李 萌，張軍平＊＊，朱 科，漆仲文，鄒 升

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)研究生院 天津300193）

近年來對于動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）的研究已由聚焦于血管內(nèi)膜的“由內(nèi)向外”炎癥反應(yīng)機制逐步轉(zhuǎn)變?yōu)椤坝赏庀騼?nèi)”，血管外膜在AS發(fā)病過程中的作用越來越受到重視。血管外膜是集成血管壁功能的主要監(jiān)管機構(gòu)，可視為“中央處理器”，大中動脈管壁外膜及中膜外1/3存在豐富的VV網(wǎng)，為宿主血管壁輸送氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)并排出代謝廢物，維持宿主血管的物質(zhì)代謝及能量平衡，保持宿主血管結(jié)構(gòu)與功能的完整性[1]。有研究對高脂血癥豬模型的冠狀動脈進行觀察，發(fā)現(xiàn)在AS早期血管外膜VV出現(xiàn)異常增生，VV密度增加，且VV密度與AS病變程度呈正相關(guān)[2,3]。AS斑塊內(nèi)的新生VV 96.5%起源于血管外膜，病理性新生VV具有結(jié)構(gòu)缺陷，其脆性大、滲漏性高，容易破裂出血，造成巨噬細胞浸潤、脂質(zhì)/壞死核心擴大，導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定，同時也為血細胞及血液可溶性成分（如脂質(zhì)、細胞因子、生長因子等）進入斑塊提供通道[4]。AS病變的主要臨床危險性在于斑塊的不穩(wěn)定性、易損性，斑塊內(nèi)VV新生是促進穩(wěn)定斑塊發(fā)展為易損斑塊的重要病理機制，其與斑塊內(nèi)出血、斑塊破裂及臨床心腦血管事件的發(fā)生密切相關(guān)[5]。四妙勇安湯載于清·鮑相敖《驗方新編》中，由金銀花、玄參、當(dāng)歸和甘草組成，具有清熱解毒活血之功效，為治療熱毒型脫疽的經(jīng)典良方。近年來該方廣泛應(yīng)用于AS性疾病的治療，例如冠心病、下肢動脈硬化閉塞癥、腦梗死等。本研究以VV新生為切入點，探討四妙勇安湯干預(yù)AS易損斑塊的效應(yīng)機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

8周齡雄性ApoE-/-小鼠，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK（京）2014-0004，SPF級，體重20-25 g。8周齡雄性C57BL/6小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2012-0001，SPF 級，體重20-25 g。室溫保持22-24℃，相對濕度50%，12 h交替照明，飲水不限，自由攝食。

1.2 實驗藥品、試劑及儀器

四妙勇安湯飲片（金銀花90 g，玄參90 g，當(dāng)歸60 g和甘草30 g）購自天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院；辛伐他?。ㄊ娼抵?，杭州默沙東制藥有限公司，規(guī)格20 mg/片）；L-蛋氨酸（M5308，美國sigma公司）；LDLC、HDL-C、TG、TC 測定試劑盒（A113-2、A112-2、A110-2、A111-2，南京建成生物工程研究所有限公司）；飽和油紅O染色劑（G1260，北京索萊寶科技有限公司）；蘇木素-伊紅染色試劑盒（C0490，天津百浩生物科技有限公司）；CD34兔單克隆抗體（ab81289，英國Abcam公司）；MOMA-2大鼠單克隆抗體（ab33451，英國Abcam公司）；HIF-1 Alpha兔多克隆抗體（bs-0737R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；Apelin-13兔多克隆抗體（bs-2425R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；Apelin Receptor兔多克隆抗體（bs-2430R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；Phospho-p44/42 MAPK（Erk1/2）（Thr202/Tyr204）兔單克隆抗體（4370，Cell Signaling Technology公司）；GAPDH小鼠單克隆抗體（ab9484，英國Abcam公司）；CM1900石蠟切片機（Leica）;光學(xué)顯微鏡（DM3000，Leica）；JA1003型電子分析天平（上海精科公司）；ELX800型光吸收酶標(biāo)儀（美國BIO-TEK公司）；Roche Modular P800型全自動生化測定儀（瑞士羅氏公司）；電泳儀（北京六一儀器廠）。

1.3 四妙勇安湯凍干粉的制備與質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

按照四妙勇安湯原方配比稱取金銀花90 g、玄參90 g、當(dāng)歸60 g、甘草30 g，混合均勻，加入8倍量（2 160 ml）55%的乙醇，浸泡20 min，回流提取2 h，過濾，收集濾液。再重復(fù)提取1次，合并濾液，得到55%乙醇提取液和藥渣。將藥渣再用純水回流提取2 h，過濾，得到的濾液與前次濾液合并。將所得提取液濃縮后置于冷凍干燥機內(nèi)，制備四妙勇安湯凍干粉。質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)：金銀花中綠原酸含量不得少于1.5%；玄參中哈巴苷和哈巴俄苷的總量不得少于0.45%；當(dāng)歸中阿魏酸含量不得少于0.05%；甘草中甘草苷含量不得少于0.50%，甘草酸不得少于2.0%[6]。

1.4 方法

1.4.1 動物分組及模型建立

將雄性8周齡ApoE-/-小鼠隨機分為3組，模型組、辛伐他汀組、四妙勇安湯組，每組15只，共45只，并以C57BL/6小鼠作為正常對照組。采用添加1.1%L-蛋氨酸的高脂飼料（維持飼料基礎(chǔ)上添加1.1%L-蛋氨酸、21%脂肪、0.15%膽固醇）喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠8周，自由攝食和飲水。8周后，辛伐他汀以2.6 mg·kg-1劑量灌胃給藥，四妙勇安湯以11.7 mg·kg-1劑量灌胃給藥，給藥劑量參考《藥理實驗方法學(xué)》[7]，正常對照組與模型組給予相同體積的蒸餾水灌胃，連續(xù)給藥8周。

1.4.2 標(biāo)本采集

于16周后取材，取材前禁食水12 h，采用乙醚吸入麻醉，摘眼球取血。迅速打開胸腹腔，暴露心臟，由心尖部灌注PBS緩沖液，取主動脈根部連帶部分心肌組織置于4%中性甲醛固定液中固定，用于蘇木素-伊紅染色（HE染色）、免疫組化染色，剩余部分于－80℃冰箱凍存以備Western blot檢測。

1.4.3 血脂檢測

采用全自動生化分析儀檢測血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL-C）、高密度脂蛋白（HDL-C）水平，嚴(yán)格按照試劑盒操作方法進行檢測。

1.4.4 病理形態(tài)學(xué)觀察

HE染色觀察主動脈根部斑塊的病理形態(tài)變化，將已固定標(biāo)本脫水、石蠟包埋切片（厚度約5 μm），HE染色，在100倍光鏡下觀察并采集圖像，應(yīng)用Image-Pro plus Version 6.0專業(yè)圖像分析軟件進行分析，測量斑塊面積（PA）、血管管腔面積（LA）、最小纖維帽厚度及中膜面積，并計算PA/LA之比。

表1 各組小鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C含量的變化(mmol/L)

表1 各組小鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C含量的變化(mmol/L)

注：與正常對照組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01，cP＜0.05；與辛伐他汀組比較，dP＜0.01，eP＜0.05。

1.4.5 免疫組化染色

檢測小鼠主動脈根部斑塊內(nèi)與主動脈外膜CD34標(biāo)記的VV密度以及主動脈根部斑塊內(nèi)MOMA-2陽性表達。石蠟切片脫蠟至水，PBS清洗10 min×3次，3%過氧化氫孵育10 min，PBS清洗5 min×3次，EDTA抗原修復(fù)液，高壓熱修復(fù)10min，PBS清洗5 min×3次，滴加5%BSA封閉20 min，滴加一抗工作液，4℃孵育過夜（濕盒保濕），PBS清洗10 min×3次，滴加二抗工作液，37℃孵育30 min，PBS清洗10 min×3次，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。采用微血管密度計數(shù)方法（MVD）[8]，在400倍光鏡下觀察，隨機計數(shù)5個高倍視野斑塊區(qū)或血管外膜區(qū)域的微血管數(shù)量，計算微血管密度值（n·mm-2），取其平均值。在400倍光鏡下觀察，隨機選取5個高倍視野斑塊區(qū)，采用Image-Pro plus Version 6.0專業(yè)圖像分析軟件進行分析，計算MOMA-2陽性表達面積與斑塊面積的百分比，取其平均值。

1.4.6 Western blot檢測

檢測HIF-1α-Apelin/APJ信號通路的關(guān)鍵節(jié)點蛋白。提取組織的總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。進行SDS-PAGE電泳，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，置于封閉液中室溫封閉1 h，將封閉后的PVDF膜置入一抗工作液中，4℃孵育過夜，室溫洗膜后，置于二抗工作液中室溫孵育1 h，抗體結(jié)合區(qū)帶用化學(xué)發(fā)光法檢測。以GAPDH作為內(nèi)參，以目的蛋白吸光度值/GAPDH吸光度值的比值表示所檢測標(biāo)本目的蛋白的相對含量，進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

1.4.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 四妙勇安湯對小鼠血脂水平的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠血清TC水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，辛伐他汀組血清TC水平顯著降低（P＜0.01）；四妙勇安湯組血清TC水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與正常對照組比較，模型組小鼠血清TG水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，辛伐他汀組血清TG水平顯著降低（P＜0.01）；四妙勇安湯組血清TG水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與正常對照組比較，模型組小鼠血清LDL-C水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，兩給藥組血清LDL-C水平均顯著降低（P＜0.01）。與正常對照組比較，模型組小鼠血清HDL-C水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，辛伐他汀組血清HDL-C水平顯著升高（P＜0.01），但四妙勇安湯組血清HDL-C水平無明顯的變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

2.2 四妙勇安湯對小鼠AS斑塊病理形態(tài)的影響

HE染色顯示：與正常對照組比較，模型組小鼠主動脈根部斑塊面積顯著增大（P＜0.01）；主動脈管腔面積無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；斑塊與管腔面積比顯著升高（P＜0.01）；斑塊具有薄纖維帽、大脂質(zhì)核心的特點，斑塊內(nèi)可見大量泡沫細胞和膽固醇結(jié)晶沉積，甚至出現(xiàn)斑塊破裂出血，斑塊處于不穩(wěn)定狀態(tài)；主動脈內(nèi)膜明顯增厚，中膜平滑肌排列紊亂且萎縮變薄，中膜面積顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，兩給藥組小鼠主動脈根部斑塊面積均顯著減?。≒＜0.01），主動脈管腔面積無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），斑塊與管腔面積比顯著降低（P＜0.01），最小纖維帽厚度顯著增加（P＜0.01），且未出現(xiàn)斷裂，斑塊未見明顯破裂與出血，但中膜面積無明顯改善，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與辛伐他汀組比較，四妙勇安湯組最小纖維帽厚度增加更為顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖1，表2。

2.3 四妙勇安湯對小鼠主動脈斑塊內(nèi)及主動脈外膜滋養(yǎng)血管的影響

免疫組化半定量分析顯示：與正常對照組比較，模型組小鼠主動脈根部斑塊內(nèi)CD34陽性染色的新生滋養(yǎng)血管密度顯著增高（P＜0.01）。與模型組比較，辛伐他汀組與四妙勇安湯組斑塊內(nèi)新生滋養(yǎng)血管密度顯著降低（P＜0.01），見圖2，表3。

圖1 四妙勇安湯對小鼠主動脈根部斑塊HE染色的影響（×100）

表2 各組小鼠主動脈根部斑塊形態(tài)比較(±s)

表2 各組小鼠主動脈根部斑塊形態(tài)比較(±s)

注：與正常對照組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01，cP＜0.05；與辛伐他汀組比較，dP＜0.05。

圖2 四妙勇安湯對小鼠主動脈根部斑塊內(nèi)新生滋養(yǎng)血管的影響（×400）

表3 各組小鼠主動脈根部斑塊內(nèi)新生滋養(yǎng)血管密度(n/mm2,±s)

表3 各組小鼠主動脈根部斑塊內(nèi)新生滋養(yǎng)血管密度(n/mm2,±s)

注：與正常對照組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01。

免疫組化半定量分析顯示：與正常對照組比較，模型組小鼠主動脈外膜CD34陽性染色的滋養(yǎng)血管密度顯著增高（P＜0.01）。與模型組比較，辛伐他汀組與四妙勇安湯組主動脈外膜滋養(yǎng)血管密度顯著降低（P＜0.01），見圖3，表4。

2.4 四妙勇安湯對小鼠主動脈斑塊內(nèi)巨噬細胞含量的影響

免疫組化半定量分析顯示：與正常對照組比較，模型組小鼠主動脈根部斑塊內(nèi)巨噬細胞MOMA-2陽性面積百分比顯著增高（P＜0.01）。與模型組比較，辛伐他汀組斑塊內(nèi)巨噬細胞MOMA-2陽性面積百分比顯著降低（P＜0.01）；四妙勇安湯組斑塊內(nèi)巨噬細胞MOMA-2陽性面積百分比降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）

圖3 四妙勇安湯對小鼠主動脈外膜滋養(yǎng)血管的影響（×400）

表4 各組小鼠主動脈外膜滋養(yǎng)血管密度(n/mm2,±s)

表4 各組小鼠主動脈外膜滋養(yǎng)血管密度(n/mm2,±s)

注：與正常對照組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01。

表5 各組小鼠主動脈根部斑塊內(nèi)巨噬細胞含量（%，±s）

表5 各組小鼠主動脈根部斑塊內(nèi)巨噬細胞含量（%，±s）

注：與正常對照組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01，cP＜0.05。

圖4 四妙勇安湯對小鼠主動脈根部斑塊內(nèi)巨噬細胞含量的影響（×400）

2.4 四妙勇安湯對小鼠主動脈HIF-1α-Apelin/APJ信號通路的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠主動脈HIF-1α蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，兩給藥組HIF-1α蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.01）。與辛伐他汀組比較，四妙勇安湯組降低HIF-1α蛋白表達水平的作用更加顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

與正常對照組比較，模型組小鼠主動脈Apelin蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，兩給藥組Apelin蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05）。

與正常對照組比較，模型組小鼠主動脈APJ蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，兩給藥組APJ蛋白表達水平均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖5 各組小鼠主動脈根部斑塊內(nèi)巨噬細胞MOMA-2蛋白的表達

與正常對照組比較，模型組小鼠主動脈Phospho-MEK1/2（Ser217/221）蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，兩給藥組Phospho-MEK1/2(Ser217/221)蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.01）。

圖6 四妙勇安湯對ApoE-/-小鼠主動脈HIF-1α-Apelin/APJ信號通路的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠主動脈Phosphop44/42 MAPK（Erk1/2）（Thr202/Tyr204）蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，兩給藥組Phosphop44/42 MAPK（Erk1/2）（Thr202/Tyr204）蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.01）。

與正常對照組比較，模型組小鼠主動脈Phosphop70 S6 Kinase（Thr421/Ser424）蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，辛伐他汀組Phosphop70 S6 Kinase（Thr421/Ser424）蛋白表達水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；四妙勇安湯組Phosphop70 S6 Kinase（Thr421/Ser424）蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01），見圖6。

3 討論

AS病變的主要臨床危險性在于斑塊的易損性，斑塊內(nèi)VV新生是促進穩(wěn)定斑塊發(fā)展為易損斑塊的重要病理機制，其與斑塊破裂、出血以及臨床心腦血管事件的發(fā)生密切相關(guān)。因此，深入研究VV的結(jié)構(gòu)與功能及關(guān)鍵信號途徑在AS中的作用，有望從根本上阻止穩(wěn)定斑塊發(fā)展為易損斑塊，延緩AS進展，對于AS性疾病的治療具有重要意義。

VV為宿主血管壁輸送氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)并排出代謝廢物，維持宿主血管的物質(zhì)代謝及能量平衡，保持宿主血管結(jié)構(gòu)與功能的完整性。AS發(fā)生早期，活性氧、趨化因子、炎癥介質(zhì)等多種活性因子在血管外膜聚集，并隨微循環(huán)進入VV，黏附于滋養(yǎng)血管網(wǎng)，破壞滋養(yǎng)血管運輸功能；血管腔內(nèi)彌散的氧和營養(yǎng)物質(zhì)對管壁的供應(yīng)不足，內(nèi)膜代償性增厚導(dǎo)致的動脈氧供不足會縮短氧與營養(yǎng)物質(zhì)在內(nèi)膜深層與管腔表面的擴散距離，造成局部缺氧、動脈內(nèi)壁缺血損傷，從而誘導(dǎo)HIF-1α表達[9,10]。HIF-1α被稱為“缺氧基因表達的總開關(guān)”，是一種與特定核輔因子聯(lián)系緊密的DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子[11]。缺氧條件下，HIF-1α通過激活一系列轉(zhuǎn)錄基因從而啟動各種適應(yīng)性反應(yīng)來應(yīng)對氧分壓降低[12-14]。

Apelin是HIF-1α的靶基因，HIF-1α與Apelin的第一內(nèi)含子結(jié)合，觸發(fā)Apelin4持續(xù)釋放，其與內(nèi)源性受體APJ結(jié)合，促進ECs活化與增殖，并且Apelin和一些傳統(tǒng)的血管源性分子存在交互作用，如VEGF、成纖維細胞生長因子等，共同調(diào)節(jié)血管新生[15]。APJ是1993年發(fā)現(xiàn)的新型G蛋白偶聯(lián)受體，其內(nèi)源性配體Apelin于1998年由Tatemoto等利用反向藥理學(xué)方法在牛胃分泌物中分離純化而成。Apelin是一種強效的血管生成因子和細胞分裂素，包括Apelin-12、Apelin-13、Apelin-17和Apelin-36，其中Apelin-13活性最高，其通過激活A(yù)PJ受體促進血管新生與重構(gòu)。Apelin-APJ系統(tǒng)在胚胎血管發(fā)育及成年后的血管新生中起重要作用[16,17]。Apelin-APJ結(jié)合后，通過作用于MEK/ERK信號通路，激活p70 S6 kinase，從而促進ECs活化與增殖，促進VV新生[18]。由此可見，HIF-1α-Apelin/APJ信號通路在VV新生中起著關(guān)鍵作用，研究通路中關(guān)鍵節(jié)點蛋白的表達，對探索VV新生的發(fā)生機制及AS易損斑塊的有效治療均有重要意義。

四妙勇安湯最早見于華佗《神醫(yī)秘傳》，清末鮑相敖將其收載于《驗方新編·卷二》中，本方重用金銀花、玄參為君藥，金銀花清熱解毒，玄參清熱涼血，瀉火解毒，且有養(yǎng)陰散結(jié)之功效，兩藥合用，既清氣分邪熱，又解血分熱毒，臣以當(dāng)歸之溫潤，養(yǎng)血活血、化瘀散結(jié)，甘草為使調(diào)和諸藥，全方僅四味藥，量大力專，用之巧妙，具有清養(yǎng)結(jié)合，毒瘀并祛之功效，為治療熱毒型脫疽的經(jīng)典良方。

本研究對四妙勇安湯穩(wěn)定AS斑塊的效應(yīng)進行觀察，結(jié)果顯示四妙勇安湯能夠顯著改善小鼠主動脈斑塊病理形態(tài)，減小斑塊面積及斑塊與管腔面積比，增加最小纖維帽厚度以穩(wěn)定斑塊，且四妙勇安湯對纖維帽厚度的改善明顯優(yōu)于辛伐他?。豢捎行б种瓢邏K內(nèi)及血管外膜VV新生，降低斑塊內(nèi)巨噬細胞含量，從而發(fā)揮穩(wěn)定斑塊的作用。四妙勇安湯可有效降低小鼠血清TC、TG、LDL-C水平，從而調(diào)節(jié)血脂水平，但對血清HDL-C水平無明顯的改善作用。

以VV新生為切入點，探討四妙勇安湯穩(wěn)定易損斑塊的機制，結(jié)果顯示四妙勇安湯能夠有效改善主動脈血管壁缺血缺氧的狀態(tài)，從而降低HIF-1α蛋白表達水平，且其作用優(yōu)于辛伐他??；下調(diào)主動脈Apelin蛋白、APJ蛋白表達水平，抑制Apelin蛋白的持續(xù)釋放，減少Apelin蛋白與其受體APJ結(jié)合；顯著降低Phospho-MEK1/2（Ser217/221）蛋白表達，抑制MEK1/2蛋白的激活；顯著降低Phospho-p44/42 MAPK（Erk1/2）（Thr202/Tyr204）蛋白表達，抑制p44/42 MAPK（Erk1/2）蛋白的激活；顯著降低Phospho-p70 S6 Kinase（Thr421/Ser424）蛋白表達，抑制p70 S6 Kinase蛋白的激活，從而抑制ECs活化、增殖，抑制VV新生。綜上，四妙勇安湯穩(wěn)定ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化易損斑塊的機制可能與抑制小鼠主動脈HIF-1α-Apelin/APJ信號通路，從而抑制VV新生有關(guān)。

此外，將抑制VV新生與促進新生VV成熟化結(jié)合起來綜合干預(yù)，可能為臨床上防治AS帶來新理念、新變革。四妙勇安湯對新生VV成熟化的影響有待進一步研究。

1 Williams J K,Heistad D D.Structure and function of vasa vasorum.Trends Cardiovasc Med,1996,6(2):53-57.

2 Schinkel A F,Krueger C G,Tellez A,et al.Contrast-enhanced ultrasound for imaging vasa vasorum: comparison with histopathology in a swine model of atherosclerosis. EurJ Echocardiogr,2010,11(8):659-64.

3 Kwon H M,Sangiorgi G,Ritman E L,et al.Enhanced coronary vasa vasorum neovascularization in experimental hypercholesterolemia.J Clin Invest,1998,101(8):1551.

4 Mulligan-Kehoe M J,Simons M.Vasa vasorum in normal and diseased arteries.Circulation,2014,129(24):2557-66.

5 Kwon T G,Lerman L O,Lerman A.The Vasa Vasorum in Atheroscl-erosis:The Vessel Within the Vascular Wall.J Am Coll Cardiol,2015,65(23):2478-80.

7 徐叔云.藥理實驗方法學(xué).北京市:人民衛(wèi)生出版社,2002:200-223.

8 Tonar Z,KuralT J,Kochová P,et al.Vasa vasorum quantification in human varicose great and small saphenous veins.Ann Anat.2012,94(5):473-481.

9 Bj?rnheden T,Levin M,Evaldsson M,et al.Evidence of hypoxic areas within the arterial wall in vivo.Arterioscler Thromb Vasc Biol,1999,19(4):870-876.

10 Nakashima Y,Chen Y X,Kinukawa N,et al.Distributions of diffuse intimal thickening in human arteries: preferential expression in atheros-clerosis-prone arteries from an early age.Virchows Arch,2002,441(3):279-288.

11 Lim C S,Kiriakidis S,Sandison A,et al.Hypoxia-inducible factor pathway and diseases of the vascular wall.J Vasc Surg,2013,58(1):219-230.

12 Zimna A, Kurpisz M. Hypoxia-Inducible Factor-1 in Physiological and Pathophysiological Angiogenesis: Applications and Therapies.Biomed Res Int,2015,2015:549412.

13 He L,Xu J,Chen L,et al.Apelin/APJ signaling in hypoxiarelated diseases.Clin Chim Acta,2015,451(Pt B):191-8.

14 Koivunen P,Serpi R,Dimova E Y.Hypoxia-inducible factor prolyl 4-hydroxylase inhibition in cardiometabolic diseases.Pharmacol Res,2016,114:265-273.

15 Yu X H,Tang Z B,Liu L J,et al.Apelin and its receptor APJ in cardiovascular diseases.Clin Chim Acta,2014,428:1-8.

16 Wu L,Chen L,Li L.Apelin/APJ system:A novel promising therapy target for pathological angiogenesis.Clin Chim Acta,2016,466:78-84.

17 Folino A,Montarolo P G,Samaja M,et al.Effects of apelin on the cardiovascular system.Heart Fail Rev,2015,20(4):505-18.

18 Masri B,van den Berghe L,Sorli C,et al.Apelin signalisation and vascular physiopathology.J Soc Biol,2009,203(2):171-9.