張靜曉，劉曉潔，楊 春，陳盼盼，張麗雷

（湖北民族學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院 恩施 445000）

細(xì)胞凋亡存在于多細(xì)胞生物的整個(gè)生命過程中,此過程可及時(shí)清除機(jī)體內(nèi)多余和受損傷的細(xì)胞，維持組織器官的穩(wěn)定性，對(duì)機(jī)體自身的穩(wěn)定具有關(guān)鍵的作用[1]。細(xì)胞的凋亡受到生物體自身代謝的嚴(yán)格調(diào)控，當(dāng)細(xì)胞的正常凋亡過程受到干擾，細(xì)胞便會(huì)產(chǎn)生異常，從而出現(xiàn)特殊表型，細(xì)胞分化停滯甚至產(chǎn)生腫瘤[2]。參與細(xì)胞凋亡過程的主要包括凋亡蛋白酶(caspases)、銜接蛋白(adapter proteins)、Bcl-2和凋亡抑制蛋白(IAPs)等4類蛋白。其中Caspase半胱氨酸蛋白酶家族包含高度同源的半胱氨酸蛋白酶,分為兩個(gè)主要的亞科，一個(gè)亞科家族參與炎癥過程，包括CASP1,4和5等，另一個(gè)亞科家族在細(xì)胞凋亡過程中起重要作用，包含CASP3,8和9等[3]。CASP3的作用方式是，當(dāng)細(xì)胞受到損傷時(shí)，其主要表現(xiàn)為線粒體膜損傷，線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素釋放到細(xì)胞外，激活CASP3從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[4]。CASP3作為治療某些癌癥的靶點(diǎn)受到越來越多的關(guān)注，研究CASP3抑制劑是抗癌藥物開發(fā)的有效方法之一。

基于生物信息學(xué)方法，從天然產(chǎn)物中篩選有效成分，研究其與靶點(diǎn)的作用機(jī)制，是新藥開發(fā)和研究中藥作用機(jī)理的重要方法[5-8]。本課題組利用多種生物信息學(xué)方法建立了一個(gè)中藥有效成分篩選的模擬體系，通過類藥性篩選、靶點(diǎn)預(yù)測(cè)等方法，從中草藥中篩選出與CASP3靶點(diǎn)有相互作用的7種有效成分[9]，如表1所示。本文在前期研究的基礎(chǔ)上，采用Autodock Vina程序[10]對(duì)篩選后的有效成分與CASP3進(jìn)行分子對(duì)接，之后進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)（MD）模擬，通過分析分子模擬的軌跡以及得到的相互作用能，預(yù)測(cè)它們與CASP3的結(jié)合位點(diǎn)以及作用方式。

1 材料和方法

1.1 材料的準(zhǔn)備

從蛋白晶體數(shù)據(jù)庫（RCSB PDB數(shù)據(jù)庫）中得到CASP3靶點(diǎn)的晶體結(jié)構(gòu)（PDB ID：5I9T），除去晶體水，并對(duì)其加氫，作為分子模擬時(shí)受體的初始模型，記為CASP3。天然產(chǎn)物中的藥物分子從化學(xué)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（Chemspider）中獲取，采用GAMESS量子化學(xué)軟件包[11]，在B3LYP方法，6-31（d，p）基組水平上優(yōu)化得到藥物分子的結(jié)構(gòu)，通過頻率分析保證其處于穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，作為分子對(duì)接時(shí)配體的初始構(gòu)象。

1.2 分子對(duì)接

藥物分子與CASP3的對(duì)接在AutoDock Vina程序中進(jìn)行，使用半柔性對(duì)接方法，CASP3被視為一個(gè)剛體和藥物分子所有的可旋轉(zhuǎn)鍵進(jìn)行對(duì)接。最有可能的結(jié)合位點(diǎn)采用搜索全局優(yōu)化法（Iterated Local Search Globle Optimizer）搜索。最佳的結(jié)合位點(diǎn)設(shè)定為涵蓋CASP3整個(gè)活性口袋大小為30×30×30 ?3的盒子內(nèi)，盒子的網(wǎng)格間距為1.0 ?，以藥物分子的幾何中心為中心，在每個(gè)對(duì)接過程中，根據(jù)在AutoDock Vina的評(píng)分函數(shù)計(jì)算出的結(jié)合親和能，篩選出了10個(gè)打分最高的構(gòu)象模型。

1.3 分子動(dòng)力學(xué)模擬

分子動(dòng)力學(xué)（MD）模擬在NAMD（版本2.11）程序[12]中進(jìn)行，將分子對(duì)接得到的復(fù)合物結(jié)構(gòu)用作MD模擬的初始構(gòu)象，采用CHARMM 27全原子力場(chǎng)。藥物配體分子力場(chǎng)參數(shù)采用SwissParam程序生成。在復(fù)合物的周圍建立可將復(fù)合體完全包圍且延伸8 ?的立方體水模型的周期性結(jié)構(gòu)，原子的總數(shù)目大約為12 400個(gè)。在進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬之前，進(jìn)行兩步優(yōu)化，使整個(gè)體系松弛：第一步，用最陡下降法和共軛梯度法優(yōu)化水分子；第二步，將整個(gè)體系優(yōu)化至收斂。優(yōu)化結(jié)束后，為了避免快速升溫對(duì)溶質(zhì)分子帶來的影響，采取了緩慢升溫的方法，體系溫度在220 ps內(nèi)由0 K緩慢加熱至310 K，之后進(jìn)行10 ns的NPT模擬，時(shí)間步長(zhǎng)為2 fs。在動(dòng)力學(xué)模擬過程中，應(yīng)用Langevin動(dòng)力學(xué)控制溫度，碰撞頻率為1.0 ps-1。將所有和氫原子相連的鍵設(shè)置為不振動(dòng)，使用PME（Particle Mesh Ewald）方法計(jì)算長(zhǎng)程靜電相互作用，范德華相互作用的截?cái)嘀禐?2 ?。

2 結(jié)果與討論

2.1 分子對(duì)接

將本課題組篩選得到的7個(gè)與CASP3靶點(diǎn)有相互作用的化合物為研究對(duì)象[7]，分別與CASP3進(jìn)行對(duì)接，通過AutoDock Vina程序?qū)?duì)接結(jié)果進(jìn)行打分，所得分值如表1所示。由表可見，丹參酮IIA和野黃芩苷與CASP3具有較好的空間匹配度，所需結(jié)合能量最低。

表1 分子對(duì)接的最優(yōu)化模型結(jié)果

圖1 丹參酮IIA（A）、野黃芩苷（B）與CASP3模型對(duì)接后的結(jié)果

圖2 CASP3復(fù)合物模型MD模擬期間骨架原子的均方根偏差

丹參酮IIA（A）、野黃芩苷（B）與CASP3對(duì)接結(jié)果如圖1所示。從圖中可以看出丹參酮IIA、野黃芩苷均對(duì)接在CASP3的活性口袋中，參考X射線衍射法獲得的5I9T模型，對(duì)接的位置是合理的。

2.2 分子動(dòng)力學(xué)

將丹參酮IIA、野黃芩苷的對(duì)接結(jié)構(gòu)作為初始構(gòu)象，進(jìn)行了10 ns的分子動(dòng)力學(xué)模擬，對(duì)其進(jìn)行RMSD計(jì)算，結(jié)果如圖2所示。從圖中可見，這兩個(gè)體系骨架原子的RMSD逐漸趨于穩(wěn)定，其中丹參酮IIA與CASP3結(jié)合的構(gòu)象很快達(dá)到穩(wěn)定，最后上下波動(dòng)幅度穩(wěn)定在0.5 ?左右，野黃芩苷與CASP3結(jié)合的構(gòu)象在5 ns左右經(jīng)歷一個(gè)上升后達(dá)到穩(wěn)定，上下波動(dòng)幅度穩(wěn)定在0.7 ?左右。

圖3 丹參酮IIA（A）和野黃芩苷（B）與CASP3模型的相互作用網(wǎng)絡(luò)

圖4 丹參酮IIA（A）和野黃芩苷（B）與CASP3的相互作用力（VDW：范德華力，Elec：靜電力）

在最后的1 000 ps的運(yùn)動(dòng)軌跡中，取最低能量結(jié)構(gòu)進(jìn)行了相互作用分析。使用軟件Ligplot+[13]計(jì)算得到丹參酮IIA和野黃芩苷與CASP3模型的相互作用網(wǎng)絡(luò)，如圖3所示。從圖中可見，丹參酮IIA和野黃芩苷均與CASP3形成疏水相互作用，其中丹參酮IIA與4個(gè)殘基（Phe256、Ser205、Trp206、Arg207）具有疏水作用，并且與Ser251形成一個(gè)鍵長(zhǎng)為2.76 ?的氫鍵；野黃芩苷與9個(gè)殘基（Ser249、Trp214、Trp206、Arg207、Ser205、Ala162、Tyr204、Cys163、Hsd121）有 疏 水 作 用 ，與Ser251和Phe250等6個(gè)殘基形成7個(gè)氫鍵。其中，與殘基Ser251的O原子形成的氫鍵鍵長(zhǎng)為2.88 ?，與殘基Phe250的N原子形成的氫鍵鍵長(zhǎng)為3.03 ?，與殘基Asn208的N原子形成的氫鍵鍵長(zhǎng)為3.09 ?，與殘基Ser120的O原子形成的氫鍵鍵長(zhǎng)為2.78 ?，與殘基Gln161的N原子和O原子分別形成2個(gè)氫鍵，鍵長(zhǎng)分別為3.21 ?和3.02 ?，與殘基Thr62的O原子形成的氫鍵鍵長(zhǎng)為2.66 ?。由于蛋白質(zhì)和藥物分子之間形成的氫鍵有利于它們的結(jié)合，說明野黃芩苷與CASP3的結(jié)合能力優(yōu)于丹參酮IIA與蛋白質(zhì)的結(jié)合能力。

對(duì)丹參酮IIA和野黃芩苷分別與CASP3形成的靜電力和范德華力進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖4所示。從圖中可見，配體分子與CASP3之間的作用力在不同模擬時(shí)間較為穩(wěn)定。丹參酮IIA與CASP3之間的范德華力平均值為-21.97 kcal·mol-1，靜電力平均值為-5.31 kcal·mol-1，故主要作用力為范德華力；野黃芩苷與CASP3之間的范德華力平均值為-41.39 kcal·mol-1，靜電力平均值-26.51 kcal·mol-1，故其主要作用力也為范德華力。野黃芩苷與CASP3之間的結(jié)合強(qiáng)度大于丹參酮IIA，這是由于它與CASP3之間不僅具有較大的范德華力，而且具有較強(qiáng)的靜電力，與前述野黃芩苷與CASP3形成了較多的氫鍵的結(jié)論一致。

2.3 氫鍵分析

氫鍵是維系蛋白質(zhì)與配體分子穩(wěn)定性的重要作用力[14]，分別對(duì)丹參酮IIA和野黃芩苷與CASP3形成的幾條氫鍵進(jìn)行分析，判斷氫鍵采用的幾何依據(jù)為氫鍵鍵長(zhǎng)不大于3.5 ?，鍵角不大于30°，以5 000 ps到10 000 ps的運(yùn)動(dòng)軌跡為研究對(duì)象，計(jì)算了平均鍵長(zhǎng)，平均鍵角，以及鍵長(zhǎng)存活概率（氫鍵長(zhǎng)度小于3.5 ?，同時(shí)鍵角小于30°的概率），結(jié)果如表2所示，表中氫鍵編號(hào)如圖3所示。

由表2和圖3可見，丹參酮IIA與CASP3形成的一個(gè)氫鍵不太穩(wěn)定，存活率為48.03%。野黃芩苷與CASP3形成的七個(gè)氫鍵中，與殘基Ser251的O原子形成的氫鍵（編號(hào)2），與殘基Asn208的N原子形成的氫鍵（編號(hào)4），與殘基Gln161的N原子形成的氫鍵（編號(hào)6），與殘基Thr62的O原子形成的氫鍵（編號(hào)8）均不穩(wěn)定，存活率分別為2.35%、10.04%、3.10%和7.35%。然而，與殘基Phe250的N原子形成的氫鍵（編號(hào)3），與殘基Ser120的O原子形成的氫鍵（編號(hào)5），與殘基Gln161的O原子形成的氫鍵（編號(hào)7）的存活率分別為90.15%、85.16%和82.31%，表明這些氫鍵較為穩(wěn)定，是野黃芩苷與CASP3形成較強(qiáng)相互作用的主要原因。

表2 氫鍵情況統(tǒng)計(jì)表

3 結(jié)論

本文以從幾種天然產(chǎn)物的化學(xué)成分中篩選出的小分子為研究對(duì)象，以分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)方法，研究了其與CASP3之間的相互作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，丹參酮IIA和野黃芩苷具有較好的對(duì)接結(jié)果，并通過分子動(dòng)力學(xué)方法獲取了這兩種藥物與CASP3結(jié)合的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，它們之間的范德華力均強(qiáng)于靜電力。另外，丹參酮IIA與CASP3中的Phe256、Ser205、Trp206等4個(gè)氨基酸殘基具有疏水作用，形成1個(gè)氫鍵。野黃芩苷與CASP3靶點(diǎn)中的Ser249、Trp214、Trp206等9個(gè)氨基酸殘基具有疏水作用，形成了7個(gè)穩(wěn)定性不同的氫鍵，其中與殘基Phe250的N原子，與殘基Ser120的O原子，與殘基Gln161的O原子形成的3個(gè)氫鍵最為穩(wěn)定，是形成穩(wěn)定構(gòu)象的主要原因。研究與其相似的結(jié)構(gòu)，有望獲得CASP3靶點(diǎn)的有效抑制劑。目前，相關(guān)研究正在繼續(xù)展開。

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