韓瀠儀

摘 要：用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將特定的RUVBL2 siRNA序列轉(zhuǎn)染到真核細(xì)胞，并鑒定其在人肺纖維細(xì)胞（MRC5 SV）中的表達(dá)，以確保RUVBL2基因的knock-down效果。用Rad51和γ-H2AX的特異性抗體進(jìn)行免疫熒光染色，應(yīng)用熒光顯微鏡觀察計(jì)數(shù)Rad51和γ-H2AX foci的數(shù)量。Western blot法證實(shí)了siRNA以及轉(zhuǎn)染的效率，確定了RUVBL2基因的存在有利于誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂（DSB）條件下Rad51和γ-H2AX被招募到DNA損傷位點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：RUVBL2 siRNA RAD51 γ-H2AX foci

中圖分類號(hào)：R113 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-3791（2017）01（b）-0200-03

在細(xì)胞生命活動(dòng)過(guò)程中，基因組DNA常會(huì)受到內(nèi)源和外源因子的攻擊而發(fā)生不同類型的損傷。其中，對(duì)細(xì)胞最具傷害性的損傷是DNA雙鏈斷裂（double-strand break， DSB）。大分子蛋白復(fù)合體INO80就直接參與了DSB修復(fù)過(guò)程[1]。RUVBL蛋白是INO80復(fù)合體的一類重要亞基。RUVBL1（RuvB-like 1）和RUVBL2（RuvB-like 2）同屬于ATPases（AAA+ ATPase）家族成員，是細(xì)菌DNA 解旋酶RuvB蛋白在哺乳動(dòng)物中的同源蛋白[2]。

同源重組是DSB修復(fù)的一種重要修復(fù)方式，RAD51是一種重要的重組蛋白，主要尋找同源DNA的模板并且?guī)椭趽p傷DNA與未損傷DNA修復(fù)模板之間產(chǎn)生聯(lián)系[3]。在酵母中，INO80復(fù)合體在染色體修飾和染色體重組過(guò)程中會(huì)將RAD51蛋白招募到DNA損傷位點(diǎn)[4]，而在哺乳動(dòng)物細(xì)胞里INO80復(fù)合體也會(huì)在染色體修飾和染色體重組過(guò)程中將RAD51招募到了DNA損傷位點(diǎn)[5]。哺乳動(dòng)物INO80復(fù)合體通過(guò)DNA末端切除的作用介導(dǎo)了DSB的修復(fù)[6]。RUVBL蛋白的缺失會(huì)影響RAD51被招募到DNA雙鏈斷裂位點(diǎn)，從而影響到后續(xù)進(jìn)行的DNA末端切除修復(fù)[7]。小鼠和人體細(xì)胞內(nèi)，在含有RUVBL蛋白的TIP60復(fù)合體缺失或者活性降低的情況下，RAD51被招募至DNA雙鏈斷裂損傷位點(diǎn)的進(jìn)程也會(huì)被削弱[8]。也就是說(shuō)RUVBL蛋白在DNA損傷修復(fù)過(guò)程，尤其是末端切除修復(fù)中有著不可替代的作用。細(xì)胞在電離輻射等因素作用下直接誘導(dǎo)形成的DSB可誘導(dǎo)H2AX磷酸化成γ-H2AX，γ-H2AX是DNA 雙鏈斷裂的一個(gè)標(biāo)志[9]。細(xì)胞在受到DNA損傷后，尤其是DNA雙鏈斷裂后，在斷裂位點(diǎn)會(huì)出現(xiàn)由γ-H2AX形成的焦點(diǎn)。γ-H2AX對(duì)于其他蛋白募集到焦點(diǎn)起著非常關(guān)鍵的作用[10]。INO80復(fù)合體通過(guò)與γ-H2AX相互作用而使得INO80被招募到DNA雙鏈斷裂處[11]。在人類細(xì)胞中，RUVBL就參與了與γ-H2AX的相互作用[12]。由此可以推測(cè)RUVBL蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞DNA損傷修復(fù)的過(guò)程中有著重要的作用。

RUVBL1作為INO80的亞基之一，在DSB修復(fù)過(guò)程中起到了重要的作用，主要體現(xiàn)在誘導(dǎo)H2AX磷酸化變成γ-H2AX，然后將Rad51修復(fù)蛋白招募至DSB位點(diǎn)[13]。由于RUVBL2和RUVBL1的同源性，我們猜測(cè)RUVBL2和RUVBL1也有相似的作用。為了探究RUVBL2是否也參與了DSB的修復(fù)，在人類細(xì)胞里用siRNA的方法降低RUVBL2蛋白表達(dá)，X射線處理誘導(dǎo)DSB的形成，探索在此種情況下Rad51和γ-H2AXfoci的形成是否會(huì)受到RUVBL2蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人胚肺成纖維細(xì)胞MRC5 SV細(xì)胞系為本實(shí)驗(yàn)室保存，脂質(zhì)體Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen公司，DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Nissui公司，新生胎牛血清購(gòu)自Biological Industries公司，兔抗RUVBL2（EPR4146）抗體購(gòu)自Abcam 公司，HRP 標(biāo)記山羊抗兔IgG（474-1516）購(gòu)自KPL公司，β-Tubulin抗體（T8328）購(gòu)自 Sigma公司，HRP標(biāo)記抗鼠IgG （sc-2005）購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology公司，ECL 發(fā)光試劑盒購(gòu)自Promega公司，DAPI細(xì)胞核熒光染劑購(gòu)自WAKO公司，RAD51抗體（70-002）購(gòu)自Bio Academia公司，γ-H2AX 抗體（05-636）購(gòu)自MILLIPORE公司，鼠抗（Alexa Fluor 546）購(gòu)自Invitrogen公司，兔抗（Alexa Fluor 488）購(gòu)自Invitrogen公司，熒光封閉劑購(gòu)自DAKO公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人肺纖維細(xì)胞MRC5-SV細(xì)胞系用于進(jìn)行RUVBL2 knock-down的實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞系培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基，內(nèi)含有10% 胎牛血清，L-谷氨酰胺（584μg/mL）和卡那霉素（20 μg/mL）。細(xì)胞放置37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 siRNA

MRC5-SV細(xì)胞培養(yǎng)于直徑為10 cm的培養(yǎng)皿中，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到約50%左右，用Lipofectamine 2000（Invitrogen）轉(zhuǎn)染試劑將RUVBL2 siRNA （2～30 nM） 轉(zhuǎn)入細(xì)胞。1 d以后將細(xì)胞分裝成4盤，3d以后收集細(xì)胞檢測(cè)蛋白。siRNA序列為5-gctccacgcagtacatgaaggagta-3。

1.2.3 Western blot分析

細(xì)胞培養(yǎng)5 d后收集細(xì)胞，低溫RIPA 緩沖液（25 mM Tris-HCl （pH 7.6），150 mM，NaCl，1% NP-40，1% sodium deoxycholate和0.1% SDS） 重懸細(xì)胞，補(bǔ)充1 mM PMSF 放置10min， 渦旋震蕩2次，2 s/次，4°C，22，000 ×g離心20 min，取上清。蛋白濃度的測(cè)定用BCA protein assay kit （Pierce）。蛋白樣品上樣至7.5%SDS聚丙烯酰氨凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜儀Trans-Blot Turbotransfer system （BIO-RAD）的作用下蛋白被轉(zhuǎn)移至PDVF 膜。TBST（20 mM Tris-HCl（pH 7.6），150 mM NaCl和0.1% Tween 20）清洗PDVF膜。 用含有1% BSA 的TBST封閉PDVF膜，封閉后用TBST清洗。加入RUVBL2抗體（1：5000稀釋），4 ℃ 過(guò)夜； 次日用TBST洗3次，10 min/次；加入HRP 標(biāo)記的山羊抗兔二抗（KPL 474-1516， 1：5000稀釋），37 ℃，1 h； TBST 洗3 次，10 min/次。β-Tubulin作為對(duì)照蛋白，加入β-Tubulin抗體（1：5000稀釋），4 ℃過(guò)夜；次日用TBST洗3次，10 min/次； 加入HRP 標(biāo)記的抗鼠二抗（1：2000稀釋）。用ECL顯色，ChemiDoc XRS+ system（BIO-RAD）化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)中檢測(cè)雜交信號(hào)。目標(biāo)條帶密度將由Precision Plus Protein WesternC Standard（BIO-RAD）進(jìn)行計(jì)算。

1.2.4 foci免疫熒光染色

細(xì)胞需要培養(yǎng)于蓋玻片上：用鑷子將高溫滅菌后的蓋玻片（MATSUNAMI S2112 microslide glass）放進(jìn)直徑為10 cm的培養(yǎng)皿中，每片蓋玻片承載500 uL的細(xì)胞懸液（細(xì)胞懸液的濃度約為5×105個(gè)細(xì)胞/mL）。細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)30 min，細(xì)胞于蓋玻片附著穩(wěn)定后，加入10 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。24 h后，真空泵吸除細(xì)胞培養(yǎng)基，10 mPBS清洗兩次。將蓋玻片浸泡于冰甲醇里，冰箱放置20 min，取出蓋玻片，移除殘留甲醇后，在冰丙酮里浸泡7 s后迅速取出干燥。加入300 uL封閉液封閉蓋玻片，室溫反應(yīng)20 min。加入150 uL γ-H2AX/ RAD51抗體（10%BSA 15μL，γ-H2AX 1：150，RAD51 1：400稀釋于PBS），4 ℃過(guò)夜；次日用PBS 洗3次，10 min/次；加入二抗150 uL（10%BSA 15μL，抗鼠二抗1：500，抗兔二抗1：1000稀釋于PBS），37 ℃，1 h；PBS 洗3次，10 min/次。將蓋玻片放入有0.05% tween20%PBS 的罐子里避光放置5 min。取出蓋玻片吸干PBS。將100 uL細(xì)胞核染液（DAKO：DAPI=1：500）均勻夾在固定有細(xì)胞的蓋玻片上。將蓋玻片放置在載玻片上，用指甲油封住邊緣處。最后用熒光顯微鏡（Olympus FluoView）進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 siRNA效果檢測(cè)

siRNA序列作用于RUVBL2 mRNA。siRNA被轉(zhuǎn)染進(jìn)入MRC5-SV細(xì)胞， 用Western blot分析法分析了轉(zhuǎn)染3 d后siRNA對(duì)RUVBL2 knock-down的效果。最適knock-down濃度為10 nM siRUVBL2，如圖1所示。

2.2 RUVBL2knock-down對(duì)γ-H2AX的影響

如圖2所示，沒有抑制RUVBL2蛋白表達(dá)時(shí)，經(jīng)X射線照射誘導(dǎo)了DSB形成后，γ-H2AX的foci數(shù)量很多，但是抑制了RUVBL2蛋白的表達(dá)，再經(jīng)X射線處理，γ-H2AX foci數(shù)量明顯要比RUVBL2表達(dá)沒有被抑制時(shí)的γ-H2AX的foci數(shù)量要少，這說(shuō)明RUVBL2有可能參與；了DSB誘導(dǎo)γ-H2AX的形成。

2.3 RUVBL2的knock-down對(duì)RAD51 foci的影響

沒有抑制RUVBL2蛋白表達(dá)時(shí)，經(jīng)X射線照射誘導(dǎo)了DSB的形成，RAD51的foci數(shù)量很多，但是抑制了RUVBL2蛋白的表達(dá)，再經(jīng)X射線處理，RAD51 foci數(shù)量明顯要比沒有被knock-down的細(xì)胞RAD51的foci數(shù)量要少（圖3），這說(shuō)明siRUVBL2影響了RAD51被招募到細(xì)胞核，間接說(shuō)明RUVBL2參與了將RAD51招募到DSB損傷位點(diǎn)處的作用。

3 結(jié)論

從熒光免疫的實(shí)驗(yàn)來(lái)看，我們可以說(shuō)RAD51和γ-H2AX的foci是受到了RUVBL2 knock-down的影響。對(duì)于對(duì)照處理細(xì)胞來(lái)說(shuō)，10Gy X射線處理過(guò)的細(xì)胞里RAD51和γ-H2AX的foci數(shù)量明顯要比沒有被射線照射的細(xì)胞多。由此我們可以初步得出以下結(jié)論：RUVBL2參與了招募RAD51至損傷位點(diǎn)的進(jìn)程，一旦RUVBL2缺失，將會(huì)阻礙DNA損傷觸發(fā)細(xì)胞周期中的信號(hào)傳導(dǎo)等一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，阻礙RAD51被招募到DNA損傷位點(diǎn)。

因此，這個(gè)結(jié)果揭示了抑制RUVBL2的表達(dá)會(huì)影響DSB誘發(fā)的RAD51分配失調(diào)進(jìn)而阻礙DNA損傷修復(fù)應(yīng)答的進(jìn)程。

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