石 磊, 汪一鳴, 胡婷華, 樊小力

高頻正弦波振動抑制廢用性肌萎縮的凋亡進程

石 磊1, 汪一鳴1, 胡婷華2, 樊小力3

目的：探討高頻正弦波振動(HFV)對骨骼肌在廢用狀態(tài)時細胞凋亡的對抗作用。方法：建立廢用動物模型，改進振動儀的關(guān)鍵技術(shù)，采用短時間歇式振動的方法，結(jié)合電鏡觀察、免疫組化染色法和TUNEL法檢測，觀察HFV對制動大鼠比目魚肌(SOL)濕重體重比、肌纖維橫截面積、肌纖維超微結(jié)構(gòu)的變化、Bcl-2和Bax的表達情況。結(jié)果：(1)制動后大鼠SOL濕重體重比為30.22±2.68,下降了36.43%。肌纖維的橫截面積為3789.56±95.14μm2,下降了37.77%。HFV組相對制動組的SOL濕重體重比及橫截面積均有所增加(P<0.05)；(2)電鏡可見制動后梭外肌病變明顯，核內(nèi)染色質(zhì)團塊狀凝集。梭內(nèi)肌部分肌膜溶解消失，細胞核變形。振動組的梭外肌Z線結(jié)構(gòu)比較清晰，梭內(nèi)肌纖維結(jié)構(gòu)未見明顯改變；(3)制動后大鼠SOL中Bcl-2陽性表達率為20%，明顯低于對照組的表達情況(P<0.05)。制動后Bax陽性表達率為80%，明顯高于對照組的表達情況(P<0.05)。制動后AI為20%，明顯高于對照組(P<0.05)。HFV組相對制動組的Bcl-2陽性表達率均有所增加，Bax陽性表達率以及AI有所降低(P<0.05)。結(jié)論：改進后的抗肌萎縮振動儀操作性較強，對制動大鼠廢用性肌萎縮的凋亡進程有抑制作用。

高頻正弦波振動；肌梭；廢用性肌萎縮；凋亡；骨骼肌

肢體制動、運動減退或是宇航飛行后，骨骼肌的質(zhì)量和生理功能會發(fā)生明顯的退行性改變，對人體的技能提高和運動壽命乃至日?；顒訒a(chǎn)生深遠的影響[1-2]。廢用性肌萎縮是多種因素共同作用的結(jié)果，學者針對不同的發(fā)生機制理論進行了諸多對抗措施的研究,部分研究己深入到細胞分子層次。目前主要的臨床干預措施有機械負荷訓練、藥物治療、電刺激、營養(yǎng)補充等，最近，冬眠的松鼠已經(jīng)被確定為研究抗萎縮的一種創(chuàng)新模式[3-9]。但由于缺乏在細胞和分子層面對誘發(fā)肌萎縮機制的統(tǒng)一認識，目前尚沒有權(quán)威的有效治療方法[10]。

細胞凋亡是一個主動的、高度有序的死亡過程，是機體生存和發(fā)育的基礎(chǔ)，凋亡信號相關(guān)途徑的改變會導致人類疾病[11-13]，在維持骨骼肌動態(tài)平衡中發(fā)揮重要作用。肌梭的傳入放電減少是廢用性肌萎縮發(fā)生的重要原因之一[14-17]。高頻正弦波振動(HFV)可以選擇性地興奮肌梭[18-19]，有對抗廢用性肌萎縮的作用，相對于上述治療方式，具有無痛易行的優(yōu)勢。通過Web of sicense和中國期刊網(wǎng)查閱發(fā)現(xiàn)，目前有關(guān)HFV對骨骼肌在廢用狀態(tài)時細胞凋亡的研究尚未見報道。

為此，我們以大鼠后肢伸長位制動為廢用動物模型，改進抗肌萎縮振動儀的關(guān)鍵技術(shù)，采用短時間歇式振動的方法，結(jié)合電鏡觀察、免疫組化染色法和TUNEL法檢測，觀察HFV對制動大鼠比目魚肌(SOL)濕重體重比、肌纖維橫截面積、超微結(jié)構(gòu)的變化、Bcl-2和Bax的表達情況，探討HFV對骨骼肌在廢用狀態(tài)時細胞凋亡的對抗作用，為尋找預防和治療廢用性肌萎縮的有效措施提供資料。

1 研究對象和方法

1.1 高頻正弦波振動的發(fā)生裝置

此次試驗所采用的抗肌萎縮振動儀有別于目前市場各種傳統(tǒng)的正弦機械振動發(fā)生裝置(用線圈在勻磁場中的振動代替?zhèn)鹘y(tǒng)意義上的機械振動)，技術(shù)關(guān)鍵是通過數(shù)字電路控制線圈電流的頻率和幅值(如圖1)。電流控制主要通過一個數(shù)字電路和一個模擬電路來實現(xiàn)：(1)數(shù)字電路主要用51單片機 STC12C5A60S2控制芯片AD9833BR產(chǎn)生標準的正弦電壓信號，旋鈕調(diào)頻和屏幕顯示(如圖2)；(2)模擬電路主要為一個簡易電流源和功率放大電路模塊，控制旋鈕調(diào)幅和提供振動所需功率。

圖1 系統(tǒng)原理框圖

圖2 單片機電路圖

1.2 實驗動物及分組

將健康雌性SD大鼠按體重配對原則分為5組(西安交大醫(yī)學院實驗動物中心提供，體重為230～240g，每組6只動物)：正常同步對照組(CON)，制動(IMM)14d組，制動+50Hz振動(IMM+50Hz HFV)14d 組，制動+100Hz振動(IMM+100Hz HFV)14d組，制動+200Hz振動(IMM+200Hz HFV)14d 組。實驗過程中對動物處置符合2006年科學技術(shù)部發(fā)布的《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》。

1.3 制動動物模型

應用傳統(tǒng)模型并加以改進：將大鼠進行腹腔麻醉,在大鼠左后肢的彎曲部位(神經(jīng)和血管較為密集且易受壓位置)墊以棉層，最終用石膏繃帶包扎動物后肢，將其固定在踝關(guān)節(jié)背伸(約45°)而膝關(guān)節(jié)伸展(約180°)位，使SOL處于伸長位。石膏繃帶包扎時注意暴露出振動位點(見圖3)。

圖3 振動位置圖

1.4 振動方法

在SOL肌腹部位采取短時多次的間歇式振動方法(高頻正弦波振動儀器為自屬專利產(chǎn)品)進行振動(50Hz、100Hz、200Hz，300um，14d)。每振動1min后間歇1min，重復4次后間歇2 min，此為1個振動周期，每回重復振動3個周期，每天進行4回振動。

1.5 檢測方法

將大鼠進行腹腔麻醉，稱體重后經(jīng)升主動脈行血管灌注固定。灌注后立即取出大鼠左下肢SOL，稱重并剪修肌肉(以100g體重標化計算SOL濕重體重比, MWW/BW)，電鏡樣品用戊二醛固定后交至西安交通大學電鏡中心，免疫組化樣品浸于多聚甲醛固定液(40 g/L，4℃)中過夜，以垂直位行石蠟包埋。

采用免疫組化檢測Bcl-2和Bax的表達情況(參照傳統(tǒng)ABC法進行免疫組化染色，anti-BCL-2，1:400；anti-BAX，1:200，Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA；陰性對照為PBS)。在顯微鏡下對10個隨機視野中陽性細胞計數(shù)，染色強度所得分數(shù)分級如下：0，無染色；1，弱表達染色；2，中度表達染色；3，強表達染色。陽性細胞的百分比所得分數(shù)分級如下： 1 ，<25%；2，26%-50%；3，51%-75%；4，>76%。將上述兩種評分值相加。根據(jù)總分值，樣本被分為4組：陰性組，被染色的細胞在總細胞數(shù)中≤5%, 0分; 低表達組(+), 1-3 分；中等表達組(++), 4-5分；高表達組(+++), 6-7分。在這些分組中，陰性和低表達組被判定為該蛋白陰性表達，中等和高表達組被判定為該蛋白陽性表達。最終計算出Bcl-2和Bax的陽性表達率。 采用Gavrieli建立的TUNEL法標記骨骼肌凋亡的細胞核，陽性細胞核呈棕黃色且密集、固縮，單純核棕黃色記為陰性。在400倍的光鏡下,被觀察的每張切片隨機檢測10個視野,計數(shù)每個視野凋亡的骨骼肌細胞數(shù), 以凋亡陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)作為細胞凋亡指數(shù)(Apoptosis Index，AI)。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 實驗結(jié)果

2.1 HFV對制動大鼠SOL濕重及CSA的影響

大鼠行制動實驗14 d后，SOL濕重體重比為30.22±2.68, 與CON組(47.54±3.97)對比有顯著性差異(P<0.05)，下降了36.43%。CSA在制動14d后為3789.56±95.14)μm2, 與CON組(2367.98±81.45)μm2對比有顯著性差異(P<0.05)，下降了37.77%。高頻振作行動各組相對IMM組的SOL濕重體重比及CSA均有所增加，且差異顯著(P<0.05)。其中IMM+100Hz組的效果更為明顯。

表1 HFV對大鼠比目魚肌濕重及CSA的影響

2.2 HFV對制動大鼠SOL超微結(jié)構(gòu)的影響

圖4 大鼠SOL肌纖維超微結(jié)構(gòu)

透射電鏡(TEM)下可見，CON組梭外肌結(jié)構(gòu)清晰，肌節(jié)完整，Z線整齊，肌原纖維間線粒體結(jié)構(gòu)清晰。肌梭結(jié)構(gòu)完整、清晰，肌節(jié)完整，肌原纖維間可見較小的線粒體，線粒體圓形或桿狀，線粒體嵴密集，結(jié)構(gòu)清晰，神經(jīng)髓鞘結(jié)構(gòu)完整。制動14d后，梭外肌病變明顯，肌節(jié)紊亂，部分肌原纖維消失，Z線呈水紋樣病變，肌細胞核內(nèi)染色質(zhì)團塊狀凝集、邊集，肌原纖維間線粒體輕度腫脹。肌衛(wèi)星細胞數(shù)量增多，細胞核電子密度增加，體積縮小，核內(nèi)常染色質(zhì)豐富，核仁大而明顯，肌漿網(wǎng)擴張，部分肌原纖維溶解區(qū)域被線粒體及其它細胞器充填。梭內(nèi)肌部分肌膜溶解消失，細胞核變形，核膜部分溶解、中斷，肌漿網(wǎng)擴張，軸周間隙增寬內(nèi)囊壁部分腫脹溶解。高頻振動組的梭外肌細胞輕度腫脹，肌原纖維排列略有紊亂，Z線結(jié)構(gòu)比較清晰。梭內(nèi)肌纖維結(jié)構(gòu)雖有些疏松、水腫，但Z線排列整齊，肌原纖維結(jié)構(gòu)完整，細胞核形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，神經(jīng)末梢與軸周間隙未見明顯改變(見圖4)。

2.3 HFV對制動大鼠SOL細胞凋亡的影響

制動14d后大鼠SOL中Bcl-2陽性表達率為20%(2/10)，明顯低于CON組的表達情況(9/10, 90%)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。制動14d后Bax陽性表達率為80%(8/10)，明顯高于CON組的表達情況(3/10, 30%，P<0.05)。制動14d后AI為20%，明顯高于CON組的表達情況(3/10, 30%，P<0.05)。高頻振動各組相對IMM組的Bcl-2陽性表達率均有所增加，Bax陽性表達率以及AI有所降低(P<0.05)，其中IMM+100Hz組的效果更為明顯(見圖4、5、6，表2)。制動14d后，肌梭中Bcl-2陽性表達有減少的趨勢，Bax陽性表達有升高的趨勢。在CON組肌梭中可見凋亡細胞核，IMM組凋亡細胞核明顯增多，細胞腫脹(胞核也腫脹)明顯。高頻振動各組相對IMM組Bcl-2陽性表達有升高的趨勢，Bax陽性表達有減少的趨勢，凋亡細胞核明顯減少(見圖4、5、6)。

表2 HFV對大鼠SOL細胞凋亡的影響

圖5 大鼠SOL Bcl-2染色

圖6 大鼠SOL Bax染色

3 分析與討論

3.1 對高頻正弦波振動儀器所進行的技術(shù)改進

高頻正弦波振動可提高肌梭的敏感性及傳入放電，為此，我們以前期的自主產(chǎn)品“探頭機箱式振動儀”(已獲得專利)為基礎(chǔ)，對正弦振動的發(fā)生裝置進行了改造創(chuàng)新(專利申請中)，其主要發(fā)明創(chuàng)新有：①用線圈在勻磁場中的振動代替?zhèn)鹘y(tǒng)意義上的機械振動，實現(xiàn)摩擦小、耗能小、容易控制、可以微型化的目的；②小型電流源的設計，實現(xiàn)恒定正弦電流型號的輸出，使線圈產(chǎn)生的動生電動勢和感生電動勢在線圈內(nèi)產(chǎn)生的電流對輸入電流基本無影響；③通過程序?qū)崿F(xiàn)對芯片AD9833BR的控制產(chǎn)生正弦電壓輸出，繼而控制電流輸出，最終實現(xiàn)對機械振動的控制，也可通過改變程序?qū)崿F(xiàn)其他形式的輸出。

3.2 SOL濕重及肌纖維橫截面積的變化

骨骼肌的質(zhì)量和體積可以根據(jù)生理和病理條件而產(chǎn)生變化，肌萎縮的速度和程度具有很大的異質(zhì)性，廢用狀態(tài)下慢肌萎縮較快肌明顯，SOL和腓腸肌內(nèi)側(cè)肌萎縮速度最快[20-21]。因此，我們選取了大鼠SOL對濕重體重比和肌纖維橫截面積進行了觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)制動后SOL出現(xiàn)了較大程度的萎縮。多數(shù)學者認為，肌萎縮的主要原因是由于廢用狀態(tài)下肌肉蛋白合成速率下降或/和分解速率上升導致，肌肉濕重及肌纖維橫截面積的減少機制可歸因于蛋白質(zhì)降解增加與合成受阻。17d臥床致使小腿肌肉橫截面積減少約8%，最大等長伸膝力矩下降6%；當臥床延長至38 d，小腿肌肉橫截面積損失16%，最大等長伸膝力矩減少18%[22]。NaitoH等報道稱失重期間蛋白質(zhì)分解速率的上升及合成速率的下降并不是同期出現(xiàn)的，泛素蛋白酶系統(tǒng)和藥依賴性蛋白酶體系統(tǒng)在肌萎縮中起著關(guān)鍵作用[23]。細胞凋亡是維持增殖組織完整性的必要條件[24]，凋亡細胞核可能促進了肌肉質(zhì)量的減少，但其機制不甚明了[25]。

3.3 SOL超微結(jié)構(gòu)的變化

細胞凋亡是多細胞生物中的一個重要生命過程，它確保消除多余的組織，維護組織平衡。細胞凋亡具有獨特的生物化學過程和細胞形態(tài)學變化[26],有學者認為，電鏡下凋亡細胞的形態(tài)特征(細胞骨架雜亂、細胞質(zhì)和核濃縮、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔膨脹、凋亡小體逐漸形成)仍然是確定細胞凋亡較為可靠的定性方法。本實驗電鏡觀察可見細胞皺縮，核固縮、碎裂，動態(tài)膜皺縮和鄰居或細胞外基質(zhì)的粘附損失等比較典型的細胞凋亡特征，可以初步判斷在廢用狀態(tài)下細胞凋亡的存在。有學者通過對頭低位臥床休息30d的人體SOL電鏡觀察發(fā)現(xiàn)：SOL肌束狀結(jié)構(gòu)紊亂，Z線呈水紋樣病變，肌細胞核內(nèi)染色質(zhì)團塊狀凝集、邊集，肌纖維間間隙加大，偶爾可見肌纖維碎片，有呈病灶性表現(xiàn)的傾向，這與本次實驗的結(jié)果比較一致。

3.4 肌肉萎縮與凋亡

骨骼肌細胞是多核細胞，機體對肌核數(shù)量有相當嚴格的調(diào)控。廢用導致的肌萎縮往往會出現(xiàn)細胞核數(shù)量的損失，這種凋亡性核死亡與單核細胞的凋亡過程有所區(qū)別。多種應激因素促進了細胞的凋亡，過度訓練可導致骨骼肌細胞發(fā)生凋亡，繼而導致骨骼肌細胞的損傷，其機制可能是肌細胞抗肌萎縮蛋白缺乏所致[27]。同時，運動與活動減少時也會引起骨骼肌細胞的凋亡。細胞凋亡信號通路(死亡受體通路、線粒體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路)的激活在廢用性肌萎縮的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用：死亡配體與細胞外受體結(jié)合后將凋亡信號轉(zhuǎn)至胞內(nèi)，活化Caspase-3引發(fā)DNA酶和核酸內(nèi)切酶裂解基因組DNA并最終導致凋亡。這一過程發(fā)生在骨骼肌蛋白降解之前[28]。

Bcl-2 蛋白家族與凋亡密切相關(guān)(抑制凋亡蛋白：Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1、Bfel、Al 等，促凋亡蛋白：Bax、Bcl-xS、Bad、Bak、Bik等)，它們分布在線粒體外膜、核膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上[29]。Bax可降低脂質(zhì)雙分子層的穩(wěn)定性，啟動Caspases的級聯(lián)反應，導致染色質(zhì)濃縮、核小體DNA片斷化和凋亡小體的形成，促使細胞凋亡[30-32]。Bcl-2 則通過與 Bax競爭性地抑制結(jié)合，調(diào)控線粒體的滲透性，形成異源二聚體而抑制細胞凋亡。胞內(nèi)Bcl- 2/Bax比值很大程度上決定了細胞是否接受誘導凋亡的信號，決定細胞存活或凋亡。

線粒體是凋亡的核心環(huán)節(jié)，可以放大外源性凋亡信號,當線粒體膜通透性發(fā)生改變后會釋放細胞色素c和細胞凋亡誘導因子(Apoptosis Inducing Factor，AIF)從而引發(fā)凋亡[ 33]。此次試驗顯示，高頻振動各組相對IMM組的Bcl-2陽性表達率均有所增加，Bax陽性表達率以及AI有所降低，推測高頻振動因為興奮了肌梭而改變了骨骼肌纖維的內(nèi)環(huán)境，延緩了胞內(nèi)線粒體的損失程度。最近的實驗顯示[34]：Bcl-2家族蛋白與 Ca2+信號有較強的相關(guān)，可以通過改變內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣容量和Ca2+的釋放速度實現(xiàn)間接對凋亡進展的調(diào)控。

3.5 肌梭的適應性變化

肌梭是骨骼肌內(nèi)主要的感受牽拉刺激的感受器[35]，正常情況下，由于肌梭不斷有傳入沖動到達中樞，從而維持一定的肌緊張，并參與中樞對整個機體肌緊張的調(diào)節(jié)。然而，在運動減退、制動或肌肉去負荷等情況下，由于肌梭受到的刺激減少，向中樞傳入的神經(jīng)沖動也隨之減少，隨著廢用時間的延長，進而會誘發(fā)有關(guān)中樞部位的變化，后者通過一系列復雜的神經(jīng)、體液調(diào)節(jié)機制引起梭內(nèi)肌與梭外肌代謝、結(jié)構(gòu)或功能的改變，最終導致(或加重)肌肉萎縮。研究發(fā)現(xiàn)骨骼肌伸長位制動可減輕肌肉萎縮的程度,縮短位制動肌萎縮程度明顯增加,間歇性牽拉及正弦波高頻振動可有效防止肌萎縮, 更進一步證實了肌梭在廢用狀態(tài)下肌萎縮中的作用[36]。

正弦波振動可以選擇性興奮肌梭，使肌梭傳入纖維，特別是初級傳入纖維(Ⅰ類纖維)的傳入沖動增加。因此我們認為：高頻正弦波振動可抑制廢用狀態(tài)下大鼠比目魚肌肌梭代謝與功能活動的改變，提高肌梭的敏感性及傳入放電，從而反射性的引起肌緊張增強，改善梭外肌的代謝、功能和組織結(jié)構(gòu)，因而具有對抗肌肉萎縮的作用。

4 研究結(jié)論

高頻正弦波振動對廢用性肌萎縮有對抗作用，可以延緩細胞凋亡進程，在臨床上具有易操作和無創(chuàng)傷的優(yōu)點，我們會進一步使之便攜化和經(jīng)濟化，下一步工作將是對人體“可穿戴式抗肌萎縮儀”的研制。

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(編輯 孫君志)

High Frequency Sinusoidal Wave Vibration Inhibit Apoptosis of Disused Muscular Atrophy

SHI Lei1, WANG Yiming1, HU Tinghua2, FAN Xiaoli3

Objective: To investigate the antagonism of high-frequency sine-wave vibration (HFV) on the apoptosis of skeletal muscle in the disused state. Methods: The animal models were established and the key techniques of the vibration instrument were improved. The short-term intermittent vibration was used to observe the effects of HFV on soleus muscle (SOL) wet weight in the brains of SD rats. The ultrasonography, immunohistochemical staining TUNEL assay, the effect of HFV on the brake in rat soleus muscle (SOL) wet weight to body weight ratio, muscle fiber cross-sectional area, ultrastructural changes, Bcl-2 and Bax expression. Results 1) The body weight ratio of SOL was 30.22 ± 2.68, decreased by 36.43%. The cross-sectional area of muscle fiber was 3789.56 ± 95.14μm2, which decreased by 37.77%. (P<0.05). (2) Electron microscopy showed that the extraocular muscle lesion was obvious after the brachytherapy, and chromatin agglutination in the nucleus was observed in the HFV group compared with the brachytherapy group. Skeletal muscle part of the dissolution of the sarcolemma, nuclear deformation. (P<0.05), the Z-line structure of the extra-oculi muscle in the vibration group was clear, and no obvious change was observed in the intrafusal muscle fiber structure.3) The expression of Bcl-2 in the SOL was significantly lower than that in the control group <0.05). The positive rate of Bax expression was 80% after brakes, which was significantly higher than that of the control group (P<0.05). AI after braking was 20%, significantly higher than the control group (P<0.05). The expression of Bcl-2 and the expression of Bax and AI in the HFV group were significantly lower than those in the control group (P<0.05). Conclusion The modified dystrophy vibrator has strong operability, which can restrain the process of apoptosis of the brake muscular atrophy.

highfrequencysinusoidalvibration;musclespindle;disuseatrophy;apoptosis;skeletalmuscle

G804.2 Document code：A Article ID：1001-9154(2017)02-0089-07

1.國家自然科學基金項目“從肌梭的改變探討正弦波振動對抗廢用性肌肉萎縮的作用機制”(30901583);2.中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金資助,西安交通大學基本科研業(yè)務費國際合作項目(1191320036)

石磊，博士，教授，研究方向：運動生理學，E-mail：shilei@xjtu.edu.cn。

1.西安交通大學體育中心，陜西 西安 710049；2.西安交通大學第一附屬醫(yī)院，陜西 西安 710049；3.西安交通大學醫(yī)學院，陜西 西安 710049 1.Xi’an Jiaotong University Sports Center，Xi’an Shanxi 710049; 2. First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University , Xi’an Shanxi 710049; 3. Department of Physiology, Medical School of Xi’an Jiaotong University, Xi’an Shanxi 710049

2016-10-28

2017-01-06

G804.2

A

1001-9154(2017)02-0089-07