秦靈靈，穆曉紅，徐暾海，劉銅華

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)科技處 北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院 北京 100700；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 北京 100029；4.北京中醫(yī)藥大學(xué)研究生院 北京 100029）

肥胖已成為全球性問題，據(jù)統(tǒng)計(jì)86%的2型糖尿?。╰ype 2 diabetes，T2DM）是肥胖患者，近年來研究顯示肥胖患者脂肪組織中異常病理改變可導(dǎo)致脂肪組織發(fā)生IR，進(jìn)而引起T2DM發(fā)生發(fā)展[1]，脂肪組織中胰島素介導(dǎo)的PI3K-AKT信號(hào)通路是IR發(fā)生發(fā)展的主要分子作用機(jī)制[2]。本課題組前期實(shí)驗(yàn)表明，匙羹藤具有緩解IR的作用[3]，而GA同時(shí)又是其降糖的主要作用成分，因此本實(shí)驗(yàn)以GA為干預(yù)因素，觀察其對(duì)具有IR以及肥胖特征的KKay小鼠脂肪組織IR的作用，并以PI3K-AKT信號(hào)通路為切入點(diǎn)，觀察其分子調(diào)控機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

27只SPF級(jí)KKay小鼠（雄性，6-7周齡），9只同周齡雄性SPF級(jí)C57BL/6J小鼠，均購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所，許可證號(hào)SCXK京2009-0004，均采用單籠喂養(yǎng)。

1.2 藥物與試劑

GA提取流程：將匙羹藤生藥2 kg按照料水比1:10，1.5 h→1:10，1.5 h→1:8，1 h進(jìn)行煎煮，濾液濃縮至稠膏，干燥后制成粉末。稱取粉末50.7000 g，水溶后超聲15 min，過濾后分別用水、10%、50%、75%、95%的乙醇上大孔樹脂RS-3洗脫，隨后濃縮。采用香草醛-高氯酸比色紫外分光光度法測(cè)定各濃縮液中GA含量，選取皂苷含量最高的知50%乙醇洗脫物液用于實(shí)驗(yàn)。

鹽酸吡格列酮片（北京太洋藥業(yè)有限公司）；MMLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara公司）；100bp DNA Ladder（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；擴(kuò)增試劑盒（北京中原領(lǐng)先科技有限公司）；Trizol試劑盒（Invitrogen公司）；Agarose（Promega公司）；DEPC（Sigma公司）；蛋白質(zhì)Marker（MBI公司）；AKT抗體（CST公司，#4685）；PAKT（ser473）（CST 公 司 ，#4060）；P-AKT（Thr 308）（CST公司，#4056）；PDK1抗體（CST公司，#3062）。

1.3 主要儀器

低溫高速離心機(jī)（3κ30，Sigma）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI 7500）、高速4℃低溫離心機(jī)（Thermo）、核酸紫外分光光度計(jì)（Biophotometer）、半干轉(zhuǎn)電轉(zhuǎn)印儀（Bio-Rad）、轉(zhuǎn)膜儀（J-MAX，#ST-2）、穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（Bio-Rad）、垂直電泳槽（Bio-Rad）、計(jì)算機(jī)圖像分析儀（Image-Pro Plus Analysis Soft ware）。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及飼養(yǎng)方法

動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后測(cè)隨機(jī)血糖，選取非同日兩次隨機(jī)血糖13.9 mmol·L-1的27只KKay小鼠，按體重隨機(jī)分為DM組、BG組、GA組。選取9只C57BL/6J小鼠作為NC組。KKay小鼠喂以KK高脂鼠料，C57BL/6J小鼠喂以普通飼料。

2.2 給藥方法

采用灌胃方式，按1 mL·100 g-1/天（但不超過0.5 mL）的體積給藥。按照體表面積法換算小鼠給藥劑量：BG組4.05 mg·kg-1/天；GA組按照中藥生藥量15 g·kg-1/天給藥；NC組和DM組給予相同劑量的無菌水。

2.3 檢測(cè)方法

2.3.1 空腹血糖

空腹血糖取血方法：剪尾取血，用血糖儀及試紙測(cè)定；

表1 擴(kuò)增基因的引物序列

2.3.2 Fins

Fins值測(cè)定方法為：放射性免疫法檢測(cè)血清中Fins值；

2.3.3 ISI

ISI計(jì)算方法為：ISI=1/FPG×Fins，取其自然對(duì)數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)目標(biāo)mRNA含量

檢測(cè)附睪脂肪組織中APN、PTEN、PI3K-p85mRNA表達(dá)量。① Trizol一步法提取總RNA：將脂肪組織放入研缽中加入液氮進(jìn)行快速研磨，用核酸紫外分光光度計(jì)法檢測(cè)RNA的濃度與純度；②引物序列：見下表1；③RNA的體外反轉(zhuǎn)與實(shí)時(shí)熒光PCR：采用25 μL反轉(zhuǎn)錄體系，42℃孵育60 min→70℃ 10 min，將cDNA加入20 μL反應(yīng)體系，94℃預(yù)變性1 min，94℃ 15 s 、60℃ 34 s、72℃ 15 s 40個(gè)循環(huán)，72℃ 10min，用相對(duì)定量2-△△CT法分析結(jié)果。

2.4.5 western blot法檢測(cè) AKT、P-AKT（Ser473）、PAKT（Thr 308）、PDK-1蛋白表達(dá)量

提取細(xì)胞內(nèi)蛋白→測(cè)定總蛋白含量→蛋白變性→SDS-PAGE電泳（10%SDS-PAGE分離膠，5%濃縮膠分離蛋白）→轉(zhuǎn)印→封閉→一抗（1∶1 000比例稀釋）孵育→二抗（1∶10 000稀釋）孵育，室溫放置1 h→清洗→ECL發(fā)光→用IPP軟件對(duì)掃描圖象的目的條帶進(jìn)行灰度分析。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析方法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 一般情況

表2 各組小鼠攝食量的變化(±s)

表2 各組小鼠攝食量的變化(±s)

注：與NC組相比，*P＜0.05。

圖1 各組小鼠體重的變化(±s)

表3 各組小鼠FPG、Fins、ISI水平(±s)

表3 各組小鼠FPG、Fins、ISI水平(±s)

注：與NC組相比，*P＜0.05；與DM組相比，&P＜0.05。

在給藥期內(nèi)由于灌胃操作失敗，DM組小鼠死亡1只。NC組小鼠精神狀態(tài)良好，皮毛有光澤，活動(dòng)自如，反應(yīng)機(jī)敏；DM組小鼠精神萎靡，皮毛干枯無光澤，動(dòng)作遲緩，行為倦怠，反應(yīng)遲鈍，且在實(shí)驗(yàn)過程中逐漸加重；BG、GA組與DM組小鼠狀態(tài)相似，在給藥過程中，皮毛顏色有相黑色轉(zhuǎn)變的情況，與DM組小鼠相比較，精神狀態(tài)較好，活動(dòng)時(shí)間較多且較靈活，反應(yīng)較靈敏些。

3.2 GA對(duì)攝食量、體重的影響

從表2可以看出：與NC組攝食量相比較，DM組小鼠顯著增加（P＜0.05）；在給藥過程中，與DM組攝食量相比較，BG，GA組雖有減少但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

從圖1可以看出：與NC組體重相比較，DM組升高（P＜0.05），與DM組體重相比較，BG組小鼠從第7周開始降低（P＜0.05），GA組小鼠從第3周開始降低（P＜0.05）。

3.3 GA對(duì)FPG、Fins、ISI的影響

由表3可以看出，經(jīng)GA干預(yù)后，與NC組相比，DM組FPG、Fins水平升高，ISI降低（P＜0.05）；與DM組相比，BG組FPG、Fins水平降低，ISI升高（P＜0.05），GA組FPG、Fins水平降低，ISI升高（P＜0.05）。

3.4 GA對(duì)脂聯(lián)素基因表達(dá)的影響

從圖2-（1-3）可以看出：與NC組APNmRNA表達(dá)量相比較，DM組降低（P＜0.05）；與DM組APNmRNA表達(dá)量相比較，BG組、GA組均增加（P＜0.01）。

3.5 GA對(duì)脂肪組織PI3K-p85mRNA表達(dá)量的影響

從圖3-（1-3）可以看出：與NC組PI3K-p85mRNA表達(dá)量相比較，DM組降低（P＜0.05）；與DM組PI3K-p85mRNA表達(dá)量相比較，GA組增加（P＜0.05）。

3.6 GA對(duì)AKT、P-AKT（ser473），P-AKT（Thr 308）蛋白表達(dá)量的影響

從圖4-(1-6)可以看出：P-AKT（Thr 308）：與NC組P-AKT（Thr 308）蛋白表達(dá)量相比較，DM組顯著降低（P＜0.01）；與DM組P-AKT（Thr 308）蛋白表達(dá)量相比較，BG組升高（P＜0.05），GA組顯著升高（P＜0.01）。P-AKT（Ser473）：與NC組P-AKT（Ser 473）蛋白表達(dá)量相比較，DM組降低（P＜0.05）；與DM組PAKT（Ser 473）蛋白表達(dá)量相比較，GA組升高（P＜0.05）。P-AKT（Thr 308）/AKT比值（磷酸化程度）：與NC組AKT第308位Thr磷酸化程度相比較，DM組顯著降低（P＜0.01）；與DM組AKT第308位Thr磷酸化程度相比較，BG組、GA組均顯著升高（P＜0.01）。PAKT（Ser473）/AKT比值（磷酸化程度）：與NC組AKT第473位Ser磷酸化程度相比較，DM組降低（P＜0.01）；與DM組AKT第473位Ser磷酸化程度相比較，GA組顯著升高（P＜0.01），BG組此位點(diǎn)磷酸化程度有上升趨勢(shì)，但是沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3.7 GA對(duì)PDK-1蛋白表達(dá)量的影響

從圖5-(1-2)可以看出：與NC組PDK-1蛋白表達(dá)量相比較，DM組增加（P＜0.01）；與DM組PDK-1蛋白表達(dá)量相比較，BG組降低（P＜0.05），GA組降低（P＜0.01）。

3.8 GA對(duì)PTEN基因表達(dá)量的影響

從圖6-（1-3）可以看出：與NC組PTENmRNA表達(dá)量相比較，DM組沒有顯著變化，但是與DM組PTE-NmRNA表達(dá)量相比較，BG組、GA組降低（P＜0.05）。

圖2-1 各組小鼠APNmRNA表達(dá)量(±s)

圖2-2 APN擴(kuò)增曲線

圖2-3 APN溶解曲線

4 討論

圖3-1 各組小鼠PI3K-p85mRNA表達(dá)量(±s)

圖3-2 PI3K-p85擴(kuò)增曲線

圖3-3 PI3K-p85溶解曲線

目前，以IR為主要特征的相關(guān)代謝性疾病，包括2型糖尿病、高脂血癥、高尿酸血癥、心血管疾病及代謝綜合征在全球呈迅速上升趨勢(shì)，而肥胖成為了這類人群的潛在發(fā)病因素，越來越多的研究認(rèn)為異常增多的脂肪組織引起的IR，是IR疾病群的觸發(fā)因素[4]。胰島素在其外周靶組織中借助于不同的信號(hào)通路發(fā)揮其對(duì)葡萄糖代謝及利用的生物學(xué)效應(yīng)，其中PI3K/AKT占主要地位，該通路主要至通過與目標(biāo)細(xì)胞表面胰島素受體結(jié)合后，通過一系列反應(yīng)使胰島素受體底物被磷酸化，進(jìn)而與PI3K的p85調(diào)節(jié)亞單位相結(jié)合，從而催化p110，最終激活PI3K，經(jīng)過一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)最終通過磷酸化AKT第308位的蘇氨酸以及473位的絲氨酸激活A(yù)KT，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[5]。近年來發(fā)現(xiàn)PTEN具有削弱PI3K/AKT的作用，主要是通過特異地使磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸3′位脫磷酸實(shí)現(xiàn)的[6,7]。PDK-1在PI3K/AKT信號(hào)通路中主要是在三磷酸肌醇的作用下與AKT相結(jié)合，參與了其第308位蘇氨酸的磷酸化過程[8]。本實(shí)驗(yàn)在進(jìn)行中，發(fā)現(xiàn)GA在不影響攝食量的前提下對(duì)于小鼠的體重具有明顯的減輕作用，且可改善IR狀態(tài)，因此本實(shí)驗(yàn)選擇脂肪組織為目標(biāo)組織，以PI3K/AKT信號(hào)通路為切入點(diǎn)觀察GA干預(yù)IR的作用機(jī)制。

圖4-1 各組小鼠目標(biāo)蛋白表達(dá)量（自左到右為：NC，DM，BG，GA）

圖4-2 各組小鼠AKT蛋白表達(dá)量(±s)

圖4-3 各組小鼠P-AKT（Thr 308）蛋白表達(dá)量(±s)

圖4-6 各組小鼠P-AKT（Ser473）/AKT比值(±s)

KKay小鼠是一種自發(fā)2型糖尿病小鼠，表現(xiàn)為嚴(yán)重肥胖、高胰島素血癥、胰島素抵抗等代謝異常綜合征，研究發(fā)現(xiàn)KKay脂肪組織存在IR，且可能與PI3K信號(hào)通路傳導(dǎo)障礙有關(guān)[9]，適用于本實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)思路，故選取了KKay小鼠作為研究對(duì)象。

圖5-1 各組小鼠目標(biāo)蛋白表達(dá)量(自左到右為：NC，DM，BG，GA)

圖5-2 各組小鼠PDK-1蛋白表達(dá)量(±s)

APN是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種白色脂肪組織來源的具有多種生物活性的物質(zhì)，研究顯示其含量與脂肪組織IR呈負(fù)相關(guān)[10]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)GA干預(yù)后，ISI指數(shù)升高，脂肪組織APN基因表達(dá)量降低，此兩指標(biāo)可從整體以及組織水平反映出GA改善脂肪組織IR的作用。對(duì)于PI3K-AKT信號(hào)通路，經(jīng)GA干預(yù)后表現(xiàn)為被激活狀態(tài)：①增加PI3K-p85mRNA的表達(dá)；②增強(qiáng)AKT第308位蘇氨酸、第473位絲氨酸的磷酸化：雖然對(duì)AKT的表達(dá)量沒有影響，但是增加了兩個(gè)磷酸化位點(diǎn)蛋白的表達(dá)量，從而增強(qiáng)了其磷酸化程度，進(jìn)而增強(qiáng)了AKT的激活程度；③調(diào)節(jié)因子PDK-1蛋白表達(dá)量降低：雖然對(duì)于PI3K-AKT信號(hào)通路PDK-1起到正調(diào)節(jié)作用，但是PDK-1在模型小鼠脂肪組織中表現(xiàn)出表達(dá)量增加的現(xiàn)象，初步分析可能在IR狀態(tài)下，PI3K被抑制，三磷酸肌醇含量隨之降低，抑制了PDK-1的激活，而PDK-1的激活主要是通過PH域與細(xì)胞膜三磷酸肌醇相結(jié)合而被固定在細(xì)胞膜而實(shí)現(xiàn)的，因此存在于細(xì)胞漿中的未被激活的PDK-1含量增加，實(shí)驗(yàn)中提取的是細(xì)胞內(nèi)的蛋白（未被激活的PDK-1），因此表現(xiàn)出來的是含量增加的現(xiàn)象，在經(jīng)GA干預(yù)后PI3K被激活，三磷酸肌醇含量增加，促進(jìn)了PDK-1的激活，因此存在于細(xì)胞內(nèi)的未被激活的PDK-1降低，間接提示了IR得以緩解，其并非是GA對(duì)該信號(hào)通路的作用點(diǎn)，而是一系列調(diào)節(jié)作用所表現(xiàn)出來的現(xiàn)象；④減少PTEN基因表達(dá)量：與C57小鼠相比較，PTEN在模型小鼠脂肪組織中的基因表達(dá)量沒有變化，但是在經(jīng)過GA干預(yù)8周后，與模型組相比，給藥組小鼠體內(nèi)的基因表達(dá)量降低，由此推測(cè)其對(duì)PIK/AKT信號(hào)通路的抑制作用減弱，間接起到了增強(qiáng)該通路作用的效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)以具有緩解IR作用的BG為對(duì)照藥物，結(jié)果顯示其具有改善IR的作用，但是其降低體重的作用較GA出現(xiàn)晚，GA表現(xiàn)出了其減肥的優(yōu)勢(shì)所在。在對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路作用方面，BG表現(xiàn)出的激活作用與GA也不盡相同，BG主要通過作用在AKT的第473位絲氨酸的磷酸化上，而GA在對(duì)PI3K的P85亞基、AKT第308位Thr、第473位Ser的磷酸化上均表現(xiàn)出其激活作用，提示GA對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路調(diào)控具有多靶點(diǎn)、多樣化的特征。

圖6-1 各組小鼠PTENmRNA表達(dá)量(±s)

圖6-2 PTEN擴(kuò)增曲線

圖6-3 PTEN溶解曲線

綜上所述，GA可通過多環(huán)節(jié)激活脂肪組織PI3K/AKT信號(hào)通路，進(jìn)而改善KKay小鼠IR，但其具體分子調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

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