于修芳，董 蕊，曹 玲，王月瑩，高海南，耿 放，劉國良，張 寧，4＊＊

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 哈爾濱 150040；2.哈爾濱師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院 哈爾濱 150025；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)佳木斯學(xué)院 佳木斯 154007；4.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究省部共建教育部重點實驗室 哈爾濱 150040）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD），是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變，是老年期癡呆最常見的一種類型。AD的主要臨床表現(xiàn)為漸進性記憶障礙、認(rèn)知功能障礙、人格改變等神經(jīng)精神癥狀，嚴(yán)重影響社交、職業(yè)與生活[1]。臨床上，對于AD的治療方法有多種，如膽堿酯酶抑制劑，非甾體抗炎藥，抗氧化劑等[2,3]，但是目前，尚沒有哪種治療方式可以完全逆轉(zhuǎn)AD患者的進展性病情。因此，針對西藥多是單一靶點治療，且AD發(fā)病機制復(fù)雜，中藥具有多靶點性，研究中藥及其復(fù)方制劑有望解決上述問題。

中藥方劑補陽還五湯由黃芪、赤芍、川芎、當(dāng)歸、地龍、桃仁、紅花七味藥組成，具有多種藥理作用，包括：改善心肌缺血，抗動脈粥樣硬化，抗腦缺血及腦缺血再灌注損傷，對周圍神經(jīng)損傷的修復(fù)等[4,5]，臨床常用于心腦血管疾病，神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療[6,7]。對于補陽還五湯的研究很多，但是從動物多種行為學(xué)角度入手的研究卻很少，因此，本研究將從行為學(xué)角度，研究中藥補陽還五湯對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠[8,9]學(xué)習(xí)記憶能力的影響，并探討其對AD模型小鼠海馬炎癥因子表達的影響。

本實驗通過檢測AD模型小鼠海馬炎癥因子的表達變化，并采用新物體識別實驗和避暗實驗兩種行為學(xué)方法，研究補陽還五湯對AD模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響，為臨床治療AD提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠和清潔級C57BL/6J小鼠，雄性，5月齡，體質(zhì)量40±10 g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格證號：SCXK（京）2015-0001號。飼養(yǎng)環(huán)境溫度控制在21±1℃的條件下，相對濕度60±10%，保持12 h白天/12 h黑夜的循環(huán)，動物自由飲食和進水。

1.2 藥物與試劑

補陽還五湯凍干粉劑制備：補陽還五湯由周忠光教授購買于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，并由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗中心田明教授鑒定，并將生黃芪、當(dāng)歸尾、赤芍、川芎、地龍、桃仁、紅花這七味藥制備成水煎劑，冷凍干燥成干粉，置于4℃冰箱中密封保存?zhèn)溆谩ｊ栃詫φ账廂}酸多奈哌齊粉末購自于源葉生物（S60449）,補陽還五湯和鹽酸多奈哌齊均以生理鹽水稀釋至所需濃度。兔抗IL-6抗體（批號bs-4587M）、兔抗TNF-α抗體（批號bs-10802R）

兔抗β-actin抗體（批號bs-0061R）、HRP標(biāo)記羊抗兔IgG（批號bs-0295G-HRP）均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒（P0011）彩色預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)（批號P0069）購自碧云天生物技術(shù)。

1.3 實驗儀器

水迷宮設(shè)備（ZH-Morris）購自于安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司，新物體識別設(shè)備（RD1121-NR-M）和避暗設(shè)備（RD1106-SB-M）均購自于上海移數(shù)信息科技有限公司，一體式微型化學(xué)發(fā)光成像儀（Smart chemiⅡ）購自北京賽智創(chuàng)業(yè)科技公司，mini PROTEAN Tetra Cell（043BR57823）電泳儀，Trans-Blot SD Cell（221BR 53984）半干轉(zhuǎn)膜儀購自美國Bio-Rad公司。

1.4 動物分組與處理

APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠隨機分為5組，每組10只，分別為：模型組，鹽酸多奈哌齊陽性對照組，補陽還五湯高、中、低劑量組，10只C57小鼠作為空白組。補陽還五湯高、中、低劑量組每天分別以37.06 g·kg-1，18.53 g·kg-1，9.26 g·kg-1的劑量灌胃，多奈哌齊組小鼠每天以鹽酸多奈哌齊0.001 g·kg-1的劑量給予灌胃，模型組和空白組每天灌胃相同體積的生理鹽水，灌胃時間持續(xù)30天。

1.5 行為學(xué)實驗

1.5.1 新物體實驗

灌胃30天后，進行新物體識別實驗，實驗分為三個階段進行：熟悉期、訓(xùn)練期和測試期。第一天為熟悉期，讓其自由活動5 min。第二天分為訓(xùn)練期和測試期，訓(xùn)練期將兩個形狀、大小、顏色和質(zhì)地完全相同的物體，放到箱體一端，將小鼠背向物體放置在對側(cè)箱壁中點，讓其熟悉5 min。1 h后為測試期，用另外一個形狀、大小、顏色和質(zhì)地完全不同的物體替換其中一個。小鼠從相同位置放入，記錄小鼠5 min內(nèi)對新舊物體的探索實踐，分別為Tn和Tf。用識別指數(shù) =(Tn-Tf)/(Tn+Tf)表示小鼠對物體的識別能力。

1.5.2 避暗實驗

實驗裝置包括明暗兩室，兩室間有一個直徑為6 cm的圓洞，暗室地圖的銅柵接電。訓(xùn)練時將小鼠背對洞口放入明箱，適應(yīng)3 min后，暗室通40 V、50 Hz交流電，小鼠進入暗室就會被電擊。訓(xùn)練期間，棄去避暗潛伏期大于180 s的小鼠。24 h后，進入測試期，記錄小鼠5 min內(nèi)第一次進入暗室的時間（即為潛伏期）和進入次數(shù)（即為錯誤次數(shù)）。

1.6 樣本采集和海馬炎癥因子的檢測

行為學(xué)實驗結(jié)束后，取材各組小鼠的新鮮海馬組織樣品，把組織剪成細小的碎片。溶解在含有1%PMSF的RIPA裂解液中，混勻海馬組織。冰水中超聲震蕩30 min。離心和保存。充分裂解后，組織和細胞用離心機14 000 r·min-1離心，4°C下離心5 min，取上清分裝于0.5 mL離心管中，置于-20℃保存。取各組樣品，BCA法測定蛋白濃度。取預(yù)染蛋白Maker和40 μg蛋白樣品上樣，10%SDS-PAGE電泳分離。電泳結(jié)束后，用濕法轉(zhuǎn)膜法（80 V，50 min）將目的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用脫脂奶粉將膜在室溫下封閉2 h，加一抗（1:400）4℃孵育過夜。第二天，用TBST洗4遍，5 min/遍，加入二抗（1:5 000），在室溫搖床上孵育2 h，然后，用TBST洗4遍，5 min/遍，ECL成像。

2 數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)

用SPSS18.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析，組間比較利用單因素方差分析（one-way ANOVA），實驗數(shù)據(jù)均用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±sD）表示，P＜0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。3結(jié)果

2.1 補陽還五湯對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠新物體識別行為學(xué)的影響

補陽還五湯對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠新物體識別實驗的影響結(jié)果見表1所示，與空白組相比，模型組小鼠的識別指數(shù)明顯降低（P＜0.01）；與模型組相比，補陽還五湯高、中劑量組APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠的識別指數(shù)明顯提高（P＜0.01）。

表1 補陽還五湯對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠新物體實驗結(jié)果

表2 補陽還五湯對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠避暗實驗的影響

圖1 補陽還五湯對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠海馬炎癥因子的影響

表3 補陽還五湯對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠海馬炎癥因子的影響

2.2 補陽還五湯對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠避暗行為學(xué)的影響

補陽還五湯對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠避暗行為學(xué)的影響結(jié)果見表2所示，與空白組相比，模型組小鼠逃避潛伏期明顯降低（P＜0.01），錯誤次數(shù)明顯增加（P＜0.01）；與模型組相比，補陽還五湯高、中劑量組避暗潛伏期明顯增加（P＜0.01），錯誤次數(shù)明顯減少（P＜0.01）。

2.3 補陽還五湯對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠海馬炎癥因子的影響

補陽還五湯對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠海馬炎癥因子的影響結(jié)果見圖1和表3所示，與空白組相比，模型組小鼠海馬炎癥因子IL-6和TNF-α表達明顯增加（P＜0.01），與模型組相比，補陽還五湯高、中劑量組小鼠海馬炎癥因子IL-6和TNF-α表達明顯降低（P＜0.01）。

3 討論與結(jié)論

本研究采用的兩種行為學(xué)實驗均是阿爾茨海默病代表性的行為學(xué)方法。我們預(yù)先給予小鼠不同劑量的補陽還五湯，30天后觀察它們在新物體識別實驗和避暗實驗中的行為學(xué)變化，以評價補陽還五湯抗阿爾茨海默病的作用。

膽堿能神經(jīng)元的丟失是AD的一個重要病理學(xué)特征，其異常主要體現(xiàn)在：Ach合成減少，膽堿攝取減少，乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶活性降低及膽堿能受體的改變等，膽堿能神經(jīng)元在維持腦血流，皮質(zhì)活動，學(xué)習(xí)記憶及認(rèn)知功能中發(fā)揮著重要作用[10]。臨床上，目前對于AD的治療主要是膽堿酯酶抑制劑，膽堿酯酶抑制劑作用是通過抑制膽堿酯酶的活性，延緩?fù)挥|間隙中Ach的降低，以增強膽堿能神經(jīng)元的突觸傳遞功能[11]。且研究表明，APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的早期記憶障礙與膽堿能系統(tǒng)功能異常有關(guān)[12]。因此實驗中采用乙酰膽堿酯酶抑制劑鹽酸多奈哌齊作為陽性藥，以此更好的判斷補陽還五湯的抗AD作用。

新物體識別實驗是通過嚙齒類動物先天對新物體具有探索傾向這一習(xí)性設(shè)計的，實驗中通過監(jiān)測各組動物對新舊物體的探索時間，來進一步評價動物的非空間工作記憶能力[13]。在新物體識別實驗中，補陽還五湯高、中劑量組小鼠對新物體探索時間明顯長于模型組小鼠，與陽性藥鹽酸多奈哌齊效果一致，即高、中劑量的補陽還五湯發(fā)揮了明顯的抗AD作用。

避暗實驗原理是利用小鼠的嗜暗習(xí)性設(shè)計的，實驗中動物間的差異較小，是測定小鼠記憶能力的常用方法[14]。在最后的避暗實驗中，高、中劑量的補陽還五湯組小鼠的避暗潛伏期較模型組小鼠明顯延長，且錯誤次數(shù)明顯降低。

研究表明，炎癥因子的高表達與AD發(fā)生有密切關(guān)系，白細胞介素-6（interleukin6，IL-6）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）等因子在AD的發(fā)病過程中增加了Aβ的沉積[15]。在臨床上對AD患者進行抗炎治療，可改善或延緩患者認(rèn)知功能的損害進程[16]。實驗中通過檢測小鼠海馬炎癥因子發(fā)現(xiàn)，補陽還五湯能夠明顯降低小鼠海馬區(qū)炎癥因子的表達，以此發(fā)揮對AD模型小鼠的保護作用。

上述實驗結(jié)果表明補陽還五湯可以明顯降低AD模型小鼠海馬區(qū)炎癥因子的表達，并且能夠明顯改善其學(xué)習(xí)記憶能力，與今年來的報道吻合[17,18]。由于補陽還五湯治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病療效可靠，服用安全、無明顯副作用，進一步探討其作用機理將具有深遠的理論和實際意義。

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