余蘭彬，陳 雨，徐國良，楊 樂，胡家麗，段江南，姜 麗＊＊

（1.江西中醫(yī)藥大學(xué)江西省中醫(yī)病因生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南昌 330004；2.江西省上饒市人民醫(yī)院彩超科 上饒 334000）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是導(dǎo)致缺血性心臟病和中風(fēng)的主要因素，可導(dǎo)致嚴(yán)重的心腦血管事件[1]，也是人類發(fā)病率最高、危害最大的疾病之一，且隨著我國經(jīng)濟(jì)水平的提高和人口老齡化的快速增長，發(fā)病率持續(xù)上升。研究表明[2-4]，血中低密度脂蛋白（LDL）或氧化低密度脂蛋白（Ox-LDL）增高、自由基（通常是由吸煙引起的）、高血糖及傳染性病原體（如肺炎衣原體、牙齦卟啉菌和皰疹病毒等）都被認(rèn)為與AS的發(fā)病相關(guān)。

Ross教授[5]提出的炎癥損傷反應(yīng)和氧化應(yīng)激與AS的發(fā)病關(guān)系密切，在AS發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。氧化應(yīng)激可加速低密度脂蛋白（LDL）在動脈內(nèi)膜的沉積，使LDL成為氧化型LDL(ox-LDL），誘導(dǎo)單核細(xì)胞黏附、遷移進(jìn)入動脈內(nèi)膜，轉(zhuǎn)化成巨噬細(xì)胞。故氧化應(yīng)激可通過多方面參與AS的發(fā)生與發(fā)展[6]。因此，抗炎和抗氧化方面的用藥成為這類疾病治療的新方向，為預(yù)防和治療AS及其相關(guān)性疾病的發(fā)生發(fā)展提供了新的思路與途徑。

本實(shí)驗(yàn)從調(diào)節(jié)Ox-LDL、MCP-1、VCAM-1等炎癥指標(biāo)及抗氧化作用入手，探討了黃連解毒湯干預(yù)治療AS的可能作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動物

清潔級雄性SD大鼠，（體重200±20 g，合格證號SCXK(京)2006-0009，購自斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司（湖南長沙）。飼養(yǎng)環(huán)境為排氣通風(fēng)籠具內(nèi)（EVC），保持室溫(22±2)℃，相對濕度（50±10）%。晝夜自然明暗交替，自由飲水，根據(jù)各組給予普通飼料和高脂飼料。

1.2 儀器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi公司）；全自動酶標(biāo)檢測儀（北京中諾遠(yuǎn)東科技有限公司）；HH-W600三用恒溫水箱（金壇市萬華實(shí)驗(yàn)儀器廠）；KQ-300VDE型雙頻數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器廠）；病理切片機(jī)（德國Leica RM 2016輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)）、切片刀（日本羽毛R35一次性刀片）、組織攤烤片機(jī)（武漢俊杰JK-6生物組織攤烤片機(jī)）、載玻片及蓋玻片（江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司）、顯微鏡（尼康E100型生物顯微鏡）、數(shù)碼單反相機(jī)（佳能550D）。

1.3 試藥與試劑

黃連（批號150507）、黃芩（批號150814）、黃柏（批號150130）、梔子（批號141210），上述藥材均購自江西江中中藥飲片有限公司；洛伐他?。ㄅ?50501，購自江蘇大洋制藥有限公司）；高脂飼料和普通飼料（許可證號：SCXK（湘）2011-0003，購自北京科奧協(xié)力飼料有限公司）；維生素D3注射液（批號130140，購自上海通用藥業(yè)股份有限公司）；丙二醇檢測試劑盒、超氧化物氣化酶檢測試劑盒（許可證號：贛食藥監(jiān)械生產(chǎn)許20110023號，南京建成生物科技有限公司）、Ox-LDL、MCP-1及VCAM-1試劑盒（均購于武漢伊艾博科技有限公司）、包埋石蠟（國藥集團(tuán)，批號69019361）、蘇木素（Sigma，批號H9627）、伊紅Y(水溶性)（國藥集團(tuán)，批號71014544）、鹽酸（國藥集團(tuán)，批號10011018）、二甲苯（國藥集團(tuán)，批號10023418）、中性樹膠（國藥集團(tuán)，批號10004160）。

2 方法

2.1 黃連解毒湯水煎劑的制備

參照文獻(xiàn)[7]，黃連、黃芩、黃柏、梔子按照原方配比3∶2∶2∶3，加6倍蒸餾水浸泡60 min。將浸泡后藥材用大火煮沸后改為文火煎煮30 min，過濾藥液，藥渣再加4倍水用文火煎煮20 min。將兩次藥液合并，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將藥液濃縮至0.5 g/生藥mL，得黃連解毒湯水煎劑，冷卻后分裝于4°C冰箱保存。

2.2 大鼠動脈粥樣硬化模型的建立

參照文獻(xiàn)[8,9]稍作修改，除空白對照組給予普通飼料外，模型組及給藥組均給予高脂飼料，共飼養(yǎng)8周。飼料配方為（0.2%丙基硫氧嘧啶、0.5%膽酸鈉、3%膽固醇、5%白糖、10%豬油、81.3%基礎(chǔ)飼料）。高脂飼料組大鼠在第一周的第3天，按60萬lU/Kg體重腹腔注射維生素D3，并于第2、4、6周的第3天，按20萬lU/Kg體重腹腔注射維生素D3。8周后取血及各組織樣本。

2.3 給藥方案

各組大鼠分別為正常對照組（A）、模型對照組（B）、陽性藥洛伐他汀組（C）、黃連解毒湯低、中、高劑量組（D、E、F）。從第3周開始，正常對照組和模型對照組分別灌胃等體積的生理鹽水，每天1次，直至造模結(jié)束。陽性對照組按5 mg·kg-1灌胃洛伐他汀，每天1次，直至造模結(jié)束；黃連解毒湯低、中、高劑量組等體積分別按1.5、3、6 g生藥/kg體重灌胃黃連解毒湯，每天1次，直至造模結(jié)束。

2.4 檢測項(xiàng)目和檢測方法

2.4.1 病理取材和染色

大鼠在末次給藥30 min后，用10%水合氯醛（4.5 mL·kg-1劑量）腹腔注射麻醉，固定于大鼠操作板上，剪開腹腔，用肝素鈉浸潤過的注射器于腹主動脈內(nèi)取血后，小心剪下各組腹主動脈，切取4 μm厚切片，經(jīng)脫蠟、浸水、染色和固封等步驟，作常規(guī)HE染色。取大鼠肝臟，勻漿后置-80℃冰箱保存。

2.4.2 指標(biāo)檢測

大鼠肝勻漿中Ox-LDL、MCP-1、VCAM-1含量測定采用酶聯(lián)免疫法（ELISA法），MDA、SOD含量采用光度法測定，根據(jù)各指標(biāo)試劑盒提供的試劑與實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作，均采用全自動酶標(biāo)檢測儀完成測定。

2.5 數(shù)據(jù)處理

各組炎癥及氧化相關(guān)指標(biāo)數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism軟件（version 6.0）進(jìn)行處理及作圖。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組數(shù)據(jù)的對比分析采用T檢驗(yàn)，p≤0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 黃連解毒湯對動脈粥樣硬化大鼠腹主動脈病理學(xué)的改善作用

由圖1可知，正常組：血管壁結(jié)構(gòu)清晰完整，平滑肌細(xì)胞排列整齊緊致，內(nèi)膜光滑，無增生；模型組：血管結(jié)構(gòu)異常，內(nèi)膜增厚，表面粗糙，有多數(shù)的隆起，平滑肌細(xì)胞排列紊亂疏松，有斑塊的形成；陽性對照組：血管內(nèi)膜基本無增厚，且較平滑，其平滑肌細(xì)胞排列較整齊架構(gòu)清晰，泡沫細(xì)胞少；HJD低劑量組：血管內(nèi)膜粗糙，褶皺程度與B組相比較輕，管壁增厚，平滑肌細(xì)胞有一定程度上的紊亂，較疏松，且有較大的凸起，總體較模型組平滑；HJD中劑量組：血管內(nèi)壁平滑肌細(xì)胞排列較整齊致密，內(nèi)膜無大幅度的起伏凹凸，內(nèi)膜增厚較少；HJD高劑量組：平滑肌致密整齊，內(nèi)膜光滑，局部見少量粗糙，有少量泡沫細(xì)胞，血管增厚較少。結(jié)果表明，洛伐他丁及HJD各劑量均能夠明顯改善AS的程度。

3.2 黃連解毒湯對動脈粥樣硬化大鼠肝勻漿Ox-LDL、MCP-1、VCAM-1表達(dá)的影響

由表1可知，與正常組比較，模型組MCP-1、Ox-LDL和VCAM-1含量均顯著升高；給藥后，陽性對照組和HJD低、中劑量組MCP-1、Ox-LDL和VCAM-1含量顯著下降；高劑量組MCP-1和VCAM-1含量顯著下降。

3.3 黃連解毒湯對動脈粥樣硬化大鼠肝勻漿MDA及SOD表達(dá)的影響

與正常對照組比較，造模后，SOD含量顯著下降，MDA含量顯著上升，給藥后，陽性組和HJD高劑量組SOD顯著上升（p＜0.05）；陽性組和HJD各劑量組MDA含量均顯著下降（p＜0.05）。結(jié)果見表2。

4 討論

中醫(yī)認(rèn)為氣滯血瘀，脈失通利，則易于粥樣斑塊的形成[10]。濕熱之邪（無論是外感濕熱或是內(nèi)傷雜病濕熱）長期蘊(yùn)結(jié)不解亦可化為毒，致氣血運(yùn)行失暢，瘀血內(nèi)生，最終都可能導(dǎo)致AS，進(jìn)而引發(fā)一系列心腦血管疾病如高血壓、冠心病、腦中風(fēng)等并發(fā)癥。故清熱解毒燥濕法對防治AS尤為關(guān)鍵。

AS病變過程中單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)起著重要的作用。體內(nèi)單核/巨噬細(xì)胞系統(tǒng)被激活后會釋放大量的炎癥因子，導(dǎo)致動脈內(nèi)膜形態(tài)的異常及功能的紊亂，如脂質(zhì)沉積于內(nèi)膜下，造成血管組織嚴(yán)重受損。因此，單核細(xì)胞黏附并趨化遷入血管內(nèi)膜是AS形成的早期事件[11]。而MCP-1是趨化單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞遷入血管內(nèi)膜的主要細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)單核細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等表達(dá)黏附分子，使各種炎性細(xì)胞向病變部位聚集，不斷進(jìn)入斑塊組織中，誘發(fā)單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞對炎癥因子的刺激做出應(yīng)答，促使免疫損傷不斷加重，粥樣斑塊不斷形成。由此，MCP-1被認(rèn)為是潛在的可反映AS早期改變與預(yù)后的生化指標(biāo)[12,13]。VCAM-1在內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等細(xì)胞上表達(dá)，受到炎癥因子等刺激后，其表達(dá)水平明顯上升[14]。另有研究表明[15,16]，清熱解毒活血復(fù)方不僅能減少非致炎狀態(tài)下血管內(nèi)皮細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的黏附，還能減少致炎因子所誘導(dǎo)的這兩類細(xì)胞黏附作用的增強(qiáng)，從而穩(wěn)定粥樣斑塊，防止破裂，對動脈形態(tài)學(xué)和功能學(xué)的改變有保護(hù)作用。

圖1 HJD對動脈粥樣硬化大鼠腹主動脈病理學(xué)改善情況（×200）

表1 HJD對肝勻漿MCP-1、Ox-LDL和VCAM-1含量的影響(±s,n=6)

表1 HJD對肝勻漿MCP-1、Ox-LDL和VCAM-1含量的影響(±s,n=6)

注：與模型組（B組）比較，*p＜0.05，**p＜0.01。

VCAM-1水平118.07±3.49**166.34±14.47 115.51±15.39**136.25±12.7**120.47±14.57**107.26±6.32**組別正常對照組模型對照組陽性對照組HLJDT低劑量組HLJDT中劑量組HLJDT高劑量組MCP-1水平19.54±2.32**40.76±5.66 24.58±3.39**27.63±3.55**26.06±1.89**21.59±2.18**Ox-LDL水平28.72±3.71**36.53±2.59 29.29±4.75*32.07±3.58*31.08±4.65*33.71±5.45

表2 HJD對肝勻漿MDA、SOD含量的影響(±s,n=6)

表2 HJD對肝勻漿MDA、SOD含量的影響(±s,n=6)

注：與模型組（B組）比較，*p＜0.05，**p＜0.01。

肝勻漿MDA水平15.09±1.56**23.47±4.52 16.05±1.94**17.5±1.48*17.94±1.6*15.74±1.08**組別正常對照組模型對照組陽性對照組HLJDT低劑量組HLJDT中劑量組HLJDT高劑量組肝勻漿SOD水平192.11±1.49**186.22±2.18 192.99±2.21**183.2±6.87 191.05±9.13 193.15±5.19*

黃連解毒湯由黃連、黃柏、黃芩和梔子四種藥組成，是清熱燥濕解毒的經(jīng)典名方。研究表明，本方可下調(diào)炎性細(xì)胞因子的表達(dá)[17]，并通過抵抗肺炎衣原體（Cpn）感染炎癥過度反應(yīng)而發(fā)揮抑制AS進(jìn)程的作用[18]。此外，氧化應(yīng)激及其介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)在AS的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。氧自由基與脂肪酸發(fā)生鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物如MDA，能刺激血管平滑肌細(xì)胞的增殖，從而間接地反出細(xì)胞損傷的程度[19]。本實(shí)驗(yàn)中，黃連解毒湯組MCP-1，VCAM-1表達(dá)明顯降低，提示黃連解毒湯可以抑制AS大鼠炎癥反應(yīng)，從而干預(yù)AS斑塊的形成。有文獻(xiàn)報(bào)道[20，21]，其抑制黏附因子的表達(dá)可能是其消退AS斑塊的重要機(jī)制。陽性藥洛伐他丁及黃連解毒湯組均能通過提高SOD活性，顯著降低MDA和ox-LDL的生成，顯著地降低高脂刺激所致的AS形成過程中氧化應(yīng)激反應(yīng)。

黃連解毒湯作為清熱解毒燥濕的良方，能夠提高機(jī)體抗氧化能力，減少M(fèi)DA的對動脈的損傷，防止各處動脈炎性因子和氧化損傷的侵害。本研究基于中醫(yī)清熱解毒燥濕防治AS角度，從抗炎抗氧化等指標(biāo)入手，初步闡明黃連解毒湯抗AS的作用機(jī)制，但其更深入的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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