劉愛華，徐紅艷，王 彬，王 衛(wèi)，周 波，袁麗杰

(1.華北理工大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北省慢性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，唐山市慢性病臨床基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北唐山 063009； 2. 土肥資源高效利用國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東泰安 271018)

刺五加內(nèi)生放線菌對(duì)5種蘋果病原真菌的拮抗作用初探

劉愛華1，徐紅艷1，王 彬1，王 衛(wèi)1，周 波2，袁麗杰1

(1.華北理工大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北省慢性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，唐山市慢性病臨床基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北唐山 063009； 2. 土肥資源高效利用國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東泰安 271018)

以蘋果病原真菌尖孢鐮刀菌、層出鐮刀菌、串珠鐮刀菌、腐皮鐮刀菌、立枯絲核菌為靶標(biāo)菌，采用皿內(nèi)對(duì)峙培養(yǎng)法，對(duì)265株刺五加內(nèi)生放線菌進(jìn)行抗菌活性篩選。結(jié)果表明：供試的265株內(nèi)生放線菌抗菌譜廣，抗菌活性強(qiáng)，至少具有1種抗菌活性的菌株占菌株總數(shù)的51.0%。對(duì)層出鐮刀菌和串珠鐮刀菌具有抑制活性的菌株較多，分別占檢測(cè)總菌株的38.9%和48.7%。對(duì)尖孢鐮刀菌、腐皮鐮刀菌、立枯絲核菌有抑制作用的菌株數(shù)量接近，分別占檢測(cè)菌株總數(shù)的23.4%、31.7%、28.7%。對(duì)強(qiáng)活性菌株的PKSⅠ、PKSⅡ、NRPS、Helo、CYP功能基因篩選結(jié)果提示，菌株大多具有至少1種功能基因。10株強(qiáng)活性菌株系統(tǒng)發(fā)育分析表明，這些菌株都屬于鏈霉菌屬菌株。

刺五加；內(nèi)生放線菌；蘋果病原真菌；拮抗作用；生物防治

植物內(nèi)生菌(Plant Endophyte)是指在其生活史中的某一段時(shí)期生活在健康植物組織內(nèi)部，不引起植物組織明顯侵染及癥狀改變的一類菌，包括真菌、細(xì)菌、放線菌[1]。植物內(nèi)生菌廣泛存在于不同植物中，因與植物各組織長(zhǎng)期共生或寄生，而具有與其他生境中微生物不同的特性。1993年，美國(guó)蒙大拿州立大學(xué)的Stierle研究小組首次從短葉紫杉(Taxusbreviforlia)中分離得到1株能合成抗癌物質(zhì)紫杉醇的內(nèi)生真菌新種安德氏紫杉霉菌(Taxomycesandreanae)[2]，由此掀起對(duì)藥用植物內(nèi)生菌研究的熱潮。

中草藥植物能產(chǎn)生豐富的藥理活性物質(zhì)，為與其共進(jìn)化的內(nèi)生菌創(chuàng)造一種獨(dú)特生境，導(dǎo)致從中草藥植物中分離的內(nèi)生菌具有促生長(zhǎng)、抑制病原菌，參與寄主某種化合物的合成，合成與宿主植物相同或相似活性成分等功能，而且產(chǎn)生新活性物質(zhì)的幾率比較大[3]。近年來，國(guó)外文獻(xiàn)有報(bào)道從杜鵑花[4]、蛇藤[5]和衛(wèi)矛科植物等分離到的內(nèi)生放線菌產(chǎn)生新的抗菌化合物。國(guó)內(nèi)趙珂[6]報(bào)道分離自攀西地區(qū)藥用植物內(nèi)生放線菌株對(duì)8種農(nóng)業(yè)病害真菌都表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性，遠(yuǎn)高于對(duì)普通細(xì)菌的抑菌活性。朱文勇等[7]報(bào)道分離自云南喜樹內(nèi)生放線菌對(duì)蘋果炭疽菌、串珠鐮孢菌等植物病害真菌表現(xiàn)出比對(duì)細(xì)菌更高的抗菌活性，篩選陽(yáng)性率分別達(dá)到21.1%和26.7%。具有抗真菌活性的菌株遠(yuǎn)多于抗細(xì)菌的菌株。有研究顯示[8]，在植物組織中內(nèi)生病原真菌類群占優(yōu)勢(shì)。那么因植物內(nèi)生放線菌具有更強(qiáng)的抗病原真菌的活性，使之能幫助宿主植物抵御病原真菌的危害，很好地印證其與宿主植物之間互惠互利的共生關(guān)系。同時(shí)植物內(nèi)生放線菌在抵御植物真菌病害方面的優(yōu)勢(shì)也為尋找生物農(nóng)藥提供一條很好的思路。

蘋果是中國(guó)的主要水果種類，也是北方果園的主要栽培樹種。蘋果的真菌性病害在中國(guó)廣泛分布，嚴(yán)重影響果業(yè)生產(chǎn)安全[9]。在蘋果病害的防治工作中，由于長(zhǎng)期使用化學(xué)農(nóng)藥使植物病原真菌產(chǎn)生很強(qiáng)的抗藥性[10-11]。不但化學(xué)農(nóng)藥的防治效果越來越差，而且大量農(nóng)藥殘留還可能造成果品及環(huán)境污染。隨著人們對(duì)水果品質(zhì)的要求不斷提高，生物防治作為安全、有效的手段已逐步應(yīng)用到真菌病害防治中。因此，尋找和研制生物農(nóng)藥逐漸代替化學(xué)農(nóng)藥是防治蘋果真菌病害的重要途徑之一[12-13]。

為此，華北理工大學(xué)微生物分離鑒定及代謝產(chǎn)物研究課題組檢測(cè)菌種庫(kù)中265株刺五加(Acanthopanaxsenticosus)內(nèi)生放線菌對(duì)5種蘋果病原真菌的拮抗作用，旨在篩選具有明顯抑菌作用的刺五加內(nèi)生放線菌菌株，為進(jìn)一步應(yīng)用研究奠定良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 刺五加內(nèi)生放線菌 試驗(yàn)內(nèi)生放線菌為實(shí)驗(yàn)室菌種庫(kù)中保存的從遼寧省本溪市、吉林省梅河口市、吉林省柳河縣、黑龍江省穆棱市、河北省興隆縣(霧靈山)5個(gè)地區(qū)刺五加的根、根莖、莖、葉中分離得到的265株內(nèi)生放線菌。

1.1.2 抗菌試驗(yàn)指示病原真菌 尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、層出鐮刀菌(Fusariumproliferatum)、串珠鐮刀菌(Fusariumverticillioides)、腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani)和立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)菌株均由土肥資源高效利用國(guó)家實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 培養(yǎng)基及主要試劑 ISP2固體瓊脂平板培養(yǎng)基：酵母膏4.0 g，葡萄糖4.0 g，麥芽膏10.0 g，微量鹽0.5 mL，復(fù)合VB 少許，瓊脂15.0 g，去離子水1 000 mL，pH 7.2～7.4；PDA平板培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15.0 g，去離子水1 000 mL，pH自然。

PCR擴(kuò)增引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成，BOX-PCR和功能基因檢測(cè)的試劑均購(gòu)于全式金生物技術(shù)有限公司，16S rRNA基因序列測(cè)定的試劑由天根生化科技有限公司提供。

1.2 方 法

1.2.1 抗菌活性檢測(cè) 將ISP2培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好的內(nèi)生放線菌，用直徑0.5 cm打孔器制成小圓片，倒置于距離培養(yǎng)皿中心3 cm的PDA平板四周，28 ℃培養(yǎng)3 d。在培養(yǎng)病原真菌的PDA平板上同樣也用0.5 cm打孔器取菌片，放置于PDA平板中心，于28 ℃培養(yǎng)3 d，測(cè)定供試菌株的抑菌圈大小，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.2 菌株功能基因選擇與檢測(cè) DNA的提取參照袁麗杰等[14]的方法。PKSⅠ、PKSⅡ、NRPS、Helo、CYP[15]化合物合成基因的引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。PCR反應(yīng)程序參照文獻(xiàn)[16] 進(jìn)行。產(chǎn)物用12 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電壓為100 V。

1.2.3 活性菌株初步分析 細(xì)菌基因組DNA提取、16SrRNA基因序列擴(kuò)增及序列測(cè)定參照袁麗杰等[14]的方法進(jìn)行。PCR產(chǎn)物測(cè)序由大連寶生物生物技術(shù)公司完成。挑選形態(tài)差異較大及活性較強(qiáng)的菌株進(jìn)行16S rRNA基因序列測(cè)定。依測(cè)序結(jié)果，用 Blaste程序從GenBank、ezbiocloud數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行相關(guān)菌株16S rRNA基因序列比對(duì)，系統(tǒng)進(jìn)化距離矩陣根據(jù)Kimum模型估算，用MEGA4軟件包采用鄰接法(Neighbor-Joining method)進(jìn)行聚類分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建。同時(shí)，重復(fù)取樣1 000次自展值(bootstrap value)分析評(píng)估系統(tǒng)進(jìn)化樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 活性篩選結(jié)果

供試的265株內(nèi)生放線菌對(duì)5株蘋果病原真菌均有不同程度的抗性(表1)，抗菌譜廣，抗菌活性強(qiáng)，至少具有1種抗菌活性的菌株占菌株總數(shù)的51.0%。對(duì)層出鐮刀菌和串珠鐮刀菌具有抑制活性的菌株較多，分別占檢測(cè)總菌株的38.9%和48.7%。其中對(duì)層出鐮刀菌具有較強(qiáng)抑菌活性(抑菌圈直徑≥21 mm)的菌株有26株，占該病原菌拮抗菌株總數(shù)的25.2%；對(duì)串珠鐮刀菌具有較強(qiáng)抑菌活性的菌株有27株，占拮抗菌數(shù)的20.9%。對(duì)尖孢鐮刀菌、腐皮鐮刀菌、立枯絲核菌有抑制作用的菌株數(shù)量接近，分別占檢測(cè)菌株總數(shù)的23.4%、31.7%、28.7 %。其中對(duì)尖孢鐮刀菌具有較強(qiáng)抑菌活性的菌株有18株，占拮抗菌數(shù)的29%；對(duì)腐皮鐮刀菌具有較強(qiáng)抑菌活性的菌株有9株，占拮抗菌數(shù)的10.7%；對(duì)立枯絲核菌具有較強(qiáng)抑菌活性的菌株有41株，占拮抗菌數(shù)的53.9%。立枯絲核菌的拮抗菌株雖然只占檢測(cè)菌株總數(shù)的28.7%，但其中抑菌活性較強(qiáng)的菌株占到一半以上。

265株檢測(cè)菌株中有31株菌對(duì)5種病原真菌均具有強(qiáng)度不等的抑制活性(表2)。其中菌株13-107、13-253、13-254、13-258對(duì)5種病原菌的抑制活性均較強(qiáng)，抑菌圈直徑均不小于21 mm。菌株13-123、13-181、13-251、13-252、13-292對(duì)其中的4種蘋果病原真菌具有拮抗活性，且大多活性作用較強(qiáng)。這些篩選結(jié)果為菌株進(jìn)一步開發(fā)利用和尋找抗菌活性物質(zhì)提供良好的研究材料和基礎(chǔ)。

表1 內(nèi)生放線菌對(duì)5種病原真菌的抑制作用Table 1 Inhibition effect of endophytic actinomycetes on five pathogenic fungi

注：抑菌強(qiáng)度中的+表示活性較弱，抑菌圈直徑<10 mm； ++表示活性中等，抑菌圈直徑為11～15 mm；+++表示活性中等，抑菌圈直徑表示為16～20 mm；++++表示活性較強(qiáng)，抑菌圈直徑表示21～25 mm；+++++.表示活性較強(qiáng)，抑菌圈直徑>25 mm。下表同。

Note:+.Weak antimicrobial activities with <10 mm diameter of inhibition zone； ++.Medium antimicrobial activities with 11-15 mm diameter of inhibition zone；+++.Medium antimicrobial activities with 16-20 mm diameter of inhibition zone；++++.Strong antimicrobial activities with 21-25 mm diameter of inhibition zone；+++++.Stronger antimicrobial activities with >25 mm diameter of inhibition zone. The same hereinafter.

表2 拮抗活性較廣及活性較強(qiáng)的菌株活性及其功能基因檢測(cè)Table 2 Activities and the functional genes of strains having wide and better antagonism activities

2.2 較強(qiáng)活性菌株相關(guān)功能基因的檢測(cè)結(jié)果

分別利用PKSⅠ、PKSⅡ、NRPS、CYP及Helo基因片段擴(kuò)增引物，對(duì)39株具有較強(qiáng)抗蘋果病原真菌活性的菌株相關(guān)次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因進(jìn)行檢測(cè)(表2)。結(jié)果表明，39株供試菌株中至少有30株擴(kuò)增出1種合成酶基因，其中擴(kuò)增出PKSⅡ基因的菌株數(shù)最多(17株)。擴(kuò)增結(jié)果顯示，菌株13-252的PKSⅠ、PKSⅡ、CYP及Helo4種功能基因都具備，菌株13-211、13-123均同時(shí)擴(kuò)增出PKSⅠ、PKSⅡ、CYP3種功能基因。此檢測(cè)結(jié)果提示有抗菌活性的菌株大多都能檢測(cè)到功能基因。但在檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，抗菌活性很強(qiáng)的菌株13-178、13-253、13-256及其他6株具有較好活性的菌株，未檢測(cè)到這5種編碼天然活性產(chǎn)物的相關(guān)基因。

2.3 活性菌株初步鑒定

依據(jù)抗菌活性及菌株形態(tài)選取10株菌株進(jìn)行初步鑒定?；?6S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，選取的10株強(qiáng)活性菌株都屬于鏈霉菌屬(Streptomyces)。由16S rRNA基因序列構(gòu)建的N-J系統(tǒng)發(fā)育樹顯示(圖1)，10株鏈霉菌分成4簇，與鏈霉菌屬標(biāo)準(zhǔn)菌株的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近從98.62%至100%不等。大部分菌株與其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最密切的典型菌株之間存在一定的遺傳差異。

節(jié)點(diǎn)處的數(shù)字代表用鄰接法分析時(shí)，在1 000次重復(fù)檢驗(yàn)中大于50%的自展值。括號(hào)中的數(shù)字是GenBank中菌株16SrRNA基因登記的序列號(hào)。

The numbers at the nodes indicate the bootstrap values (>50%) based on neighbour-joining analyses of 1 000 resampled data sets. Numbers in parentheses represent the sequences accession number in GenBank.

圖1 根據(jù)16S rRNA 基因序列構(gòu)建部分菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹
Fig.1 Phylogenetic tree showing the relationships among reference strains and experimental trains based on 16S rRNA gene sequences

3 討 論

中國(guó)是目前世界上最大的蘋果生產(chǎn)國(guó)家，2013年統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，國(guó)內(nèi)的蘋果種植面積已達(dá)到222.15萬hm2，大約10 a后，將有大批果園進(jìn)入更新改建期，由于耕地的缺乏，大多都是原地?fù)Q茬植樹，因此連作障礙已成為蘋果生產(chǎn)上的重要問題。大量試驗(yàn)表明，生物因素是產(chǎn)生再植病害最直接和最主要的原因。長(zhǎng)期再植使土壤微生物群落組成發(fā)生變化，從而抑制蘋果樹的生長(zhǎng)。目前，河北已成為中國(guó)主要的蘋果產(chǎn)區(qū)之一。河北省不同地區(qū)果園再植土的病原真菌數(shù)量有很大的差異，不同地區(qū)的優(yōu)勢(shì)種群也存在一定的差異，但鐮刀菌屬和絲核菌屬無論在哪個(gè)地區(qū)分離頻率都是最高的，已成為蘋果連作障礙的主要病原真菌[17]。

生物防治就是利用天然拮抗微生物或其代謝產(chǎn)物對(duì)抗植物病害的防治措施。宋光桃等[18]從植物根際分離篩選到1株抗油茶炭疽病菌的拮抗鏈霉菌F10。曾羽澈等分離到1株土壤中的放線菌ZM-16，對(duì)姜瘟的病害菌青枯假單胞菌具有明顯抑制作用。龍建友等[19-20]從秦嶺山區(qū)分離到1株鏈霉菌，其發(fā)酵液對(duì)10余種常見的農(nóng)作物病原真菌具有良好的殺菌活性，并已申請(qǐng)專利?？梢?，使用生防菌劑逐步替代造成嚴(yán)重環(huán)境問題的化肥和農(nóng)藥的防治措施，已越來越受到各國(guó)學(xué)者的關(guān)注和重視，并將成為未來的發(fā)展方向。

天然活性產(chǎn)物的主要來源是放線菌。目前，約2/3的抗生素是由放線菌產(chǎn)生，尤其是其中的鏈霉菌屬所產(chǎn)生的[21]，很早就被人類用于制造抗真菌、抗細(xì)菌、抗腫瘤的各類抗生素。進(jìn)而人們又從中挖掘出農(nóng)業(yè)抗菌劑、殺蟲和除草劑、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等多種產(chǎn)品，在醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)病蟲害和環(huán)境保護(hù)中起到重要作用。因而在放線菌中尋找并分離新型農(nóng)用抗生素是極具潛力的。鏈霉菌屬的菌株不僅廣泛分布于土壤的腐生環(huán)境中[22]，植物內(nèi)部也蘊(yùn)藏有相當(dāng)豐富的資源[23]。從本次篩選活性結(jié)果來看，供試的265株刺五加內(nèi)生放線菌對(duì)5株蘋果病原真菌均有不同程度的抗性，抗菌譜廣，抗菌活性強(qiáng)，至少具有1種抗菌活性的占菌株總數(shù)的51.0%。同時(shí)，經(jīng)16S rRNA基因序列檢測(cè)進(jìn)行菌株初步鑒定顯示，抗菌活性強(qiáng)的菌株均為鏈霉菌屬菌株，與文獻(xiàn)報(bào)道相符。

目前，已有的基因組研究表明，一個(gè)菌株的基因組決定其次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生潛能，因此，采用特定基因片段進(jìn)行分子篩選，可充分揭示菌株合成代謝產(chǎn)物產(chǎn)生潛能，預(yù)測(cè)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類型以利于后期活性產(chǎn)物的分離提取。本試驗(yàn)中檢測(cè)的幾種功能基因是放線菌中常見的較重要的次級(jí)代謝產(chǎn)物合成相關(guān)基因，分別負(fù)責(zé)編碼產(chǎn)生非核糖體聚肽類化合物、聚酮類化合物、含鹵素成分化合物及多烯類化合物等。目前，已知的聚酮類化合物由PKSⅠ、PKSⅡ基因控制合成，已超過1 000種，具有廣泛的抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗病原生物和免疫抑制等生物活性，且已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)等，具有重要開發(fā)價(jià)值。非核糖體含硫多肽類抗生素是多肽類抗生素的一個(gè)重要家族，由NRPS基因指導(dǎo)合成，具有較強(qiáng)抗菌活性。多烯類化合物是由CYP基因合成的重要藥物先導(dǎo)化合物，主要對(duì)真菌具有抑制作用[24]。本研究中強(qiáng)活性菌株功能基因的檢測(cè)結(jié)果提示，這些菌株具有產(chǎn)生多種活性化合物的潛能，是篩選天然產(chǎn)物或研制生防菌劑的重要菌源。但在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)有9株活性較好的菌株未檢測(cè)到這些功能基因，可能與擴(kuò)增體系、條件及引物等有關(guān)。也可能這些菌株具有未檢測(cè)到的其他功能基因。

本試驗(yàn)只是刺五加內(nèi)生放線菌室內(nèi)抑菌活性的初步結(jié)果，對(duì)于其中活性強(qiáng)、有潛力的菌株，還需進(jìn)一步進(jìn)行活體接種和大田試驗(yàn)來驗(yàn)證其抑菌作用。本研究所得初步結(jié)果可為這些菌株的實(shí)際應(yīng)用奠定一定基礎(chǔ)，也為明確刺五加內(nèi)生放線菌在防控蘋果病害發(fā)生和流行中的潛力提供更為詳實(shí)的依據(jù)。

Reference：

[1] 張偉敏,魏 靜,施瑞誠(chéng),等.Noni果的活性成分和生理功能的研究進(jìn)展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2007,19(6):1087-1091．

ZHANG W M,WEI J,SHI R CH.etal.Progress of the study on compounds in noni fruit and their biological activity[J].NaturalProductsResearchandDevelopment,2007,19(6):1087-1091(in Chinese with English abstract).

[2] HIRAZUMI A,FURUSAWA E.An immunomodulatory polysac-charide -rich substance from the fruit juice of Morinda citri-folia(noni) with antitumor activity[J].PhytotherapyResearch,1999,13(15):380-387.

[3] JONES R N.Impact of changing pathogens and antimicrobial susceptibility patterns in the treatment of serious infection in hospitalized patients[J].TheAmericanJournalofChineseMedicine,1996,100:3-12.

[4] BUTLER K M.Enterococcal infection in children [J].SeminarsinPediatricInfectionsDiseases,2006,17(3):128-139.

[5] SEEMA S.Enterococcal infections & antimicrobial resistance[J].IndianJournalMedicalResearch,2008,128:111-121.

[6] 趙 珂.攀西地區(qū)藥用植物內(nèi)生及根際放線菌的多樣性與抗菌活性研究[D].四川雅安:四川農(nóng)業(yè)大學(xué),2010.

ZHAO K.Study on diversity and antibiotic activity of endophytic and rhizospheric actinomycetes from medicinal plants in panxi region [D].Ya’an Sichuan:Sichuan Agricultural University,2010(in Chinese with English abstract).

[7] 朱文勇,李 潔,趙國(guó)振,等.喜樹內(nèi)生放線菌及抗菌活性評(píng)價(jià)[J].微生物學(xué)通報(bào),2010,37(2):211-216.

ZHU W Y,LI J,ZHAO G ZH,etal. Diversity and antimicrobial activities of endophytic actinomycetes isolated fromCamptothecaacuminatadecne [J].MicrobiologyChina,2010,37(2):211-216(in Chinese with English abstract).

[8] 梁 宇,高玉葆.內(nèi)生真菌對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育及抗逆性的影響 [J].植物學(xué)通報(bào),2000,17(1):52-59.

LIANG Y,GAO Y B.Endophytic fungi on plant growth and development and the impact resistance[J].BotanyBulletin,2000,17(1):52-59(in Chinese with English abstract).

[9] BIRO B,MAGYAR K,VARADY G Y,etal.Specific replant disease reduced by rhizobacteria on apple seedlings[J].ActaHorticulture,1998,477:75-81.

[10] 鄧振山,趙立恒,王紅梅.蘋果常見主要真菌性病害的研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2006,34(5):932-933,935.

DENG ZH SH,ZHAO L H,WANG H M.Research advance in common and primary fungi disease[J].JournalofAnhuiAgriculturalSciences,2006,34(5):932-933,935(in Chinese with English abstract).

[11] 楊煒華,劉開啟.蘋果輪紋病菌對(duì)多菌靈甲基硫菌靈的抗藥性測(cè)定[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào),2002, 29(2):191-192.

YANG W H,LIU K Q.Apple ring spot bacteria to carbendazim methyl sulfur bacteria resistance determination of the spirit[J].ActaPhytophylacicaSinica,2002, 29(2):191-192(in Chinese with English abstract).

[12] 張 姝,張永杰,劉慧平.蘋果斑點(diǎn)落葉病菌的分離及其對(duì)殺菌劑的敏感性[J].山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2004,24(4):382-384.

ZHANG SH,ZHANG Y J,LIU H P.Apple leaf spots pathogens separation and sensitivity to the fungicide[J].JournalofShanxiAgriculturalUniversity(NaturalScienceEdition),2004,24(4):382-384(in Chinese with English abstract).

[13] 郭小芳,宗兆鋒.6株放線菌定殖能力測(cè)定及對(duì)蘋果灰霉病控制效果[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2009, 18(5):116-118,136.

GUO X F,ZONG ZH F.Colonized ability of six strains of actinomyces and their control effect of apple diseases[J].ActaAgriculturaeBoreali-occidentalisSinica,2009,18(5):116-118,136(in Chinese with English abstract).

[14] 袁麗杰,章廣玲,張玉琴,等.藥用植物根際放線菌的種群多樣性及生物活性初步研究[J].中國(guó)抗生素雜志,2009,34(8):463-466.

YUAN L J,ZHANG G L,ZHANG Y Q,etal,Preliminary research about population diversity and rhizosphere actinomycetes from medicinal plant[J].ChineseJournalofAntibiotics,2009,34(8):463-466(in Chinese with English abstract).

[15] 朱天驕.南極放線菌藥用資源的調(diào)查及次級(jí)代謝產(chǎn)物研究[D].山東青島:中國(guó)海洋大學(xué),2009.

ZHU T J.Investigation of bioactive metabolites resources in antarctic actinomycetes and study of secondary metabolites produced by two antarctic actinomycetes strains[D].Qingdao Shandong:Ocean University of China,2009(in Chinese with English abstract).

[16] AYUSO-SACIDO A,GENILLOUD O.New PCR primers for the screening of NRPS and systems in actinomycetes:Detection and distribution of these biosynthetic gene sequences in major taxonomic groups[J].MicrobialEcology,2005,49:10-24.

[17] 梁魁景.河北省蘋果再植病害病原真菌的分離鑒定[D].河北保定:河北農(nóng)業(yè)大學(xué),2010.

LIANG K J.Isolation and identification of pathogenic fungi from apple replantation in Hebei province[M].Baoding Hebei:Agricultural University of Hebei,2010(in Chinese with English abstract).

[18] 宋光桃,周國(guó)英.拮抗鏈霉菌F10抗油茶炭疽病菌抑菌機(jī)理的研究[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào),2012,32(8):75-78.

SONG G T,ZHOU G Y.Study on inhibitory mechanism of antagonistic streptomyces F10 toColletotrichumgloeosporioide[J].JournalofCentralSouthUniversityofForestry&Technology,2012,32(8):75-78(in Chinese with English abstract).

[19] 龍建友,胡兆農(nóng),劉京宏,等.秦嶺山區(qū)鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)物殺菌活性的測(cè)定[J].中國(guó)生物防治,2005,21(3):187-191.

LONG J Y,HU ZH N,LIU J H,etal.Fungicidal activity of fermentation products of streptomyces isolated from Qinling mountain area[J].ChineseJournalofBiologicalControl,2005,21(3):187-191(in Chinese with English abstract).

[20] 龍建友.秦嶺鏈霉菌開發(fā)利用的前期基礎(chǔ)研究[D].陜西楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué),2006.

LONG J Y.Basic studies in earlier stage on development of streptomyces Qinlingensis sp.nov[D].Yangling Shaanxi:Northwest A&F University,2006(in Chinese with English abstract).

[21] NEWMAN D J,CRAGG G M,SNADER K M.Natural products as sources of new drugs over the period 1981-2002[J].JournalofNaturalProducts,2003,66:1022-1037.

[22] YASUHIRO I,TAKAKO I,TOMOMITSU SASAKI,etal.Isolation of actinomyectes from live plants and evaluation of antiphytopathogenic activity of their metabolites[J].Actinomycetol,2002,16:9-13.

[23] LI J,ZHAO G Z,CHEN H H,etal.Antitumour and antimicrobial activities of endophytic streptomycetes from pharmaceutical plants in rainforest[J].LettApplyMicrobiology,2008,47(6):574-580.

[24] 陳代杰.微生物藥物學(xué)[M].上海:華東理工大學(xué)出版社,1999.

CHEN D J.Microbial Pharmaceuticals [M].Shanghai:East China University of Science and Technology Press,1999(in Chinese).

(責(zé)任編輯：潘學(xué)燕 Responsible editor:PAN Xueyan)

Antagonism of Endophytic Actinomycetes Isolated fromAcanthopanaxsenticosusto Five Apple Pathogenic Fungi

LIU Aihua1, XU Hongyan1, WANG Bin1, WANG Wei1, ZHOU Bo2and YUAN Lijie1

(1.Hebei Province Key Laboratory on Chronic Diseases/Tangshan Key Laboratory for Preclinical and Basic Research on Chronic Diseases, School of Basic Medical Sciences, North China University of Science and Technology, Tangshan Hebei 063009, China; 2.National Engineering Laboratory for Efficient Utilization of Soil and Fertilizer Resources, College of Life Science, Shandong Agricultural University, Taian Shandong 271018, China)

Using Petri dish confront culture method, the activities of 265 strains of endophytic actinomycetes isolated fromAcanthopanaxsenticosuswere screened withFusariumoxysporum,Fusariumproliferatum,Fusariummoniliforme,Fusariumsolani, andRhizoctoniasolani.These strains displayed a strong anti-fungi activity and a wide spectrum, 51.0% of total showed at least one kind of anti-fungi activity. 38.9% and 48.7% of total strains indicated more inhibitory activity toFusariumsolaniandFusariummoniliforme. 23.4%, 31.7% and 28.7% of the total strains showed inhibition toFusariumoxysporum,Fusariumsolani,Rhizoctoniasolanirespectively. The functional genes screening forPKSⅠ,PKSⅡ,NRPS,Helo,CYPsuggested that the strong active strains had at least one active metabolites synthase gene. Strains were analyzed phylogenetic diversity and showed that these strains belong to the genusStreptomyces.

Endophytic actinomycetes；Apple pathogenic fungi；Antagonistic effect；Biological control

LIU Aihua, female, master postgraduate.Research area:the isolation, identification and activity of actinomycetes.E-mail：643961437@qq.com

YUAN Lijie, female,Ph.D,professor,master supervisor.Research area:the isolation, identification and activity of actinomycetes. E-mail：yuanlijie1970@163.com

2015-09-20

2016-01-22

河北省自然科學(xué)基金(C2014209137)；“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2011BAD11B01)。

劉愛華，女，學(xué)士，研究方向?yàn)槲⑸锓蛛x鑒定及次級(jí)代謝產(chǎn)物。E-mail：643961437@qq.com

袁麗杰，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)槲⑸锓蛛x鑒定及次級(jí)代謝產(chǎn)物。E-mail：yuanlijie1970@163.com 周 波，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)槲⑸镔Y源與功能型生物肥料。E-mail：zhoubo2798@163.com

日期：2016-12-20

Q939.96

A

1004-1389(2017)01-0094-07

ZHOU Bo, male, Ph.D,professor,master supervisor.Research area:the microbial resources and biological fertilizer.E-mail：zhoubo2798@163.com

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20161220.1645.024.html

Received 2015-09-20 Returned 2016-01-22

Foundation item Natural Science Foundation of Hebei Province(No.C2014209137); Key Projects in the National Science and Technology Pillar Program during the Twelfth Five-year Plan Period (No.2011BAD11B01).