趙東峰，舒 冰，唐德志，張 巖，趙永見，李晨光，王 強，梁倩倩，崔學(xué)軍，楊燕萍，徐 浩，施 杞，王擁軍,4＊＊

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院 上海 200032；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)脊柱病研究所 上海 200032；3.教育部筋骨理論與治法重點實驗室 上海 200032；4.上海中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院 上海 200032）

原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥（Primary osteoporosis，POP）臨床表現(xiàn)為骨痛、腰背痛和駝背等癥狀[1]。由于患者骨骼系統(tǒng)的脆性增加，輕微外力作用下輕易造成骨折，對健康造成威脅。全球目前約有2億患者，美國、歐洲和日本大約有7 500萬人罹患此病[2]。隨著老年社會的到來，中國POP的發(fā)病率也逐漸升高。在60-64歲婦女人群，POP發(fā)生率為53.8%，而在65-69歲人群發(fā)生率達(dá)到70%，患者并發(fā)癥骨折的發(fā)生率分別為27.5%和32.6%[3]，對患者和家人造成巨大的危害。因此，針對POP治療開發(fā)更加安全有效、價格低廉的藥物成為未來應(yīng)對POP的重要策略。

補腎益精法是中醫(yī)藥治療POP的重要法則，前期臨床實踐和基礎(chǔ)研究[4,5]發(fā)現(xiàn)，腎主導(dǎo)人體骨的生長、發(fā)育、強勁、衰弱，尤其是骨與人體腎精盛衰的關(guān)系密切。《黃帝內(nèi)經(jīng)·素問》：“腎主骨，生髓”、“腎，其充在骨”?！夺t(yī)精經(jīng)義·中卷》曰“骨內(nèi)有髓、骨者髓所生……腎藏精、精生髓，故骨者，腎之所合也”，強調(diào)腎精決定人體骨骼的狀態(tài)。根據(jù)中醫(yī)治療POP病癥結(jié)合的原則，辨證論治也存在溫腎陽、滋腎陰治法的區(qū)別[6,7]，臨床根據(jù)腎陰虛、腎陽虛癥狀的區(qū)別和側(cè)重，治療時分別應(yīng)用滋腎陰和溫腎陽法給予施治。

本項目組通過大樣本臨床流行病學(xué)調(diào)查，驗證了病證結(jié)合防治POP分子流行病學(xué)規(guī)律。在國家“973”計劃項目、國家教育部“創(chuàng)新團隊”計劃項目、國家科技部重點領(lǐng)域“創(chuàng)新團隊”計劃項目等大力支持下，完成了中國華東、華北、東南、東北、西北城市人口地區(qū)完成6 447例POP“證病結(jié)合”臨床流行病學(xué)調(diào)查，證明POP患者多出現(xiàn)倦怠乏力、骨骼疼痛、腰膝酸軟、畏寒肢冷、下肢抽筋、齒搖發(fā)脫等“腎精虧虛”表現(xiàn)，且頻次較高，約占83%，其中“腎陽虛證”34%，“腎陰虛證”49%，上述研究明確了“腎精虧虛”是POP主要證候[8]。

“病癥結(jié)合”是治療POP重要策略，滋腎陰和溫腎陽法則是體現(xiàn)“腎精虧虛”和“病癥結(jié)合”的法則的重要體現(xiàn)[5]。在此研究基礎(chǔ)上，本項目組通過分析施杞教授治療POP的2 646張?zhí)幏?，?chuàng)制出新型制劑滋腎陰顆粒和溫腎陽顆粒，臨床取得較好的效果。下文將從病證結(jié)合防治POP臨床試驗研究驗證、病證結(jié)合防治POP基礎(chǔ)實驗研究、病證結(jié)合防治POP的中醫(yī)理論綜合分析等方面進(jìn)行描述。

1 溫腎陽、滋腎陰顆粒防治POP的分子流行病學(xué)研究

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院骨傷科團隊設(shè)計了滋腎陰、溫腎陽顆粒治療POP的多中心、雙盲、安慰劑對照結(jié)合中醫(yī)證型設(shè)計的隨機對照研究[9]。研究中POP患者來源于四個中心（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院、復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院、上海市楊浦區(qū)中心醫(yī)院、西安市紅十字會醫(yī)院4個中心，時間：2011.02-2012.04）的POP患者。中醫(yī)辨證屬腎虛的患者200例，患者隨機化分組法先進(jìn)行中心分層，然后進(jìn)行中醫(yī)證型分層，滋腎陰顆粒試驗組和安慰劑對照組各50例，溫腎陽顆粒試驗組與安慰劑對照組分別為50例，共計200例，比例分配1∶1，試驗組和對照組各100例。觀察指標(biāo)包括骨密度、疼痛（Visual Analogue Scale）VAS評分、中醫(yī)證候積分、ECOS-16生活質(zhì)量問卷及安全性指標(biāo)。時間點為治療前、治療3月、治療6月、停藥3個月和停藥6個月。

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)與安慰劑比較，滋腎陰顆粒治療6月可顯著增加腰椎骨密度（P＜0.05），增加幅度為4.1%。停藥后隨訪6月還可增加腰椎骨密度，增加幅度為4.7%；與安慰劑比較，溫腎陽顆粒治療后可顯著降低疼痛程度VAS評分而改善疼痛（P＜0.05），明顯改善中醫(yī)證候，并能顯著降低ECOS-16評分而改善生活質(zhì)量（P＜0.05）。且整個研究過程中沒有發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)。該研究證明滋腎陰顆粒、溫腎陽顆粒是一種有效、安全的POP治療方法，可以顯著提高POP腰椎骨密度，減輕疼痛，改善中醫(yī)證候，提高患者生活質(zhì)量。同時，證明滋腎陰顆粒能明顯提高患者腰椎骨密度，改善腎陰虛證候；溫腎陽方能明顯改善腎陽虛證候和生活質(zhì)量。

2 溫腎陽、滋腎陰顆粒防治POP的藥對研究

蛇床子、女貞子分別是滋腎陰顆粒和溫腎陽顆粒的主要藥物（君藥），分別具有滋補肝腎陰和溫腎壯陽的作用，其中兩者的中藥配伍目的是達(dá)到“陰中求陽”、“陽中求陰”的效果[10]。藥對是中醫(yī)臨床遣藥組方最基本的配伍形式，藥對的合理組方能起到增效減毒的作用。滋腎陰顆粒和溫腎陽顆粒配伍和組方中蘊含藥對的內(nèi)涵。因此，藥物研制過程中分別用女貞子（滋腎陰顆粒）、蛇床子（溫腎陽顆粒）藥對進(jìn)行相關(guān)的基礎(chǔ)研究。

按照藥劑量的差異，設(shè)置3組，分別體現(xiàn)陽中求陰、陰陽并調(diào)和陰中求陽等3個差異，分別設(shè)置為A組：蛇床子12 g、女貞子6 g（陽中求陰），B組：蛇床子9 g、女貞子9 g（陰陽平衡），C組：蛇床子6 g、女貞子12 g（陰中求陽）。上述藥對灌胃干預(yù)去卵巢誘導(dǎo)的POP小鼠模型。結(jié)果顯示蛇床子-女貞子藥對能夠緩解去卵巢小鼠腰椎骨量丟失，同時改善改善骨小梁結(jié)構(gòu)。隨后應(yīng)用有效組分進(jìn)行細(xì)胞水平的機制研究。分別應(yīng)用小鼠的原代間充質(zhì)干細(xì)胞和造血干細(xì)胞，證明溫腎陽、滋腎陰顆粒中藥物有效組分蛇床子素（蛇床子）、女貞苷（女貞子）分別調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin通路，促進(jìn)OPG表達(dá)，抑制破骨細(xì)胞形成。同時，蛇床子素能夠刺激成骨細(xì)胞的分化[11,12]。

3 病證結(jié)合防治POP基礎(chǔ)實驗研究

滋腎陰顆粒和溫腎陽顆粒有效組分研究對闡述藥物在分子水平的作用具有重要意義。團隊?wèi)?yīng)用滋腎陰顆粒、溫腎陽顆粒有效組分建立了“中藥防治骨質(zhì)疏松癥體外篩選系統(tǒng)”以及“補腎益精中藥有效組分庫”。篩選出補腎益精中藥及有效組分骨碎補總黃酮、淫羊藿苷、補骨脂素、蛇床子素能夠顯著增加成骨細(xì)胞中骨發(fā)生形態(tài)蛋白的表達(dá)[13-18]。利用Wnt/β-Catenin、BMP2/4/7、OPG基因敲除小鼠和去卵巢大鼠模型，建立了“補腎益精中藥防治骨質(zhì)疏松癥體內(nèi)篩選系統(tǒng)”。證明了溫腎陽、滋腎陰顆粒及其有效組分[13-18]，如骨碎補總黃酮、淫羊藿苷、補骨脂素、蛇床子素、齊墩果酸能夠促進(jìn)骨生成，增加骨量。另一個方面，通過抑制骨吸收而抑制骨丟失。

基礎(chǔ)實驗研究上，通過選擇典型的信號途徑為研究切入點，闡明補滋腎陰顆粒和溫腎陽顆粒調(diào)控骨代謝的分子機制。滋腎陰顆粒和溫腎陽顆粒中藥及有效組分通過系統(tǒng)調(diào)控Wnt/β-Catenin和RANKL/RANK/OPG信號通路的表達(dá)，分別調(diào)控骨生成和骨吸收的平衡，發(fā)揮“系統(tǒng)調(diào)節(jié)骨代謝平衡”的作用。具體而言，明確了溫腎陽顆粒和滋腎陰顆粒通過上調(diào)Wnt/β-Catenin信號通路，促進(jìn)骨髓間充干細(xì)胞成骨分化，促進(jìn)骨生成；同時，可以間接調(diào)節(jié)RANKL/RANK/OPG信號軸活性從而調(diào)控造血干細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化，抑制骨吸收[13-17]，其中淫羊藿苷、骨碎補總黃酮上調(diào)β-Catenin信號通路，補骨脂素上調(diào)BMP信號通路。蛇床子素上調(diào)成骨細(xì)胞中β-Catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制RANK相關(guān)信號通路的活性[18]。

圖1 “病證結(jié)合、調(diào)和腎陰腎陽”理論指導(dǎo)下滋腎顆粒和溫腎陽顆粒防治原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的新藥創(chuàng)制流程

4 溫腎陽、滋腎陰顆粒防治POP的系統(tǒng)調(diào)控作用

滋腎陰顆粒、溫腎陽顆粒分別體現(xiàn)補腎益精法中“陽中求陰”和“陰中求陽”的法則，其作用體現(xiàn)出陰陽并調(diào)的生理作用。具體而言，在骨骼系統(tǒng)，分別刺激骨生成和抑制骨吸收；在細(xì)胞水平[19]，分別發(fā)揮刺激成骨細(xì)胞的分化和功能，另外系統(tǒng)調(diào)控作用是抑制破骨細(xì)胞的功能；整體而言，其機制類似于恢復(fù)人體的陰陽動態(tài)的平衡；對于POP患者而言，就是在骨重建內(nèi)恢復(fù)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的平衡[10]。

在刺激成骨細(xì)胞分化的骨生成方面，滋腎陰顆粒和溫腎陽顆粒能夠刺激對間充干細(xì)胞誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞的分化，其分子機制與其能夠調(diào)控Notch信號途徑的表達(dá)有關(guān)[20]。分別調(diào)控間骨髓充質(zhì)干細(xì)向成骨細(xì)胞的分化，同時促進(jìn)去分泌骨生成相關(guān)因子的表達(dá)。滋腎陰顆粒和溫腎陽顆粒對破骨細(xì)胞的調(diào)控主要體現(xiàn)在3個方面：其一，補腎中藥調(diào)控破骨細(xì)胞的分化和生成；其二，補腎中藥能夠抑制破骨細(xì)胞的骨吸收功能；其三，補腎中藥能夠維持骨吸收和骨生成之間的平衡，維持骨穩(wěn)態(tài)。綜合目前研究發(fā)現(xiàn)，滋腎陰顆粒、溫腎陽顆粒能夠調(diào)控骨生成和骨吸收之間的平衡，臨床治療能夠增加POP患者的骨密度和改善患者癥狀。

5 討論

滋腎陰顆粒、溫腎陽顆粒的藥物研制是中醫(yī)基礎(chǔ)理論、辨證論治、臨床流行病學(xué)和分子生物學(xué)等學(xué)科綜合努力的成果，體現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)思想。兩者的開發(fā)分別從中辨證論治和病癥結(jié)合指導(dǎo)，從臨床流行病學(xué)調(diào)查、辨證論治、臨床RCT驗證、疾病動物模型、藥對研究驗證和有效組分分子機制研究。研究模型涉及臨床患者（中醫(yī)理論指導(dǎo)）、動物模型、骨骼系統(tǒng)、多能干細(xì)胞、骨細(xì)胞等水平，全面驗證藥物的作用機制，是臨床與基礎(chǔ)研究比較成功的研究案例（見圖1）。綜合前期研究，滋腎陰顆粒、溫腎陽顆粒的開發(fā)從四個方面的進(jìn)行闡述：病證結(jié)合防治POP分子流行病學(xué)規(guī)律；病證結(jié)合防治POP臨床試驗研究驗證；病證結(jié)合防治POP基礎(chǔ)實驗研究機制病證結(jié)合防治POP；中醫(yī)理論綜合分析。其研究的優(yōu)勢在于將中醫(yī)理論和臨床結(jié)合起來，發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥治療POP的系統(tǒng)調(diào)控作用。在揭示滋腎陰顆粒、溫腎陽顆粒治療POP機制的同時，也闡明中醫(yī)藥系統(tǒng)調(diào)控骨骼系統(tǒng)的特征。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為人體的陰陽平衡是維持健康的因素，中醫(yī)藥作用于人體的機制在于恢復(fù)人體的穩(wěn)態(tài)。促使人體亢奮的功能得到抑制，而低下的更能得到提升。對于POP而言，破骨細(xì)胞主導(dǎo)的骨吸收超過成骨細(xì)胞所主導(dǎo)的骨生成是其基本病理改變[20]。因此，藥物能夠抑制骨吸收或者刺激骨生成均能夠用來治療POP[22,23]。目前為止，臨床的藥物大多抑制骨吸收或者刺激骨生成，而能夠同時調(diào)控骨吸收和骨生成的藥物相對缺少。按照POP的基本病理改變，滋腎陰顆粒、溫腎陽顆粒能夠發(fā)揮系統(tǒng)調(diào)控的作用，既能夠增加骨生成，也能夠抑制骨吸收，理論而言能夠增強臨床治療POP的效果；另外滋腎陰顆粒、溫腎陽顆粒的優(yōu)勢是降低副作用，因為大多數(shù)通過抑制骨吸收治療POP的藥物存在各種各樣的副作用[24,25]。因此，滋腎陰顆粒、溫腎陽顆粒治療POP的優(yōu)勢在于系統(tǒng)調(diào)控，同時其優(yōu)勢在于副作用較小。

但是，滋腎陰顆粒、溫腎陽顆粒藥物研究還需要解決下面的問題：一、溫腎陽和滋腎陰顆粒均能夠治療POP，兩者存在共同之處，但是兩者有無差別？差別體現(xiàn)在何處？二、溫腎陽和滋腎陰顆粒均能夠刺激骨生成、抑制骨吸收，發(fā)揮系統(tǒng)調(diào)控作用，但是兩者差異能否在刺激骨生成、抑制骨吸收的體現(xiàn)出來？為何中醫(yī)又強調(diào)滋腎陰和溫腎陽的區(qū)別？三、兩者對成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞作用有無差異？這能否是溫腎陽和滋腎陰差異的物質(zhì)基礎(chǔ)？雖然，前期研究我們發(fā)現(xiàn)溫腎陽顆粒改善POP患者癥狀突出，如疼痛和生活質(zhì)量。而滋腎陰顆粒延緩骨丟失癥狀明顯，如骨密度，但是這些區(qū)別是否真正的存在，還需要在未來的藥物機制研究、藥理學(xué)和臨床研究中加以驗證。因此，后續(xù)研究要尋找兩者的共同之處，同時要尋找兩者差異之處，并闡述其共性和個性的機制。

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