焦富英，李國信，馬 進(jìn)，牟朝清，甘 雨，喬 敏，喬 鐵

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院 沈陽 110034；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 沈陽 110032）

失眠（insomnia）又稱睡眠障礙（sleep disorders，SD），是指患者睡眠質(zhì)量差，不能滿足個(gè)體生理需要，因而影響白天正常工作學(xué)習(xí)的睡眠障礙綜合征[1]。失眠屬于中醫(yī)的不寐范疇，是由心神失養(yǎng)或心神不安所致。不寐在《內(nèi)經(jīng)》中稱“不得臥”、“目不暝”，認(rèn)為是邪氣客于臟腑，衛(wèi)氣行于陽而不得入陰而成。中醫(yī)認(rèn)為不寐的病因病機(jī)是陽勝陰衰，陰陽失交，其治療原則當(dāng)以補(bǔ)虛瀉實(shí)，調(diào)整臟腑陰陽為主。中醫(yī)治療失眠療效顯著，安全可靠，副作用較小，無依賴性，是多數(shù)失眠患者的首選治療方法。中醫(yī)對(duì)失眠的常規(guī)療法為口服湯劑和針灸治療，然而口服湯劑有傷脾胃之弊端，針灸有患者暈針之顧慮，為此我們采用安神臍貼外治療法治療失眠。為了驗(yàn)證安神臍貼對(duì)失眠有確切療效，我們?cè)O(shè)計(jì)了本實(shí)驗(yàn)，通過觀察失眠大鼠用藥前后自主活動(dòng)的變化情況及血清中神經(jīng)遞質(zhì)五羥色胺（5-HT）、γ-氨基丁酸（GABA）的含量變化來觀察安神臍貼對(duì)失眠的治療效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要儀器

SD大鼠，雄性，SPF級(jí)，體重180-220 g；購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（遼）2015-0001。EthoVision大小鼠行為學(xué)系統(tǒng)，荷蘭NOLUDS公司生產(chǎn)；電熱恒溫水浴箱，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬二院檢驗(yàn)科提供，規(guī)格型號(hào)：HH-W21-600；全自動(dòng)快速立式洗板機(jī)，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬二院檢驗(yàn)科提供，規(guī)格型號(hào)：JB-1。受試動(dòng)物購入后在遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬二院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心適應(yīng)性觀察飼養(yǎng)后使用。許可證號(hào)：SYXK（遼）2012-0003。觀察室溫度20-23℃，相對(duì)濕度50%-60%。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑

安神臍貼由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院制劑中心提供；同仁安神丸由北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠生產(chǎn)，批號(hào)：15015079；對(duì)氯苯丙氨酸（4-Chloro-DL-phenylalanine,PCPA）由SIGMA公司生產(chǎn)，批號(hào)：SHBD9164V；生理鹽水，華仁藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：Q1611028。Rat 5-HT Elisa kit試劑盒和Rat GABA Elisa kit試劑盒，均購自沈陽天瑞生物科技有限公司，批號(hào)：201703。

1.3 模型制備與分組

取健康SD大鼠50只，體重180-220 g，雄性。大鼠腹部剃毛，24 h后按隨機(jī)數(shù)字表法分為5組，分別為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、安神臍貼高劑量組（5.40 g/kg/日）、安神臍貼低劑量組（1.35 g/kg/日）、同仁安神組（2.16 g/kg/日），每組10只。除空白對(duì)照組外各組大鼠腹腔注射PCPA（350 mg·kg-1），每日1次，連續(xù)2日，建立失眠大鼠模型。從第3日開始空白組和模型組在神闕穴部位敷空白貼，安神臍貼組每天在神闕穴部位分別給予相應(yīng)劑量的安神臍貼，同仁安神丸組灌胃給藥，連續(xù)給藥5天。安神臍貼組每日更換相應(yīng)劑量的臍貼，同仁安神丸組每日按規(guī)定劑量灌胃給藥。高、低劑量的安神臍貼形狀相同，含藥量不同。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于末次給藥60 min后，采用EthoVision大小鼠行為學(xué)系統(tǒng)記錄大鼠自主活動(dòng)情況，自主活動(dòng)測試箱為1.0 m×1.0 m正方形不銹鋼箱，箱內(nèi)中央0.5 m×0.5 m正方形區(qū)域劃分中央?yún)^(qū)，其余為周邊區(qū)，記錄10 min內(nèi)大鼠移動(dòng)距離、速度、出現(xiàn)在中央?yún)^(qū)的頻率及在中央?yún)^(qū)累計(jì)停留時(shí)間。取各組大鼠血清，測五羥色胺（5-HT），γ-氨基丁酸（GABA）含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 安神臍貼對(duì)大鼠自主活動(dòng)的影響

正常SD大鼠連續(xù)2天以350 mg·kg-1的PCPA腹腔注射后，晝夜睡眠-覺醒平衡規(guī)律被破壞，提示造模成功。行為學(xué)表現(xiàn)為不分晝夜的自主活動(dòng)度增高，并出現(xiàn)焦躁，食欲減退，精神萎靡等現(xiàn)象。給予安神臍貼、同仁安神丸治療5天后，大鼠的睡眠-覺醒規(guī)律慢慢恢復(fù)，表現(xiàn)為白天活動(dòng)度減少，安靜，倦怠，蜷臥，不易被外界打擾，精神好轉(zhuǎn)，食欲漸增。與模型組相比，安神臍貼低劑量組和同仁安神丸組大鼠自主活動(dòng)的速度、移動(dòng)距離差異顯著(P＜0.05），安神臍貼高劑量組大鼠自主活動(dòng)的速度、移動(dòng)距離差異非常顯著(P＜0.01）。提示安神臍貼和同仁安神丸對(duì)PCPA致失眠大鼠均有鎮(zhèn)靜作用，但安神臍貼組效果更明顯。詳見表1。

表1 安神臍貼對(duì)PCPA致失眠大鼠自主活動(dòng)的影響(±s,n=10)

表1 安神臍貼對(duì)PCPA致失眠大鼠自主活動(dòng)的影響(±s,n=10)

注：與空白對(duì)照組比較：＊P＜0.05；與模型對(duì)照組比較：▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

圖1為各組PCPA致失眠大鼠運(yùn)動(dòng)軌跡。由圖1可見，PCPA造模后，大鼠運(yùn)動(dòng)明顯增多，經(jīng)安神臍貼治療后，運(yùn)動(dòng)減少，高劑量組減少明顯，同仁安神丸也可減少大鼠的自主的活動(dòng)。但是安神臍貼高劑量組自主活動(dòng)減少最明顯。

2.2 安神臍貼對(duì)各組大鼠血清中GABA、5-HT含量的影響。

實(shí)驗(yàn)7天后，各組大鼠處死，取血清，采用ELISA法測5-HT，GABA含量。結(jié)果顯示，模型組血清中GA?BA含量低于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，安神臍貼低劑量組與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），安神臍貼高劑量組和同仁安神丸組與模型組比較，差異有非常顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。模型組血清中5-HT含量明顯低于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；安神臍貼低劑量組與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），安神臍貼高劑量組和同仁安神丸組與模型組比較，差異有非常顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），安神臍貼高劑量組療效好于同仁安神丸組。說明安神臍貼對(duì)PC?PA致失眠大鼠神經(jīng)因子GABA、5-HT有調(diào)節(jié)作用。提示安神臍貼調(diào)節(jié)睡眠的機(jī)制與調(diào)節(jié)具有促眠作用的因子GABA、5-HT有關(guān)。詳見表2。

圖1 各組PCPA致失眠大鼠運(yùn)動(dòng)軌跡圖

表2 各組大鼠血清中神經(jīng)遞質(zhì)含量變化(±s,n=10)

表2 各組大鼠血清中神經(jīng)遞質(zhì)含量變化(±s,n=10)

注：與空白對(duì)照組比較：*P＜0.05與模型對(duì)照組比較：#P＜0.05，##P＜0.01

5-HT（ng·L-1）122.57±4.37##102.14±7.21**120.35±4.94#128.85±6.10*##124.14±5.40##空白對(duì)照組模型對(duì)照組安神臍貼低劑量組安神臍貼高劑量組同仁安神組GABA（μmol·L-1）5.30±0.22##4.36±0.37**4.88±0.21*#5.36±0.60##5.42±0.38##

3 討論

睡眠是保證人體健康、使疲勞的身體快速復(fù)原、保持精力的有效途徑。正常人大概有三分之一的時(shí)間都處于睡眠狀態(tài)，只有保證充足的睡眠生命體才能正常有序的進(jìn)行各種生命活動(dòng)。然而，隨著社會(huì)的不斷發(fā)展，工作壓力的不斷增大，失眠所帶來的問題也越來越嚴(yán)重[2-4]。中醫(yī)認(rèn)為失眠的主要病位在心，然心為火臟，火靜則神安而寐，火盛，則魂不守舍而失眠。心火亢盛，心經(jīng)火勝是失眠在臨床中常見的分型，其治療多從清心火、安心神入手。安神臍貼由酸棗仁、黃連、五味子，琥珀粉按照16∶14∶14∶1的比例配伍而成，主要針對(duì)心火偏盛型失眠。酸棗仁味甘酸，性平，主歸心、肝、膽經(jīng)，為養(yǎng)心安神之要藥。黃連味苦性寒，主歸心經(jīng)，尤善清瀉心經(jīng)實(shí)火。五味子，味甘酸性溫，主歸心、腎經(jīng)，具有補(bǔ)益心腎，寧心安神之功效。琥珀味甘性平，主歸心，肝二經(jīng)，其質(zhì)重而鎮(zhèn)，具有鎮(zhèn)靜安神之功效。四味藥物相輔相成，共同發(fā)揮清心瀉火，寧心安神之功效。藥物貼臍療法至今已有2000多年的歷史，是以中醫(yī)經(jīng)絡(luò)學(xué)說為理論基礎(chǔ)，針對(duì)不同疾病的不同需要，選擇相應(yīng)藥物，貼敷于肚臍即神闕穴的部位，使藥物通過臍部皮膚滲透和經(jīng)絡(luò)傳導(dǎo)作用到達(dá)患病部位從而發(fā)揮藥效的一種傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)外治療法。在《五十二病方》現(xiàn)存283個(gè)配方中，有70多個(gè)配方涉及到臍療法，開創(chuàng)了臍療法的先河[5]。臍是神闕穴所在的位置，為生命的元神所居。神闕為任脈的重要穴位[6]，又是沖脈循行之處，任脈為陰脈之海，與陽脈之海督脈互為表里，沖脈為血海，督、任、沖三脈“一源三岐”，內(nèi)聯(lián)五臟六腑，外達(dá)四肢百骸，皮膚筋膜，無處不走。此為臍療法治療多種疾病提供了理論依據(jù)?，F(xiàn)代研究認(rèn)為[7-8]，臍在胚胎發(fā)育過程中為腹壁最后閉合處，其下分布著豐富的靜脈網(wǎng)和皮下動(dòng)脈分支，與人體其他部位皮膚結(jié)構(gòu)相比，其表皮角質(zhì)層最簿，屏障功能最弱，有利于藥物滲透吸收。由于藥物透皮吸收和皮膚厚度成反比，與皮膚的擴(kuò)散性成正比，所以臍部的特殊構(gòu)造具有透皮療法的得天獨(dú)厚的優(yōu)勢。除此以外，藥物分子可通過臍部進(jìn)入細(xì)胞間質(zhì)，直接進(jìn)入血液，避免口服經(jīng)過胃腸被消化液破壞而影響藥效發(fā)揮，同時(shí)又能減少藥物給肝腎帶來的不良反應(yīng)，以及對(duì)胃腸道的刺激和對(duì)消化功能的不良影響。

失眠與中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性氨基酸和抑制性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)的平衡失調(diào)密切相關(guān)[9]?，F(xiàn)有實(shí)驗(yàn)研究表明，睡眠障礙患者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量發(fā)生改變，致使興奮和抑制的平衡被破壞[10]。GABA是一種非蛋白質(zhì)性氨基酸，是一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，能夠?qū)Υ蟛糠稚窠?jīng)元發(fā)揮抑制作用，其表達(dá)量的多少在睡眠的調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著重要作用[11]。另有實(shí)驗(yàn)研究表明[12]，當(dāng)大腦處于睡眠狀態(tài)時(shí)大腦皮層所釋放的GABA含量是清醒狀態(tài)時(shí)的3倍。因此失眠與血清中GABA表達(dá)量的多少有密切關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，安神臍貼能夠升高抑制性氨基酸GABA的表達(dá)量，對(duì)失眠有良好的調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-HT參與調(diào)解多種生理功能，其主要集中在腦干中縫核(DRN)，在中樞系統(tǒng)內(nèi)數(shù)量較少，但其軸突分布廣泛，可支配腦的所有區(qū)域，調(diào)控腦的總體功能，下丘腦內(nèi)存在“睡眠中樞”和“覺醒中樞”，下丘腦與腦干處的相關(guān)區(qū)域相互作用，共同完成對(duì)睡眠-覺醒的調(diào)節(jié)[13，14]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用5-HT也能起到增加睡眠的作用，證實(shí)了5-HT是能夠促進(jìn)睡眠的神經(jīng)遞質(zhì)[15-17]，5-HT濃度升高時(shí)，肌體就會(huì)感到疲乏并產(chǎn)生睡意。PCPA是一種色氨酸類抑制劑，通過減少色氨酸攝入和增加轉(zhuǎn)運(yùn)載體數(shù)量來減少大腦內(nèi)5-HT合成和釋放[18]。PCPA致失眠大鼠模型是目前公認(rèn)的并廣泛應(yīng)用于各類神經(jīng)遞質(zhì)關(guān)系研究的經(jīng)典模型。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：安眠臍貼能減少大鼠的自主活動(dòng)次數(shù)，提示安眠臍貼有明顯的鎮(zhèn)靜作用。腹腔注射PCPA可導(dǎo)致大鼠血清神經(jīng)遞質(zhì)GABA、5-HT表達(dá)量發(fā)生顯著變化，采用安神臍貼低劑量、高劑量干預(yù)后，與模型組相比，GABA、5-HT的表達(dá)量升高?？梢?，安神臍貼有明顯的鎮(zhèn)靜作用，安眠臍貼調(diào)節(jié)睡眠的機(jī)制與調(diào)節(jié)具有促眠作用的因子GABA、5-HT有關(guān)，抑制興奮促進(jìn)睡眠，調(diào)節(jié)睡眠-覺醒周期平衡。

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