安徽 吳 浩

基因表達(dá)載體相關(guān)問題解讀及應(yīng)用

安徽 吳 浩

基因工程操作的核心是構(gòu)建基因表達(dá)載體，圍繞該表達(dá)載體的考題很突出，如2009年安徽卷T30、2014年天津卷T8、2015年江蘇卷T32。下面從不同角度對該表達(dá)載體進(jìn)行解讀。

1.基因表達(dá)載體的一般結(jié)構(gòu)及各部分功能

基因表達(dá)載體的一般結(jié)構(gòu)包括復(fù)制原點(diǎn)+目的基因（插入基因）+啟動子+終止子+標(biāo)記基因（抗生素抗性基因）等組成。

啟動子是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的首端。啟動子是復(fù)制原點(diǎn)附近的一段DNA，它和特定的物質(zhì)（如激素）作用后，通過一系列復(fù)雜的正反饋機(jī)制，激活復(fù)制原點(diǎn)（復(fù)制原點(diǎn)通常被某些酶結(jié)合而不易解旋）。

終止子位于基因的尾端，也是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA短片段；終止子相當(dāng)于一盞紅色信號燈，使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停止下來。

復(fù)制原點(diǎn)處的A和T特別多，相對氫鍵少，不穩(wěn)定，DNA容易解旋，因此易與引物結(jié)合，成為轉(zhuǎn)錄的起點(diǎn)或復(fù)制的起點(diǎn)。

抗生素抗性基因作為其標(biāo)記基因。標(biāo)記基因的作用是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來。標(biāo)記基因又稱報(bào)告基因，抗生素抗性基因是其中的一種。

【例1】 （2009年安徽卷T31，節(jié)選）某種野生植物有紫花和白花兩種表現(xiàn)型，已知紫花形成的生物化學(xué)途徑是：

A和a、B和b是分別位于兩對染色體上的等位基因，A對a、B對b為顯性?；蛐筒煌膬砂谆ㄖ仓觌s交，F(xiàn)1紫花∶白花=1∶1。若將F1紫花植株自交，所得F2植株中紫花∶白花=9∶7。

請回答：（5）紫花中的紫色物質(zhì)是一種天然的優(yōu)質(zhì)色素，但由于B基因表達(dá)的酶較少，紫色物質(zhì)含量較低。設(shè)想通過基因工程技術(shù)，采用重組的Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)移一段DNA進(jìn)入細(xì)胞并且整合到染色體上，以促進(jìn)B基因在花瓣細(xì)胞中的表達(dá)，提高紫色物質(zhì)含量。下圖是一個已插入外源DNA片段的重組Ti質(zhì)粒載體結(jié)構(gòu)模式圖，請?zhí)畛鰳?biāo)號所示結(jié)構(gòu)的名稱：

①__________②__________③__________

【解析】（5）依題意，標(biāo)號所示結(jié)構(gòu)的名稱：①是T-DNA，②是標(biāo)記基因，③是復(fù)制原點(diǎn)

【答案】（5）①T-DNA ②標(biāo)記基因 ③復(fù)制原點(diǎn)

2.基因表達(dá)載體中啟動子、終止子的來源及特點(diǎn)

（1）如果目的基因是從自然界中已有的物種中分離出來的，在構(gòu)建基因表達(dá)載體時，不需要在質(zhì)粒上目的基因的前后端接上特定的啟動子、終止子，因?yàn)槟康幕蛑幸押袉幼印⒔K止子。

（2）如果目的基因是通過人工方法合成的，或通過cDNA文庫獲得的，則目的基因是不含啟動子和終止子的。若只將基因的編碼序列導(dǎo)入受體生物中，目的基因沒有啟動子、終止子，是無法轉(zhuǎn)錄的，因此，在構(gòu)建基因表達(dá)載體時，需要在與質(zhì)粒結(jié)合之前，在目的基因的前后端接上特定的啟動子、終止子。

（3）特異性啟動子。組織特異啟動子又稱器官特異性啟動子。在這類啟動子調(diào)控下，基因往往只在某些特定的器官或組織部位表達(dá)，并表現(xiàn)出發(fā)育調(diào)節(jié)的特性。如乳房生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白時，使用的是該類基因。

【例2】（2012年安徽卷T31，節(jié)選）甲型血友病是由X染色體上的隱性基因?qū)е碌倪z傳?。℉對h為顯性）。圖1中兩個家系都有血友病發(fā)病史，Ⅲ2和Ⅲ3婚后生下一個性染色體組成是XXY的非血友病兒子（Ⅳ2），家系中的其他成員性染色體組成均正常。

圖1

（5）利用轉(zhuǎn)基因豬乳腺生物反應(yīng)器可生產(chǎn)F8。要使乳腺細(xì)胞合成F8，構(gòu)建表達(dá)載體時，必須將F8基因cDNA與豬乳腺蛋白基因的__________等調(diào)控組件重組在一起。F8基因cDNA可通過克隆篩選獲得，該cDNA比染色體上的F8基因短，原因是該cDNA沒有_________。

【解析】（5）要使乳腺細(xì)胞合成F8，構(gòu)建表達(dá)載體時，必須將F8基因cDNA與豬乳腺蛋白基因的啟動子和終止子等調(diào)控組件重組在一起。F8基因cDNA可通過克隆篩選獲得，該cDNA比染色體上的F8基因短，原因是該cDNA沒有內(nèi)含子。

【答案】（5）啟動子 內(nèi)含子

3.標(biāo)記基因是否為載體上固有結(jié)構(gòu)

作為運(yùn)載體必須具備以下幾個特點(diǎn)：能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存；具有多個限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接；具有某些標(biāo)記基因，便于進(jìn)行篩選。質(zhì)粒是基因工程最常用的運(yùn)載體，它存在于許多細(xì)菌以及酵母菌等生物中，是能夠自主復(fù)制的很小的環(huán)狀DNA分子。根據(jù)此分析可知：標(biāo)記基因是質(zhì)粒上固有的。但在實(shí)踐中由于構(gòu)建載體的目的不同，需要的標(biāo)記基因也會不同，有的標(biāo)記基因是需要另外加上的，如綠色熒光蛋白基因與目的基因做成融合基因，根據(jù)熒光蛋白的特性來確定目的基因表達(dá)的產(chǎn)物存在于細(xì)胞的什么部位。如2009年安徽高考和廣東理科基礎(chǔ)卷中都涉及“綠色熒光蛋白基因”。

【例3】（2009年安徽卷T4）2008年諾貝爾化學(xué)獎授予了“發(fā)現(xiàn)和發(fā)展了水母綠色熒光蛋白”的三位科學(xué)家。將綠色熒光蛋白基因的片段與目的基因連接起來組成一個融合基因，再將該融合基因轉(zhuǎn)入真核生物細(xì)胞內(nèi)，表達(dá)出的蛋白質(zhì)就會帶有綠色熒光。綠色熒光蛋白在該研究中的作用是 （ ）

A 追蹤目的基因在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制過程

B 追蹤目的基因插入到染色體上的位置

C 追蹤目的基因編碼的蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的分布

D 追蹤目的基因編碼的蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)

【解析】本題屬于信息給予題（或叫材料背景題），考查獲取信息、分析推理等能力。根據(jù)題干“將綠色熒光蛋白基因的片段與目的基因連接起來組成一個融合基因，再將該融合基因轉(zhuǎn)入真核生物細(xì)胞內(nèi)，表達(dá)出的蛋白質(zhì)就會帶有綠色熒光”這句話可知：綠色熒光蛋白基因不是目的基因，而是對目的基因進(jìn)行標(biāo)記。借助綠色熒光蛋白基因的表達(dá)來對目的基因表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行追蹤提示。

【答案】C

4.載體上標(biāo)記基因的標(biāo)記原理

載體上的標(biāo)記基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要轉(zhuǎn)入的受體細(xì)胞沒有抵抗相關(guān)抗生素的能力。當(dāng)含有抗生素抗性基因的載體進(jìn)入受體細(xì)胞后，抗性基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，使受體細(xì)胞能夠抵抗相應(yīng)抗生素，所以在受體細(xì)胞的培養(yǎng)體系中加入該種抗生素就可以只保留轉(zhuǎn)入載體的受體細(xì)胞。

【例4】（2016年全國卷ⅠT40，節(jié)選）某一質(zhì)粒載體如圖所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中會導(dǎo)致相應(yīng)的基因失活（Ampr表示氨芐青霉素抗性基因，Tetr表示四環(huán)素抗性基因）。有人將此質(zhì)粒載體用BamHⅠ酶切后，與用BamHⅠ酶切獲得的目的基因混合，加入DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，用得到的混合物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌，結(jié)果大腸桿菌有的未被轉(zhuǎn)化，有的被轉(zhuǎn)化。被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌有三種，分別是含有環(huán)狀目的基因、含有質(zhì)粒載體、含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌。回答下列問題：

（2）如果用含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，在上述四種大腸桿菌細(xì)胞中，未被轉(zhuǎn)化的和僅含有環(huán)狀目的基因的細(xì)胞是不能區(qū)分的，其原因是____________；并且____________和__________的細(xì)胞也是不能區(qū)分的，其原因是__________。在上述篩選的基礎(chǔ)上，若要篩選含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌的單菌落，還需使用含有是_________的固體培養(yǎng)基。

【解析】（2）依題意可知，目的基因插入后，導(dǎo)致四環(huán)素抗性基因（Tetr）失活，而氨芐青霉素抗性基因（Ampr）仍能行使正常功能。如果用含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，在上述四種大腸桿菌細(xì)胞中，未被轉(zhuǎn)化的和僅含有環(huán)狀目的基因的細(xì)胞，因二者均不含氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上都不能生長，所以是不能區(qū)分的；含有質(zhì)粒載體和含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的細(xì)胞，因二者都含氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上都能生長，因此也是不能區(qū)分的。在上述篩選的基礎(chǔ)上，若要篩選含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌的單菌落，還需使用含有四環(huán)素的固體培養(yǎng)基；因目的基因插入后，導(dǎo)致四環(huán)素抗性基因（Tetr）失活，含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌在該培養(yǎng)基中不能生長，而含有質(zhì)粒載體的則能正常生長。

【答案】（2）二者均不含氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上都不能生長 含有質(zhì)粒載體 含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒（或答含有重組質(zhì)粒） 二者都含氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上均能生長 四環(huán)素

（作者單位：安徽省靈璧縣靈璧一中）