，再按4%比例接種至葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，密封發(fā)酵5 d，記錄CO2總質(zhì)量損失量，并測定酒精度以及殘?zhí)橇俊＞凭葴y定詳見文獻(xiàn)[12]；利用直接滴定法來測定發(fā)酵液中殘?zhí)橇浚唧w做法參見GB/T 5009.7—2008《食品中還原糖的測定》[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 計數(shù)與篩菌

醬香型大曲中酵母數(shù)量為103CFU/g，共分離篩選出12株酵母。觀察酵母的單菌落形態(tài)，形狀均為圓形，記錄結(jié)果如圖1和表1?？煽闯?，分離出的12 株酵母多為圓形，直徑大小在5～9 mm，邊緣多為完整，菌落易挑起，不透明。

圖1 酵母單菌落圖Fig.1 Single colonies of yeasts

表1 茅臺大曲酵母單菌落形態(tài)描述Table1 Description of single colony morphology of yeasts in Moutai-f l avor Daqu

由表2和圖2可看出，分離到的12株酵母在熒光顯微鏡下除FBKL2.0075、FBKL2.0076、FBKL2.0080外其余菌株均能產(chǎn)子囊孢子和假菌絲，均以芽殖方式繁殖，在掃描電子顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)均為圓形或卵圓形。

表2 醬香型大曲中酵母顯微形態(tài)描述Table2 Description of microscopic morphological features of yeasts in Moutai-f l avor Daqu

圖2 醬香型大曲中酵母掃描電鏡圖Fig.2 SEM observation of the morphological characteristics of yeasts in Moutai-f l avor Daqu

2.2 生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 醬香型大曲中酵母生理生化實(shí)驗(yàn)Table3 Physiological and biochemical properties of yeasts in Moutai-f l avor Daqu

由表3可知，F(xiàn)BKL2.0071和FBKL2.0081與Saccharomycopsis fibuligera相似；FBKL2.0073與長孢洛德酵母（Lodderomyces elongisporus）相似；FBKL2.0072、FBKL2.0078、FBKL2.0079和FBKL2.0082與Hyphopichia burtonii相似；FBKL2.0074和FBKL2.0077與Issatchenkia orientalis相似；FBKL2.0075和FBKL2.0076與Cryptococcus相似；FBKL2.0080與紅冬孢酵母屬（Rhodosporidium）相似。

2.3 26S rDNA測序和系統(tǒng)發(fā)育分析

將各酵母測序數(shù)據(jù)在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源序列搜索（BLAST search），實(shí)驗(yàn)菌株與已知菌株序列之間的最高同源性均不小于99%，系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。結(jié)合生理生化實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞形態(tài)特征，對上述酵母進(jìn)行鑒定。

結(jié)合以上實(shí)驗(yàn)，將FBKL2.0071和FBKL2.0081鑒定為Saccharomycopsis fibuligera，該菌與扣囊擬內(nèi)孢霉（Endomycopsis fibuligera）同物異名[22]；FBKL2.0074和FBKL2.0077鑒定為Issatchenkia orientalis；FBKL2.0073鑒定為Lodderomyces elongisporus；FBKL2.0072、FBKL2.0078、FBKL2.0079和FBKL2.0082鑒定為Hyphopichia burtonii；FBKL2.0080鑒定為紅冬孢酵母（Rhodosporidium fl uviale）；FBKL2.0075和FBKL2.0076鑒定為新型隱球酵母（Cryptococcus neoformans）。

此次所分離到的酵母與以往研究相比，Saccharomycopsis fibuligera、Issatchenkia orientalis和Hyphopichia burtonii在醬香型白酒高溫大曲中均有報道。在篩菌過程中，以類似Saccharomycopsis fibuligera表型出現(xiàn)的酵母最多；通過對多種大曲變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）圖譜進(jìn)行分析，表明高溫大曲中依然存在多種酵母，其中Saccharomycopsis fibuligera和異常畢赤酵母（Pichia anomala）在醬香大曲中處于優(yōu)勢地位，與本研究結(jié)果具有相似性[22]；此外從燒酒曲、清香型小曲酒醅中曾分離鑒定出Saccharomycopsis fi buligera[23-24]。從醬香型高溫大曲、醬香型白酒酒醅及醬香型白酒釀造過程均檢測分離到東方伊薩酵母，其代謝產(chǎn)物對醬香型白酒風(fēng)味物質(zhì)貢影響很大[1-17]。利用Biolog微生物自動鑒定系統(tǒng)對濃香型大曲分離到的一株酵母菌進(jìn)行鑒定為伯頓絲孢畢赤酵母[25]。

圖3 醬香型大曲酵母系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of yeasts in Moutai-f l avor Daqu

Lodderomyces elongisporus、Rhodosporidium fluviale、Cryptococcus neoformans屬首次從醬香型白酒高溫大曲中分離到[1]。Lodderomyces elongisporus從葡萄酒發(fā)酵過程曾篩選到，對葡萄酒釀造有較好的增香作用[26-27]；該酵母是益生菌，能調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)的變化，提高動物機(jī)體的免疫力[28-29]。Rhodosporidium fl uviale最先是從亞熱帶鹽漬環(huán)境中分離到[30]，后來在煙臺干紅葡萄酒發(fā)酵過程也有發(fā)現(xiàn)[31]。Cryptococcus neoformans是臨床上常見病原真菌[32-33]，是否為大曲中的酵母種類，在大曲中其作用未知，還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.4 酵母產(chǎn)香特性

對分離鑒定出的酵母進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)香實(shí)驗(yàn)，感官評價見表4。由表4可知，大曲中酵母的產(chǎn)香能力有明顯差異，同種之間產(chǎn)香感官特征較為接近。分離出的酵母產(chǎn)香均良好，產(chǎn)香綜合能力大于15的酵母的有6 株。選取這6株酵母進(jìn)行固態(tài)產(chǎn)香實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)表明，F(xiàn)BKL2.0071固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物呈濃郁的果香味，F(xiàn)BKL2.0082固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物呈濃郁的花香味，兩株酵母固態(tài)物香味均濃郁且柔和。

表4 醬香型大曲酵母產(chǎn)香感官評價Table4 Sensory evaluation of aroma-producing yeasts in Moutai-f l avor Daqu

2.5 FBKL2.0071和FBKL2.0082固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物揮發(fā)性物質(zhì)分析

表5 FBKL2.0071固態(tài)發(fā)酵物揮發(fā)性產(chǎn)物氣味分析Table5 Smell analysis of volatile compounds produced by FBKL2.0071 in solid-state fermentation

表6 FBKL2.0082固態(tài)發(fā)酵物揮發(fā)性產(chǎn)物氣味分析Table6 Smell analysis of volatile compounds produced by FBKL2.0082 in solid-state fermentation

將兩株酵母固態(tài)發(fā)酵物經(jīng)固相微萃取后進(jìn)行GC-MS分析檢測，用峰面積歸一化法測定了各化學(xué)成分的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)，對比分析，得到酵母固態(tài)發(fā)酵物中的揮發(fā)性組分名稱及相對百分含量，見表5和表6。

結(jié)合表5和表6可以看出：1）兩株酵母固態(tài)發(fā)酵時都能產(chǎn)生大量的揮發(fā)性香味物質(zhì)，這些揮發(fā)性香味物質(zhì)主要是酯類和醇類物質(zhì)，還有少量醛、酮、酚和烷類等物質(zhì)。2）FBKL2.0071固態(tài)發(fā)酵物揮發(fā)性香味成分中，多種產(chǎn)物也在不同程度上呈現(xiàn)出果香和花香等氣味，其中以帶有果香味的乙酸乙酯、有香蕉和梨的氣味的乙酸異戊酯、具有玫瑰香氣的苯乙醇、具有甜蜜香味的乙酸苯乙酯、具有果爵和奶油香氣的棕櫚酸乙酯含量較高；其固態(tài)發(fā)酵物感官評定呈現(xiàn)濃郁的果香味，是這些揮發(fā)性香味物質(zhì)的共同作用結(jié)果。3）FBKL2.0082固態(tài)發(fā)酵物揮發(fā)性香味成分中，以有果香味的乙酸乙酯、有香蕉和梨的氣味的乙酸異戊酯和具有玫瑰香氣的苯乙醇含量較高，而其他產(chǎn)物也在不同程度上呈現(xiàn)出花香。

2.6 酵母發(fā)酵能力篩選

TTC是一種是脂溶性光敏復(fù)合顯色指示劑，原本無色，但是在脫氫酶的作用下被還原為紅色的甲臢化合物TPF（1,3,5-triphenylformazan），因而可以通過酵母菌落在TTC下的變色程度來判定酵母呼吸酶活性和產(chǎn)酒性能的高低[19]。酵母TTC篩選結(jié)果如表7所示。

表7 茅臺大曲酵母發(fā)酵特性初步評判Table7 Fermentation characteristics of yeasts in Moutai-f l avor Daqu

由表7可以看出，在相同條件和培養(yǎng)時間內(nèi)，各酵母在TTC下呈色深淺不一（表中逐行顏色加深），這說明醬香型白酒大曲中酵母的產(chǎn)酒能力強(qiáng)弱不一。相比之下，顯色較深的FBKL2.0072、FBKL2.0078、FBKL2.0079可能具有更好的產(chǎn)酒能力，因而進(jìn)行進(jìn)一步發(fā)酵實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行分析。發(fā)酵結(jié)束時，通過考察CO2質(zhì)量損失量、酒精度以及殘?zhí)橇康戎笜?biāo)，以安琪酵母為參比對象，來對這些酵母的發(fā)酵性能做進(jìn)一步評判，結(jié)果見表9。

表8 酵母發(fā)酵液中CO2總質(zhì)量損失量、酒精度、殘?zhí)橇糠治鯰able8 Total CO2loss, alcohol concentration and residual sugar in yeast fermentation broths

由表8可以看出，在相同培養(yǎng)條件和發(fā)酵條件下，從醬香型白酒高溫成品大曲中篩出的酵母總體發(fā)酵力弱，糖利用率低。同產(chǎn)酒初篩實(shí)驗(yàn)比較分析，TTC培養(yǎng)基中反應(yīng)呈粉紅色的酵母產(chǎn)酒能力明顯較低，從而也反映了TTC培養(yǎng)基在初步分析酵母產(chǎn)酒能力時具有較好的效果。

3 討論與結(jié)論

醬香型大曲中酵母數(shù)量為103CFU/g，共分離篩選出12 株酵母。經(jīng)過形態(tài)觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)及分子鑒定，最終鑒定為6 種酵母，即Saccharomycopsis fi buligera、Issatchenkia orientalis、Hyphopichia burtonii、Cryptococcus neoformans、Lodderomyces elongisporus和Rhodosporidium fluviale。 Cryptococcus neoformans、Lodderomyces elongisporus和Rhodosporidium fluviale為首次在白酒大曲中發(fā)現(xiàn)的酵母種類。

產(chǎn)香實(shí)驗(yàn)表明，大曲中分離的酵母有6株具有較好的產(chǎn)香能力。其中，F(xiàn)BKL2.0071固態(tài)發(fā)酵物呈濃郁的果香味，F(xiàn)BKL2.0082固態(tài)發(fā)酵物呈濃郁的花香味，兩株酵母固態(tài)物香味均濃郁且柔和。GC-MS揮發(fā)性成分分析表明，兩株酵母固態(tài)發(fā)酵物中含有大量的酯類和醇類物質(zhì)，也能產(chǎn)生少量的醛、酮、酚和烷類物質(zhì)。產(chǎn)酒實(shí)驗(yàn)表明，分離的酵母總體發(fā)酵能力較弱，糖利用率低。

Saccharomycopsis fibuligera是大曲上霉的主要微生物，廣泛存在于成品曲中。該菌能夠表達(dá)生淀粉液化酶和糖化酶，被認(rèn)為是產(chǎn)生淀粉分解酶類的最好的子囊酵母菌之一，同時具有產(chǎn)酯能力[21-23]。本實(shí)驗(yàn)中分離到的Saccharomycopsis fi buligera既能產(chǎn)酒又能產(chǎn)香。

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Separation, Identif i cation and Functional Characterization of Yeast Strains from Moutai-Flavor Daqu, a Traditional Chinese Liquor Fermentation Starter

WANG Xiaodan1,2,3, CHEN Meizhu1,2, BAN Shidong1,3, QIU Shuyi1,3,*
(1. Guizhou Provincial Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biological Pharmacy, Guizhou University, Guiyang 550025, China; 2. College of Life Sciences, Guizhou University, Guizhou 550025, China; 3. School of Liquor and Food Engineering, Guizhou University, Guizhou 550025, China)

The yeasts in Moutai-flavor Daqu were counted and screened. Through morphological characteristics, physiological and biochemical tests, yeast 26S rDNA and molecular biology, we identified and classified the isolated yeasts. In addition, the fl avor compounds produced by the yeast strains in solid-state fermentation and their fermentation performance were also analyzed. The results showed that the number of yeasts in Moutai-f l avor Daqu was 103CFU/g. The yeasts isolated were classif i ed into 6 species. All the yeast strains showed different aroma-producing abilities. Among them, the solid-state fermented products of FBKL2.0071 (Saccharomycopsis fi buligera) smelled like full-bodied fruity fragrance, and the main volatile fl avor compounds included ethyl acetate, isoamyl acetate, phenylethyl alcohol, phenyl ethyl acetate and ethyl palmitate. Moreover, the solid-state fermented products of FBKL2.0082 (Hyphopichia burtonii) smelled like fullbodied fl owery fragrance, and the major volatile fl avor components, included ethyl acetate, isoamyl acetate and phenylethyl alcohol. These two strains not only could produce a large amount of alcohols and esters, but also produce small amounts of aldehydes and ketones. Besides, all the yeast strains showed different and poor ethyl alcohol-producing abilities.

Moutai-f l avor Daqu; yeast; fl avor composition; alcohol-producing ability

10.7506/spkx1002-6630-201704009

TS261.1

A

1002-6630（2017）04-0051-07

王曉丹, 陳美竹, 班世棟, 等. 茅臺大曲中酵母的分離、鑒定及其功能初探[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(4): 51-57.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201704009. http://www.spkx.net.cn

WANG Xiaodan, CHEN Meizhu, BAN Shidong, et al. Separation, identif i cation and functional characterization of yeast strains from Moutai-f l avor Daqu, a traditional Chinese liquor fermentation starter[J]. Food Science, 2017, 38(4): 51-57. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201704009. http://www.spkx.net.cn

2016-04-16

“十二五”國家科技支撐計劃項(xiàng)目（2011BAC06B12）；貴州省科技支撐計劃項(xiàng)目（黔科合支撐[2016]2340）；貴州省科技廳重大專項(xiàng)（黔科合重大專項(xiàng)字[2013]6009號）；貴州省省校合作計劃項(xiàng)目（黔科合LH字[2014]7672）

王曉丹（1980—），女，實(shí)驗(yàn)師，博士研究生，研究方向?yàn)閼?yīng)用生物技術(shù)。E-mail：wangxiaodan0516@126.com

*通信作者：邱樹毅（1963—），男，教授，博士，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程。E-mail：syqiu@gzu.edu.cn