潘同斌，葉雷雷，夏素文，朱 超，仝昕煒，汪亞如

力竭運(yùn)動(dòng)及鈍挫傷對(duì)大鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞激活及AXIN/GSK-3β含量的影響

潘同斌1，葉雷雷2，夏素文1，朱 超1，仝昕煒1，汪亞如1

目的：研究力竭運(yùn)動(dòng)及鈍挫傷對(duì)大鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞激活及AXIN/GSK-3β含量的影響。方法：取7周齡雄性SD大鼠24只，分為4組，每組6只：對(duì)照組(Control ,C)；力竭運(yùn)動(dòng)即刻組(Exhaustive，E0)；力竭運(yùn)動(dòng)后24h組(E24)；力竭運(yùn)動(dòng)后48h組(E48)。另取18只SD大鼠，分為3組，每組6只：鈍挫傷即刻組(contusion，DO)；鈍挫傷后24h組(D24)；鈍挫傷后48h組(D48)。各組分別于安靜狀態(tài)、力竭運(yùn)動(dòng)后和鈍挫傷后不同時(shí)間點(diǎn)，宰殺取血，分離血清。并取左側(cè)股四頭肌，一分為二，一份立即進(jìn)行衛(wèi)星細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，另一份樣本液氮保存，測(cè)定Axin、GSK-3β含量的變化。另取乳鼠3只，亦取股四頭肌進(jìn)行衛(wèi)星細(xì)胞培養(yǎng)。結(jié)果：(1)體外培養(yǎng)結(jié)果顯示：通過分離消化大鼠肌肉組織,可在體外培養(yǎng)獲得高純度具有成肌能力的肌衛(wèi)星細(xì)胞。培養(yǎng)初期,新生鼠1天后即可見到梭形衛(wèi)星細(xì)胞，其它各組的肌衛(wèi)星細(xì)胞增長(zhǎng)速度較慢，到第3天、第5天時(shí)各組開始大量增殖梭形細(xì)胞，且一直保持良好的增殖、傳代，第13天仍長(zhǎng)勢(shì)良好，可見部分融合和微管。各組比較可見，安靜對(duì)照組骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量最少,增殖速度最慢；新生鼠細(xì)胞數(shù)量最高,增殖速度也最快；而鈍挫傷組的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量及增殖速度明顯高于力竭運(yùn)動(dòng)組。(2)ELISA結(jié)果顯示：與安靜對(duì)照組相比，力竭運(yùn)動(dòng)各組、鈍挫傷各組骨骼肌和血清中的GSK-3β、Axin含量均明顯下降(P<0.01)，但力竭運(yùn)動(dòng)各組(E0、E24、E48)之間和鈍挫傷各組(D0、D24、D48)之間無顯著差異(P>0.05)。結(jié)論：(1)力竭運(yùn)動(dòng)及鈍挫傷可使肌衛(wèi)星細(xì)胞激活、增殖分化，并且鈍挫傷組的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞激活數(shù)量明顯多于力竭運(yùn)動(dòng)組，可能由于鈍挫傷的刺激更強(qiáng)所致。(2)力竭運(yùn)動(dòng)、鈍挫傷可以下調(diào)AXIN、GSK-3β的含量，可能在激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路及骨骼肌損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用。

力竭運(yùn)動(dòng)；鈍挫傷；肌衛(wèi)星細(xì)胞；軸蛋白；糖原合成酶激酶

骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞是肌組織的前體細(xì)胞,位于肌纖維的肌膜與基底膜之間,它在骨骼肌的生長(zhǎng)、發(fā)育、損傷及修復(fù)過程中擔(dān)任重要的作用[1-2]。Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)信號(hào)通路是調(diào)控衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化和肌纖維類型形成的重要信號(hào)通路，通過激活或抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路能夠調(diào)控衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化[3]。軸蛋白Axin是一種體軸發(fā)育抑制因子,作為構(gòu)架蛋白在Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起關(guān)鍵作用,它通過不同的機(jī)制調(diào)節(jié)β連環(huán)蛋白(β-catenin)的磷酸化和穩(wěn)定性。作為一個(gè)腫瘤抑制因子,Axin在多種腫瘤中表達(dá)減少,是Wnt信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控因子[4]。GSK-3β是一種在所有的真核生物中存在的多功能絲氨酸/蘇氨酸激酶,是調(diào)控眾多信號(hào)通路的關(guān)鍵因素,包括細(xì)胞對(duì)Wnt、酪氨酸激酶受體、G蛋白偶聯(lián)受體的作用，以及調(diào)節(jié)從糖原代謝到細(xì)胞循環(huán)和細(xì)胞增殖的進(jìn)程[5]。

離心力竭運(yùn)動(dòng)引起骨骼肌微損傷已為許多報(bào)道及本研究室前期研究所證實(shí)[6]，鈍挫傷作為顯著的損傷模型，其研究機(jī)制亦有相關(guān)研究涉及[7]，但二者的同步比較還未見報(bào)道。本文通過建立大鼠力竭、鈍挫傷兩種模型,旨在比較研究在不同模型下的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞激活及體外培養(yǎng)情況,以及Axin 、GSK-3β在損傷修復(fù)過程中的含量變化，初步比較觀察不同損傷程度的體內(nèi)外變化差異。 關(guān)于Wnt/β-catenin信號(hào)通路與肌衛(wèi)星細(xì)胞之間的關(guān)系，已有較多研究，本文利用前人的文獻(xiàn)，重點(diǎn)測(cè)定其上游因子Axin 、GSK-3β，初步探索Axin 、GSK-3β與Wnt/β-catenin信號(hào)通路及肌衛(wèi)星細(xì)胞之間的關(guān)系及可能機(jī)制,為骨骼肌損傷修復(fù)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物分組與取材

選用7周齡清潔級(jí)雄性SD大鼠24只，由江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,許可證號(hào)：SCXK(蘇)2013-0011。隨機(jī)分為4組，每組6只，即：對(duì)照組(Control ,C)；力竭運(yùn)動(dòng)即刻組(Exhaustive，E0)；力竭運(yùn)動(dòng)后24h組(E24)；力竭運(yùn)動(dòng)后48h組(E48)。另取18只SD大鼠，分為3組，每組6只：鈍挫傷即刻組(contusion，DO)；鈍挫傷后24h組(D24)；鈍挫傷后48h組(D48)。對(duì)照組、力竭運(yùn)動(dòng)組、鈍挫傷組分別于安靜狀態(tài)、力竭運(yùn)動(dòng)后和鈍挫傷后不同時(shí)間點(diǎn)，宰殺取血，分離血清。并取左側(cè)股四頭肌，一分為二，一份立即進(jìn)行衛(wèi)星細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，另一份樣本液氮保存，測(cè)定Axin、GSK-3β含量的變化。另取乳鼠3只，亦取股四頭肌進(jìn)行衛(wèi)星細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。

1.2 力竭運(yùn)動(dòng)模型

運(yùn)動(dòng)組動(dòng)物均進(jìn)行一次性力竭離心運(yùn)動(dòng)(持續(xù)下坡跑)，依次進(jìn)行第I級(jí)負(fù)荷(0°，8.2m/min)15min(相當(dāng)于53%VO2max)、第II級(jí)負(fù)荷(-5°，15m/min)15min(相當(dāng)于64%VO2max)、第III級(jí)負(fù)荷(-10°，19.3m/min)(相當(dāng)于76%VO2max)直至力竭。力竭標(biāo)準(zhǔn)：大鼠已不能使用后肢的蹬力讓自己跑動(dòng)前進(jìn)而伏地,無法跟上跑臺(tái)速度總是滯留于跑臺(tái)的后端,而毛刷、聲、光、電刺激尾部均無效或人為驅(qū)趕都無法刺激使大鼠繼續(xù)運(yùn)動(dòng),此為達(dá)到了力竭。

1.3 鈍挫傷模型

自制重物下砸儀,為一金屬圓柱體,質(zhì)量為200g。底面面積為2.25 cm2,下降高度為36cm,動(dòng)能為0.7J。將大鼠左后肢置于伸膝、踝背屈90位置,以2s的間隔連續(xù)擊打5次。經(jīng)解剖發(fā)現(xiàn)，局部出現(xiàn)腫脹和輕度瘀血，證實(shí)了肌肉鈍挫傷模型建模的成功率為100%。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)試劑及儀器

培養(yǎng)基(Gibco公司產(chǎn)品)：高糖DMEM培養(yǎng)基占78%；胎牛血清占10%；青/鏈霉素占2%；標(biāo)準(zhǔn)馬血清占10%。主要儀器：光學(xué)倒置顯微鏡，日本OLYMPUS公司；NikonE600顯微照相圖像采集系統(tǒng)，日本尼康；CO2恒溫培養(yǎng)箱，賽默飛世爾(Thermo)科技公司。

1.5 大鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的分離與培養(yǎng)方法

(1)用眼科剪刀在有少量含2%雙抗的hanks液中將組織剪成1mm3大小的肉糜，緩慢將hanks倒掉。(2)加入少量消化酶(0.25%胰蛋白酶)至組織沉淀，洗滌后倒掉液體，留下沉淀。(3)加入5ml左右0.25%胰蛋白酶溶液，震蕩后迅速移至離心管中，放入37℃水浴箱中，消化50～60min。(4)依次用200目、400目的篩網(wǎng)過濾，濾液收集后用2000r/min速度離心10min，取沉淀加入適量培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。(5)隔60min差速貼壁1次，共兩次。將第2次貼壁的培養(yǎng)瓶加入新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)。以后每隔24h更換培養(yǎng)基，并用倒置顯微鏡進(jìn)行觀察，拍攝圖像及分析。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)：測(cè)定骨骼肌及血清中Axin、GSK-3β含量

Axin、GSK-3β的 ELISA試劑盒均購(gòu)自上海博谷生物有限公司。采用美國(guó)ELX800型酶標(biāo)儀，嚴(yán)格按照試劑盒說明操作，所有樣本采用平行管測(cè)定?？捡R斯亮蘭法進(jìn)行定氮。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

全部數(shù)據(jù)用Microsoft Excel處理，計(jì)算平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析用SPSS 21.0軟件系統(tǒng)完成，采用One-way ANOVA程序進(jìn)行單因素方差分析,P<0.05為具有顯著性差異。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 力竭運(yùn)動(dòng)組、鈍挫傷組及新生鼠不同時(shí)期衛(wèi)星細(xì)胞的體外培養(yǎng)結(jié)果

2.1.1 各組培養(yǎng)1天后骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞生長(zhǎng)狀況

當(dāng)各組大鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞培養(yǎng)1d時(shí)，對(duì)照組中未見梭形及圓形細(xì)胞，力竭運(yùn)動(dòng)各組、鈍挫傷各組中未見梭形細(xì)胞，但可見其中含有少許的圓形細(xì)胞，新生鼠組可見少量的梭形肌衛(wèi)星細(xì)胞。

2.1.2 各組培養(yǎng)3天及5天后骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞生長(zhǎng)狀況

各組骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞培養(yǎng)3d及5d時(shí)(見圖1)，除安靜對(duì)照組外，均可見梭形骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞。新生鼠的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量明顯多于其它各組，而鈍挫傷組的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量明顯多于力竭運(yùn)動(dòng)組。力竭運(yùn)動(dòng)各組(E0、E24、E48)之間和鈍挫傷各組(D0、D24、D48)之間相比較，隨時(shí)間延長(zhǎng)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量呈遞增趨勢(shì)。

圖1 各組培養(yǎng)5天后骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞生長(zhǎng)狀況

2.1.3 各組培養(yǎng)第13天后骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞生長(zhǎng)狀況

圖2 各組培養(yǎng)第13天后骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞生長(zhǎng)狀況

圖2為骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞培養(yǎng)13天的圖片，除安靜對(duì)照組外，各組肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖達(dá)到高峰狀態(tài)，部分細(xì)胞之間開始出現(xiàn)融合現(xiàn)象，呈集落樣，折光性好，其排列開始出現(xiàn)方向性，呈平行排列或者放射狀分布，細(xì)胞體積增大，在細(xì)胞膨大處可見部分細(xì)胞融合成肌管。

2.2 力竭運(yùn)動(dòng)及鈍挫傷不同時(shí)期大鼠骨骼肌、血清中GSK-3β、AXIN含量變化

表1 力竭運(yùn)動(dòng)、鈍挫傷及恢復(fù)期間大鼠骨骼肌、血清中GSK-3β、AXIN含量變化

ELISA結(jié)果顯示(表1)：與安靜對(duì)照組相比，力竭運(yùn)動(dòng)各組、鈍挫傷各組骨骼肌和血清中的GSK-3β、Axin含量均明顯下降(P<0.01)，但力竭運(yùn)動(dòng)各組(E0、E24、E48)和鈍挫傷各組(D0、D24、D48)之間無顯著差異(P>0.05)。

3 討論

3．1 力竭運(yùn)動(dòng)、鈍挫傷對(duì)衛(wèi)星細(xì)胞的激活及體外培養(yǎng)增殖分化情況對(duì)比

骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞是位于肌膜和基底膜之間的一些單個(gè)核細(xì)胞,是一種具有一定自我更新能力以及某種程度定向分化的成體組織內(nèi)的干細(xì)胞[1],一般情況下保持不分裂、靜止?fàn)顟B(tài),但受到負(fù)重鍛煉、牽拉、創(chuàng)傷等刺激后,靜息的肌衛(wèi)星細(xì)胞激活,胞質(zhì)發(fā)生擴(kuò)張,體積增大,高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體和線粒體等細(xì)胞器變得清晰明顯時(shí),進(jìn)入分裂、增殖期，產(chǎn)生肌前體細(xì)胞,并進(jìn)一步分化、融合成肌管,再形成肌細(xì)胞的能力,如果用伽馬射線對(duì)其進(jìn)行破壞,就算再進(jìn)行抗阻訓(xùn)練,肌肉也不會(huì)再有所增長(zhǎng),因此肌肉受損傷,衛(wèi)星細(xì)胞激活是肌纖維修復(fù)及再生的前提,其增殖、分化也是肌細(xì)胞肥大、數(shù)目增多以及肌纖維轉(zhuǎn)化的重要機(jī)制[2，8]。

有研究表明,當(dāng)骨骼肌鈍挫傷后,其受損傷區(qū)域便會(huì)出現(xiàn)大量肌衛(wèi)星細(xì)胞的激活、增殖。于秋華等[7]通過建立鈍挫傷模型,使用免疫組化技術(shù)測(cè)定肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的表達(dá),在損傷后第1天,大鼠腓腸肌損傷組織中開始出現(xiàn)肌衛(wèi)星細(xì)胞,PCNA陽性核出現(xiàn)表達(dá)；直到損傷后第14天,受損組織中仍有肌衛(wèi)星細(xì)胞PCNA陽性核呈見。將培養(yǎng)成功并且經(jīng)過熒光標(biāo)記后的肌衛(wèi)星細(xì)胞移植入大鼠的鈍挫傷部位,在鈍挫傷部位修復(fù)后,出現(xiàn)帶有熒光的肌細(xì)胞核,并且移植的大鼠比未移植大鼠的鈍挫傷修復(fù)處的肌細(xì)胞排列更加緊密,說明肌衛(wèi)星細(xì)胞在骨骼肌鈍挫傷修復(fù)中有重要作用。

楊輝等[9]研究顯示，跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練與按摩聯(lián)合治療，能明顯提高骨骼肌急性損傷的組織中NADH還原酶蛋白量, 提高肌衛(wèi)星細(xì)胞中nNOS、HGF mRNA表達(dá)量,促進(jìn)炎癥的消退和肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖,提高骨骼肌急性損傷修復(fù)的速度。Coffey等[10]在力量訓(xùn)練10周的研究中發(fā)現(xiàn),被試者斜方肌中肌肉的橫截面積和衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)目均增加46%,肌細(xì)胞核的數(shù)量增加70%,這表明肌衛(wèi)星細(xì)胞可能通過增殖分化參與肌肉的肥大。Bickel等[11]對(duì)8位不常運(yùn)動(dòng)的健康男性進(jìn)行離心踢膝運(yùn)動(dòng)后發(fā)現(xiàn),4天后,肌衛(wèi)星細(xì)胞的數(shù)目明顯增加,而在對(duì)11名年老年男性進(jìn)行14周的耐力訓(xùn)練后發(fā)現(xiàn),股外側(cè)肌衛(wèi)星細(xì)胞的數(shù)目增加29%,這表明運(yùn)動(dòng)可以通過增加肌衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)目來維持老年人的肌肉質(zhì)量和體積,防止肌肉的萎縮。

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)組、鈍挫傷組及新生鼠組分別進(jìn)行骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞體外培養(yǎng)，結(jié)果顯示，不同模型刺激后的衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量和體外增殖速度也不同。當(dāng)各組大鼠骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞培養(yǎng)1d后，對(duì)照組中未見梭形及圓形細(xì)胞，力竭運(yùn)動(dòng)各組、鈍挫傷各組中未見梭形細(xì)胞，但可見其中含有少許的圓形細(xì)胞，還未明顯激活；新生鼠組可見少量的梭形肌衛(wèi)星細(xì)胞。各組骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞培養(yǎng)3d及5d時(shí)(見圖1)，除安靜對(duì)照組外，均可見梭形骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖。新生鼠的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量明顯多于其它各組，可見新生鼠肌衛(wèi)星細(xì)胞尚未進(jìn)入休眠狀態(tài)，活性最強(qiáng)，增殖、分化速度最快，有利于骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育。而鈍挫傷組的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量明顯多于力竭運(yùn)動(dòng)組，這是由于鈍挫傷對(duì)骨骼肌的損傷程度較重，亦能較強(qiáng)地刺激衛(wèi)星細(xì)胞的激活、增殖，促進(jìn)骨骼肌的損傷修復(fù)。此外，力竭運(yùn)動(dòng)各組(E0、E24、E48)之間和鈍挫傷各組(D0、D24、D48)之間相比較，隨時(shí)間延長(zhǎng)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量呈遞增趨勢(shì)，體現(xiàn)了衛(wèi)星細(xì)胞激活的時(shí)間效應(yīng)。關(guān)于衛(wèi)星細(xì)胞在體數(shù)量的變化，還有待進(jìn)一步研究。

3．2 GSK-3β、AXIN及其對(duì)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用

Axin是β-catenin降解復(fù)合體的重要成分之一[12], Axin可分為Axin1和Axin2, Axinl和Axin2均有a,b兩個(gè)亞型編碼,與APC,GSK3β和β-catenin都有相結(jié)合的區(qū)域。研究發(fā)現(xiàn)[4]，β-catenin是經(jīng)典Wnt 信號(hào)途徑的核心成分，wnt 信號(hào)通路激活可使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)β-catenin積累,并進(jìn)入核內(nèi)調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。在wnt 信號(hào)未激活狀態(tài)下,軸蛋白(Axin)、大腸腺瘤樣蛋白(APC)和糖原合成酶激酶(GSK-3β)形成的復(fù)合物使 GSK-3β磷酸化, GSK - 3β能將磷酸基團(tuán)加到β- catenin氨基端的絲氨酸/蘇氨酸殘基上,形成降解復(fù)合物，使β- catenin降解,并維持較低水平；當(dāng) Wnt激活，與 Frz受體結(jié)合后，跨膜與低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LDL-receptor-related protein，LRP)形成復(fù)合物,抑制 Axin、APC、GSK-3 形成的復(fù)合物,使β-catenin 脫磷酸化,當(dāng)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)游離的β-catenin積累到一定程度,繼而轉(zhuǎn)入核內(nèi),與 T細(xì)胞因子TCF/LEF結(jié)合，可促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。故Axin、GSK - 3β是Wnt /β-catenin信號(hào)通路的重要負(fù)性調(diào)節(jié)因子,在降解復(fù)合體中起關(guān)鍵作用[13]。

GSK-3a和GSK-3β都是β-catenin降解復(fù)合物的重要調(diào)節(jié)因子,它們可以磷酸化β-catenin的氨基末端的3個(gè)保守的絲氨酸和蘇氨酸殘基而使其降解。在細(xì)胞內(nèi)，β-catenin是GSK-3β的弱的酶作用物,GSK-3β不能直接地與其連接,GSK-3β需要與Axin和APC共同作用,來促進(jìn)與β-catenin的相互作用[14]。GsK-3a/β對(duì)β-catenin的磷酸化也需要CK1的作用,Axin本身也被GSK-3a/β磷酸化,并增加其穩(wěn)定性,共同形成降解復(fù)合體，使β-catenin降解。而未磷酸化的Axin與β-catenin的親和力降低,降低了β-catenin降解復(fù)合物形成的能力，使其積聚。當(dāng)人類GSK-3β失調(diào)時(shí),可引發(fā)眾多疾病,如糖尿病、阿爾茨海默病,雙相性精神失調(diào)和癌癥等[15]。

目前有關(guān)運(yùn)動(dòng)及鈍挫傷對(duì)Axin及GSK-3的影響研究較少。大都研究Axin與腫瘤的關(guān)系[16-17]，及GSK-3與代謝和糖尿病的關(guān)系[5]。作為一個(gè)腫瘤抑制因子,Axin在多種腫瘤中表達(dá)減少,是Wnt信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控因子,其異常變化與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。許紹哲等[18]探討了長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練上調(diào)骨骼肌糖原含量的可能分子機(jī)理。結(jié)果顯示，糖原合酶的磷酸化失活效應(yīng)是通過上游絲氨酸蘇氨酸激酶——GSK-3α和GSK-3β介導(dǎo)的。在胰島素的作用下， Akt磷酸化GSK-3α和GSK-3β，下調(diào) GSK-3 的活性，降低對(duì)糖原合酶的磷酸化作用并使其活化，使糖原合成增加。張飛鵬等[19]研究顯示，在去負(fù)荷條件下,PI3K/Akt/GSK-3β信號(hào)對(duì)骨骼肌蛋白分解影響較小;再負(fù)荷條件下,離心運(yùn)動(dòng)能加強(qiáng)PI3K/Akt/GSK-3β信號(hào)作用,參與骨骼肌蛋白合成。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ拖?，與安靜對(duì)照組相比，力竭運(yùn)動(dòng)各組、鈍挫傷各組骨骼肌和血清中的GSK-3β、Axin含量均明顯下降，作為負(fù)性調(diào)節(jié)因子，可能通過上調(diào)Wnt/β-catenin信號(hào)通路，而促進(jìn)衛(wèi)星細(xì)胞的增殖和骨骼肌的損傷修復(fù)。

3．3 Axin/GSK-3β/Wnt/β-catenin 信號(hào)通路對(duì)衛(wèi)星細(xì)胞及骨骼肌損傷修復(fù)的作用

Wnt信號(hào)是哺乳動(dòng)物骨骼肌形成中所必須的,是決定衛(wèi)星細(xì)胞定向分化及成肌細(xì)胞終末分化的關(guān)鍵調(diào)控因子[3，20]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路在早期體節(jié)形成和肌肉生成中充當(dāng)重要角色, Wnt/β-catenin信號(hào)是調(diào)控肌肉發(fā)育的重要通路，是調(diào)控肌肉肌細(xì)胞增殖和分化的關(guān)鍵。抑制骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中GSK-3β活性或者超表達(dá)Wnt10b均能抑制生脂基因表達(dá),可加強(qiáng)肌細(xì)胞分化潛能[21-23]。

研究發(fā)現(xiàn)[20，24]，Notch信號(hào)通路與經(jīng)典Wnt信號(hào)通路協(xié)同作用,調(diào)控衛(wèi)星細(xì)胞分化,而GSK3β作為兩條信號(hào)通路的平衡點(diǎn),發(fā)揮重要作用。當(dāng)Notch信號(hào)通路被激活時(shí),GSK3β持續(xù)表達(dá)；但Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制GSK-3β的活化。因此,GSK3β的表達(dá)不僅維持Notch信號(hào)通路及Wnt/β-catenin信號(hào)通路平衡,還在衛(wèi)星細(xì)胞定向分化過程中起重要作用。在成熟肌生成期間，Wnt 信號(hào)和 Notch 信號(hào)精確的時(shí)序調(diào)節(jié)在高效的肌肉修復(fù)中是必須的，Notch 信號(hào)促進(jìn)衛(wèi)星細(xì)胞的增殖，Wnt 信號(hào)確保終端差異分化 。在這個(gè)方案中GSK3 -β 控制細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的媒介，是細(xì)胞從一個(gè)通路到另一個(gè)通路的重要開關(guān) 。

GSK3β是Wnt /β-catenin信號(hào)通路的重要負(fù)性調(diào)節(jié)因子，Axin是降解復(fù)合體中的第二種關(guān)鍵成分，是wnt信號(hào)途徑中重要的負(fù)性調(diào)控因子,是β-catenin降解復(fù)合體的關(guān)鍵成分之一,具有多個(gè)蛋白-蛋白相互作用區(qū)域,在復(fù)合體內(nèi)起支架蛋白的作用,同時(shí)作為多種蛋白復(fù)合體的構(gòu)建基礎(chǔ)。Axin 使GSK3β靠攏β-catenin而促進(jìn)β-catenin被GSK-3β磷酸化，并促進(jìn)β-catenin 的降解。wnt/β-catenin 信號(hào)通路在衛(wèi)星細(xì)胞分化及肌纖維類型形成過程中具有重要作用。

總之，骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育和再生過程中,衛(wèi)星細(xì)胞發(fā)揮著至關(guān)重要的作用, Axin/GSK-3β/Wnt/β-catenin信號(hào)通路是調(diào)節(jié)這一過程的重要信號(hào)通路。本文通過建立大鼠力竭、鈍挫傷兩種模型,初步比較了在不同模型下的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞激活及體外培養(yǎng)情況,以及Axin 、GSK-3β在損傷修復(fù)過程中的含量變化，并對(duì)相關(guān)機(jī)理進(jìn)行了初步探討，后續(xù)研究可進(jìn)行多方面比較、拓展，必將為骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞在肌肉損傷修復(fù)中的作用及機(jī)制提供理論依據(jù),對(duì)肌肉疾病的診斷、治療和預(yù)后亦具有重要的理論及實(shí)際意義。

4 結(jié)論

(1)力竭運(yùn)動(dòng)及鈍挫傷可使肌衛(wèi)星細(xì)胞激活、增殖分化，且鈍挫傷組的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖數(shù)量明顯多于力竭運(yùn)動(dòng)組，可能由于鈍挫傷的刺激更強(qiáng)所致。

(2)力竭運(yùn)動(dòng)、鈍挫傷可以下調(diào)AXIN、GSK-3β的含量，可能在激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路及骨骼肌損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用。

5 展望

關(guān)于骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞激活及其在骨骼肌損傷修復(fù)中作用的研究是個(gè)重大課題，本文僅對(duì)不同損傷模型作一初步探索，今后有必要進(jìn)行體內(nèi)、體外的同步研究；隨著鑒定指標(biāo)和方法的進(jìn)步，此方面的研究必將向縱深發(fā)展，尤其是不同損傷模型對(duì)衛(wèi)星細(xì)胞的體內(nèi)、體外影響，及其分子機(jī)制，有著廣闊的研究前景。

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(編輯 孫君志)

The Effects of Exhaustive Exercise and Contusion on Satellite Cells Activation and AXIN/GSK-3 β Contents in Rat Skeletal Muscle

PAN Tongbin1，YE Leilei2，XIA Suwen1，ZHU Chao1，TONG Xinwei1，WANG Yaru1

Objective:To study the effects of exhaustive exercise and contusion on satellite cells activation and AXIN/GSK-3 β contents in ratskeletal muscle.Methods: 24 male SD rats (seven-week-old), were randomly divided into 4 groups with 6 in each group: control group (Control, C); immediately-after-exhaustive-exercise group (Exhaustive, E0); post-exhaustive exercise 24h group (E24); post-exhaustive exercise 48h group (E48). Another 18 SD rats were taken and randomly divided into 3 groups with 6 in each group: contusion immediate group (contusion, Do); post-contusion 24h group (D24); post-contusion 48h group (D48). All groups were killed respectively when at resting state and at different time points after exhaustive exercise and contusion respectively and the serum was extracted. The left quadriceps femoris was sampled and divided into two parts: one was used immediately for satellite cell culture experiment, and the other preserved in liquid nitrogen for measurement of AXIN and GSK-3β contents. The quadriceps femoris of another three neonatal rats were also takenfor satellite cell culture experiment. Results: (1) The results of culture in vitro showed that, by separating the rat muscle tissue of digestion, satellite cells with myogenic ability and high purity could be obtained in vitro. During the early stages of culture, a small amount of spindle satellite cells could be seen in the newborn rat the next day after culture, but the satellite cells of the other groups were growing slowly. On the third day and the fifth day, the spindle satellite cells of each group began to proliferate in quantity and reached the peaks. Then all the satellite cells had a good proliferation until 13th day after serial passage, and fusion and micro-tubuleswere observed in some of them. By comparing the results of each group, we concluded that the content of skeletal muscle satellite cell was lowest in control group，but highest in newborn rats. The proliferation rate was slowest in control group, but fastest in newborn rats.At the same time, the number and the proliferation rate of skeletal muscle satellite cells in contusion groups were significantly higher than that in the exhaustive exercise groups.(3) The results of Elisa showed that: The contents of AXIN, GSK-3β in skeletal muscle and serum of exhaustive groups and contusion groups, as compared with the control group, decreased significantly (P<0.01), but there was no significant difference between exhaustive groups(E0、E24、E48)and contusion groups(D0、D24、D48). Conclusions: (1) Exhaustive exercise and contusion can activate the skeletal muscle satellite cells and cause them to proliferate and differentiate. The number of skeletal muscle satellite cells activated in contusion groups was significantly larger than that in exhaustive groups. It may be caused by stronger stimulus of contusion. (3) The contents of AXIN, GSK-3β can be downregulated by exhaustive exercise and contusion, and may play an important role inactivating Wnt/beta-catenin signachannels and repairingskeletal muscle injury.

exhaustiveexercise;contusion;satellitecells;Axialprotein;glycogensynthasekinase-3β

G804.2 Document code：A Article ID：1001-9154(2017)02-0095-06

江蘇省高校自然科學(xué)研究面上項(xiàng)目"MG53蛋白在骨骼肌運(yùn)動(dòng)損傷修復(fù)中的作用及分子機(jī)制"(15KJD310001)。

潘同斌，教授，博士，研究方向：骨骼肌運(yùn)動(dòng)損傷的修復(fù)及分子機(jī)制。E-mail:panlichina@sina.com。

1.揚(yáng)州大學(xué)體育學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.南京體育學(xué)院訓(xùn)練處，江蘇 南京 210014 1.College of Physical Education，YangZhou University. Yangzhou；2.Training division,Nanjing Institute of Physical Education and Sports.Nanjing Jiangsu 210014

2016-09-02

2017-02-10

G804.2

A

1001-9154(2017)02-0095-06