彭宏剛，陳翔宇，劉艷豐*，張 玲

（1．新疆庫爾勒市庫爾楚園藝場，新疆 庫爾勒 841000，2.新疆畜牧科學院，新疆 烏魯木齊 830000）

瘤胃原蟲在瘤胃內建立及其研究進展

彭宏剛1，陳翔宇2，劉艷豐2*，張 玲2

（1．新疆庫爾勒市庫爾楚園藝場，新疆 庫爾勒 841000，2.新疆畜牧科學院，新疆 烏魯木齊 830000）

反芻動物瘤胃內大量原蟲，對于飼料營養(yǎng)物質在瘤胃內的發(fā)酵分解，維持微生態(tài)環(huán)境的穩(wěn)定等方面起著十分重要的作用。本文綜述了瘤胃原蟲區(qū)系在反芻動物瘤胃內建立，瘤胃原蟲的營養(yǎng)來源、對瘤胃內環(huán)境的影響和分子生物技術在瘤胃原蟲中的應用。

瘤胃；原蟲；纖毛蟲；研究進展

10.16863 /j.cnki.1003-6377.2017.05.002

反芻動物瘤胃內寄生了非常豐富的微生物，主要包括細菌、原蟲和真菌等。這些微生物在發(fā)酵和分解飼料中營養(yǎng)物質，穩(wěn)定瘤胃內微生態(tài)環(huán)境等方面，發(fā)揮著重要的作用。瘤胃微生物中的原蟲，主要是纖毛蟲綱 （Ciliates），還有鞭毛蟲綱 （Falgellatet）等，纖毛蟲主要是全毛蟲 （Holotrich Protozoa）和貧毛蟲（Entodiniomorphid Protozoa）。原蟲可以促進飼料中蛋白質類的消化、吸收和利用，但抑制脂類和糖類的消化、吸收和利用；對維生素類和礦物質類物質的消化、吸收和利用也有影響（Jounay，1996）[1]。因此，研究瘤胃原蟲對反芻動物瘤胃消化代謝體系的作用機理對挖掘和掌握微生物對反芻動物營養(yǎng)與飼料科學資源開發(fā)具有重要的意義。

1 原蟲區(qū)系的建立

1.1 幼齡反芻動物的瘤胃原蟲

幼齡反芻動物獲得原蟲最直接和最主要的途徑是與成年動物的直接接觸，當母畜舔食幼畜時，母畜口腔內的原蟲能直接傳給幼畜。幼齡反芻動物及時接觸或采食被原蟲區(qū)系完善的反芻動物接觸過的物體或牧草上留下唾液，也能間接地獲得原蟲。第三個途徑是通過氣溶膠的形式，一些原蟲間接傳播給幼齡反芻動物。出生后立即隔離的犢牛和羔羊體內無法快速建立原蟲區(qū)系。

隨著幼齡反芻動物的生長，瘤胃生理環(huán)境逐漸穩(wěn)定有利于原蟲的建立。在初生后3～6周前，給幼畜飼喂飼料，幼畜的瘤胃活動力、瘤胃壁吸收力、唾液分泌均會發(fā)生變化，引起瘤胃內pH值出現波動，當瘤胃中pH值降至5.0，可以阻礙原蟲區(qū)系的建立。Fonty等（1988）[2]研究無菌隔離對羔羊瘤胃纖毛蟲的建立的影響發(fā)現，瘤胃中良好的細菌區(qū)系的早期形成是建立纖毛蟲區(qū)系的前提。

1.2 無原蟲反芻動物原蟲區(qū)系的建立

研究不同環(huán)境對瘤胃功能影響的常用方法是給無原蟲反芻動物接種定量和已知的某原蟲，建立一個一定濃度的原蟲區(qū)系，但原蟲區(qū)系所需建立時間因接種量和動物種類而異。Williams和Dinuson(1972)[3]在去原蟲犢牛瘤胃內接種內毛蟲或全毛蟲，接種了20～50個原蟲細胞的犢牛5～7周后的瘤胃內纖毛蟲濃度相當于接種了1萬～9.4萬個細胞的1～2周水平。一頭去原蟲犢牛與成年山羊一起飼養(yǎng)16周后，犢牛瘤胃內原蟲濃度與山羊瘤胃內的原蟲濃度相當。Williams和Wither(1993)[4]在4頭去原蟲綿羊瘤胃中重新接種1 000個清洗過的原蟲細胞，11 d后4頭綿羊瘤胃內纖毛蟲濃度皆大于105個/g內容物，主要類型為內毛蟲屬原蟲。

2 瘤胃內纖毛蟲的營養(yǎng)來源

2.1 淀粉對瘤胃原蟲的影響

淀粉是瘤胃內纖毛蟲，尤其是貧毛蟲的主要營養(yǎng)來源。貧毛蟲可以快速采食淀粉，直至其細胞內充滿淀粉才停止采食，采食后的淀粉被原蟲儲存后慢慢發(fā)酵。原蟲和細菌發(fā)酵淀粉的作用機理是有差異的，在原蟲體內，淀粉是以顆粒的形式儲存，緩慢發(fā)酵生成乙酸和丙酸等短鏈脂肪酸，直接通過瘤胃壁被反芻動物吸收，小部分經小腸吸收；在細菌體內，淀粉被快速發(fā)酵生成乳酸而沉積(Newbold,1985)[5]。纖毛蟲的這種淀粉儲存形式不僅穩(wěn)定了瘤胃pH值和滲透壓，還能減少淀粉快速發(fā)酵引起反芻動物宿主的酸性中毒的危害，對調控瘤胃的發(fā)酵模式具有重要意義。但驅除纖毛蟲后，淀粉在消化道內總的消化率沒有改變，只是其消化從瘤胃轉移至小腸(Mendoza,1993)[6]，也有報道，有沒有纖毛蟲對淀粉的消化無明顯影響。

2.2 纖維素對瘤胃原蟲的影響

纖毛蟲直接參與降解細胞壁多糖的過程。一些大型纖毛蟲，如：前毛蟲、頭毛蟲和雙毛蟲等是瘤胃內降解纖維物質的主力軍，能在沒有淀粉的情況下利用纖維素生長。纖毛蟲消化和降解纖維素的兩種主要方式，一是纖毛蟲將植物組織直接進行物理性裂解，使植物細胞壁破裂成碎片，導致細胞分離，分離的細胞和碎片被纖毛蟲直接吞噬消化；還有一種方式是纖毛蟲分泌可以分解纖維素、半纖維素和果膠等的分解酶，從而直接降解細胞壁多糖。

2.3 氨基酸對瘤胃原蟲的影響

纖毛蟲不能直接利用植物蛋白等含氮物質，但能吞噬瘤胃內細菌，攝取其游離氨基酸及植物蛋白等來合成自身的氨基酸，滿足纖毛蟲對氮的需要。植物中可溶性蛋白質和不溶性蛋白顆粒都能被纖毛蟲降解，如不溶性顆粒魚粉、菜籽餅等植物蛋白也可被纖毛蟲分解（Ushida和Jouany,1985）[7]。纖毛蟲被全部驅除后，瘤胃內氨濃度降低，主要原因是纖毛蟲有非常強的脫氨基作用，脫氨基產生的氨貯存在瘤胃液內。

2.4 礦物質等營養(yǎng)元素對瘤胃原蟲的影響

礦物質和維生素是纖毛蟲生長的必需元素。纖毛蟲對膽堿影響較大，當纖毛蟲被全部驅除后，膽堿的吸收受到明顯抑制，但內源膽堿增加。內源膽堿增加是由于纖毛蟲被驅除減少，使蛋氨酸含量的增加，蛋氨酸為內源膽堿合成提供了甲基供體，內源膽堿的合成增加。

3 纖毛蟲對瘤胃內環(huán)境的影響

3.1 纖毛蟲對瘤胃pH值的影響

恒定的pH值是瘤胃微生物的正常生長、發(fā)育及瘤胃正常發(fā)酵作用的前提。纖毛蟲對pH值的恒定具有十分重要的作用，主要的作用機制是纖毛蟲吞噬瘤胃內可溶性糖類（葡萄糖、麥芽糖、蔗糖及可溶性淀粉等），以淀粉和多聚葡萄糖的形式貯存，降低細菌對可溶性糖類的爆發(fā)性快速發(fā)酵引起pH的變化。

3.2 纖毛蟲對瘤胃VFA的影響

瘤胃中有原蟲時，瘤胃發(fā)酵產生的總VFA、NH3、CO2、甲烷等濃度較高，飼糧發(fā)酵類型以低丙酸高丁酸發(fā)酵為主。瘤胃中原蟲驅除后，瘤胃發(fā)酵產生的丙酸、總VFA生成量和比例增加，而丁酸、乙酸的比例下降，減少甲烷產生量，飼糧發(fā)酵類型為高丙酸發(fā)酸。體外培養(yǎng)時也證實纖毛蟲產生大量的乙酸、乳酸、丁酸、氫和CO2，但丙酸含量較少。

3.3 纖毛蟲對瘤胃NH3-N濃度的影響

瘤胃中氨氮濃度對反芻動物的蛋白質消化吸收具有重要的影響。綿羊有無原蟲，瘤胃氨氮濃度和丁酸差異很大，綿羊無原蟲時，瘤胃氨氮濃度和丁酸比例降低，微生物氮與飼料的流出量增加。有研究證明，去原蟲可降低飼料和細菌蛋白的降解率，使瘤胃氨氮濃度明顯下降。也有研究表明，瘤胃NH3-N濃度對蛋白質降解速度和降解程度無影響，去原蟲減少瘤胃內蛋白質降解的機制與蛋白質的溶解度有關。

3.4 纖毛蟲對瘤胃甲烷產量的影響

反芻獸甲烷桿菌和甲酸甲烷桿菌是產甲烷的主要菌，產甲烷菌大部分屬于細菌。作用原理是：產甲烷菌和纖毛蟲是兼性協(xié)同關系，在瘤胃中，產甲烷菌黏附纖毛蟲上，以纖毛蟲代謝產物H2和瘤胃中厭氧發(fā)酵產生的CO2為原料，在氫化酶的作用下合成甲烷和水。纖毛蟲產生的氫氣是瘤胃內合成甲烷的主要來源，而且有些纖毛蟲本身就是產甲烷菌，因此，原蟲是反芻動物瘤胃內間接和直接的產甲烷體。試驗證明，驅除瘤胃原蟲，導致產甲烷菌就失去了黏附的底物，產甲烷菌減少和沒有瘤胃原蟲可導致甲烷產量明顯下降。Kittelmann等(2013)[8]采用經典的第二代測序法（454高通量焦磷酸測序法）測定奶牛、綿羊和紅鹿的瘤胃微生物群落，發(fā)現瘤胃原蟲與Black Rhino組厭氧真菌呈負相關關系，差異顯著。

4 分子生物學技術在瘤胃原蟲研究中的應用

分析瘤胃原蟲時，采用DNA多態(tài)性，可以避免由于原蟲蟲體微小、形態(tài)相似而無法準確區(qū)分的困難，使瘤胃微生態(tài)的研究變得更為簡單和精確。隨機擴增多態(tài)DNA、指紋圖譜 (RAPD)、同位素示蹤、Real-Time PCR、變性梯度凝膠電泳和熒光原位雜交等分子生物學技術隨著技術的成熟，在瘤胃原蟲的研究上應用越來越多，從基因、分子層次研究纖毛蟲的類型和種類、豐度等，對反映瘤胃的真實現狀提供更加可靠而豐富的依據。近年來發(fā)展的新的研究技術-高通量測序和代謝組學等方法更進一步豐富了原蟲的研究手段。

Shin等(2004)[9]用18S rRNA片段測序技術發(fā)現在瘤胃液分離出的可識別克隆片段中，內毛蟲為主，含量為69.6%，其次是貧毛蟲，為31.4%，不到1/3；同時發(fā)現約1/3的克隆片段是Gene Bank沒有的，需要進行深度挖掘。Karnati等(2003)[10]采用專一性的原蟲引物(P.SSU-342f)和18S rRNA/PCR兩種方法測定和對比了瘤胃原蟲的基因序列，表明，所有的克隆序列和Gen Bank的序列同源性達到93%～99%。

Hristov等（2001）[11]用同位素示蹤法測定微生物蛋白分解酶活力，N14標記的酪蛋白作為瘤胃微生物的氮源測定原蟲活性。

實時PCR(Real-Time PCR)可以估測瘤胃原蟲數量。Sylvester等[12](2005)用Real-time PCR定量技術分析瘤胃原蟲氮，發(fā)現原蟲氮占了瘤胃微生物氮的4.8%～12.7%。Skillman等(2006)[13]采用實時PCR技術定量技術分析瘤胃中內毛蟲屬（飼喂基礎日糧為干草的綿羊），發(fā)現內毛蟲屬占瘤胃原蟲總量的98%，但個體間存在差異。Regensbogenova等(2004)[14]對綿羊飼喂相同日糧，發(fā)現纖毛蟲種類個體差異很大，但同一個體的瘤胃中不同部位纖毛原蟲種類差異很??；進一步研究表明，同一綿羊飼喂不同的日糧，瘤胃原蟲的種類差異很大。

在微生物區(qū)系結構變化監(jiān)測中，熒光原位雜交(Fluorescenc in situ hybridization,FISH)技術的應用也很多。獨立的微生物細胞可以用熒光標記的寡核苷酸探針來探測。研究者用熒光原位雜交技術定量了瘤胃中總產甲烷菌，發(fā)現甲烷微菌屬占54%，還測定了不同反芻動物瘤胃中顫螺菌的含量。

DNA芯片技術是一項融合了微電子學、生物學和計算機技術設計等的分子生物學分析方法。DNA芯片技術主要用于醫(yī)學和分子生物學，隨著技術融合，也用于瘤胃微生物區(qū)系的研究。這種分析方法優(yōu)勢是操作簡單，信息含量大，可一次性獲得大量瘤胃微生物區(qū)系信息。

隨著研究的深入，元基因組學技術和高通量測序技術逐漸成為微生物研究的主流。Findley等(2011)[15]用 ZAP載體構建了瘤胃原蟲元基因組文庫。Kittelmann等(2013)[8]用 454高通量測序測定了飼喂不同日糧的奶牛、綿羊和紅鹿的瘤胃原蟲。lshaq等(2014)[16]利用高通量測序法測定了阿拉斯加地區(qū)駝鹿的腸道原蟲。

5 營養(yǎng)物質對瘤胃原蟲的影響

增加飼糧的精粗比，可以顯著增加瘤胃總原蟲數量和種屬。粗飼料來源不同時，增加飼糧精粗比都會增加原蟲數量，當飼糧精料由30%提高到70%時，瘤胃原蟲增加29%，內毛屬增加1/4。不同飼糧精粗比調節(jié)原蟲數量可能是通過降低瘤胃pH值來實現的。

在飼糧中添加莫能菌素、單寧和脂類等添加劑對瘤胃原蟲數量顯著影響。油脂添加到飼糧，瘤胃原蟲數量顯著降低，表明油脂可以抑制原蟲生長，作用機理是原蟲對飼糧中脂類的采食、吸收和轉運的能力十分有限（王夢芝，2001）[17]。王夢芝等(2011)[17]利用克隆測序、遺傳指紋圖譜和顯微鏡計數等方法研究發(fā)現，羽毛粉、玉米蛋白粉、豆粕和魚粉4種蛋白補充配合日糧對瘤胃內毛屬、前毛屬和頭毛屬原蟲數量有顯著影響。

6 展 望

高愛武（2003）[18]等發(fā)現瘤胃原蟲的種類、數量、功能受瘤胃內環(huán)境包括內容物稀釋率和外流速率、飼糧類型、動物種類等影響，同時瘤胃原蟲與其他瘤胃微生物之間存在互作、競爭和拮抗等關系，把瘤胃微生物的結構與功能聯系起來開展整體研究，有助于認識微生物的本質，有利于反芻動物的生產。

交叉學科的融合發(fā)展，如分子生物學技術和動物營養(yǎng)學結合，為瘤胃原蟲研究提供了新思路，將其它學科與經典微生物結合，通過挖掘瘤胃原蟲對營養(yǎng)素的利用；以及營養(yǎng)素調控瘤胃原蟲區(qū)系，種類、數量以及發(fā)酵類型，從而整體調節(jié)調控瘤胃功能，加以開發(fā)和利用可能是科研工作者今后的研究重點。

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Research Progress of Rumen Protozoan Colonization

PENG Hong-gang1，CHEN Xiang-yu2，LIU Yan-feng2*,ZHANG Ling2
（1.Kuerchu Horticultural Farm of Korla Xinjiang,Korla 841000，China；2.Xinjiang Academy of Animal Science,Urumqi 830013，China）

A large number of rumen of ruminants protozoa play an important role in the fermentation and decomposition of feed nutrients and heep maintaining the stability of the micro ecological environment.This paper summarizes the establishment of rumen protozoa in the rumen,the sources of nutrients in rumen protozoa,the influence on rumen environment and the application of molecular biotechnology in rumen protozoa.

rumen；protozoa；ciliates；research progress

S852

A

1003－6377（2017）05－0009-05

新疆公益性科研院所基本科研業(yè)務經費（KY2017016）；國家公益性行業(yè)（農業(yè)）科研專項（201303062）

彭宏剛（1982-），男，碩士，獸醫(yī)師，長期從事畜牧獸醫(yī)技術推廣。E-mail：phg-w@163.com

劉艷豐（1981-），男，副研究員，主要研究方向為反芻動物營養(yǎng)。E-mail：liuyanfeng520@sina.com

2017-06-16，

2017-07-28