朱海霞，馬永強(qiáng)，魏有海，郭青云

(青海省農(nóng)林科學(xué)院/農(nóng)業(yè)部西寧作物有害生物科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站/青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810016)

多孢木霉HZ-31菌株發(fā)酵條件研究

朱海霞，馬永強(qiáng)，魏有海，郭青云

(青海省農(nóng)林科學(xué)院/農(nóng)業(yè)部西寧作物有害生物科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站/青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810016)

選用高效除草活性的生防菌株多孢木霉(Trichodermapolysporum)HZ-31菌株為對(duì)象，研究該菌株最適碳源、氮源、固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)的篩選、固-液發(fā)酵條件的優(yōu)化。結(jié)果表明：HZ-31最適碳、氮源為小麥粉，最適氮源為(NH4)2SO4，在PDA培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量達(dá)6.17×108mL-1，最適碳氮源培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量達(dá)到4.45×109mL-1。HZ-31最佳產(chǎn)孢的固態(tài)基質(zhì)為麥稈糠，適宜的接種量是體積分?jǐn)?shù)為40%。正交優(yōu)化培養(yǎng)試驗(yàn)條件得出該菌最適培養(yǎng)基質(zhì)含水量為37%，最適溫度為23 ℃，發(fā)酵最適時(shí)間為8 d。

多孢木霉HZ-31；固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)；固-液發(fā)酵條件

菌株HZ-31分離于自然感病的大刺兒菜，由青海省農(nóng)科院植保所有害生物綜合防治實(shí)驗(yàn)室提供保存。前期研究結(jié)果顯示，該菌株在PDA平板上培養(yǎng)7 d后，表面產(chǎn)生致密的白色分生孢子，分生孢子梗排列成半球形或墊狀的皰狀物，分生孢子梗有隔膜，通常高度分枝，以2～4個(gè)輪生，直角，分生孢子長(zhǎng)橢圓形或球形，光滑，結(jié)合形態(tài)特征和分子鑒定結(jié)果，判斷菌株HZ-31為多孢木霉(Trichodermapolysporum)。離體條件下測(cè)定其對(duì)禾本科雜草野燕麥種子萌發(fā)的影響，結(jié)果表明經(jīng)該菌發(fā)酵濾液處理后，野燕麥種子發(fā)芽率為0，菌株對(duì)種子萌發(fā)抑制率達(dá)100%；噴施于盆栽野燕麥葉片后可導(dǎo)致葉片發(fā)黃枯萎甚至整株枯死，接種5 d后對(duì)野燕麥的發(fā)病率和病情指數(shù)分別達(dá)到90.0%和82.0。同時(shí)，該菌株對(duì)藜、豬殃殃等農(nóng)田闊葉雜草亦表現(xiàn)出不同程度的除草活性，且對(duì)青海省主栽作物小麥(TriticumaestivumL.)、蠶豆(ViciafabaL.)、豌豆(PisumsativumL.)安全性評(píng)價(jià)結(jié)果表現(xiàn)為安全[1]。生防菌株HZ-31具有開發(fā)成為小麥、蠶豆、豌豆田真菌除草劑的潛力。

碳氮源、基質(zhì)含水量、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度等因素是發(fā)酵過(guò)程中重要的檢測(cè)和控制參數(shù)，可直接影響到菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成[2]。對(duì)菌株HZ-31的發(fā)酵生產(chǎn)工藝來(lái)說(shuō)，明確各因素與菌株發(fā)酵生產(chǎn)之間的關(guān)系，將為該菌的規(guī)?；a(chǎn)和劑型研究提供理論依據(jù)。因此，本研究運(yùn)用單因素法確定生防菌株最適碳、氮源和固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)，正交試驗(yàn)開展最佳基質(zhì)組合篩選和菌株培養(yǎng)條件的優(yōu)化試驗(yàn)，明確固液發(fā)酵條件與菌株發(fā)酵生產(chǎn)之間的關(guān)系，為該菌的大規(guī)模生產(chǎn)提供必要的工藝參數(shù)，控制并改進(jìn)發(fā)酵工藝條件，使其大量繁殖，為實(shí)現(xiàn)生物菌劑的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)及進(jìn)一步的推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

HZ-31多孢木霉(Trichodermapolysporum)分離于自然感病的大刺兒菜，由青海省農(nóng)科院植保所有害生物綜合防治實(shí)驗(yàn)室提供保存。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 最適碳、氮源的確定 以PDA培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行碳氮源單因素試驗(yàn)，用等質(zhì)量的玉米粉(C1)、小麥粉(C2)、蔗糖(C3)、葡萄糖(C4)作為碳源。氮源KNO3(N1)、大豆粉(N2)、酵母膏(N3)、(NH4)2SO4(N4)為氮源，按照質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的添加量，將各碳氮源添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，配制成不同的碳氮源培養(yǎng)基[2-4]，取經(jīng)活化直徑8 mm的菌餅作為接種體接入皿中。以不添加碳氮源的基質(zhì)作為對(duì)照，每處理重復(fù)3個(gè)。血球計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)產(chǎn)孢量，同時(shí)用分光光度計(jì)在600 nm波長(zhǎng)內(nèi)測(cè)孢子懸浮液OD吸光值，確定篩選效果[5]。

1.2.2 固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)篩選 選用菜籽餅、麥稈糠、羊糞、麥麩、珍珠巖和蛭石作為基質(zhì)[4-5]。將不同基質(zhì)500 g高溫滅菌后放入白塑料盤中，接種菌液后20 ℃室內(nèi)培養(yǎng)，觀察記錄菌落生長(zhǎng)狀況；用分光光度計(jì)測(cè)其OD吸光值，確定產(chǎn)孢量高的底物基質(zhì)。每處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.3 最適接菌量的確定 以菜籽餅作為底物，混合營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)加入150 mL三角瓶，每個(gè)處理加入無(wú)菌水20 mL，接基質(zhì)體積分?jǐn)?shù)的10%、20%、40%、60%、80%、100%比例將孢子懸浮液接入培養(yǎng)基中充分混勻培養(yǎng)，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)確定產(chǎn)孢量最高的接菌量。每個(gè)處理重復(fù)3個(gè)。

1.2.4 培養(yǎng)基含水量對(duì)產(chǎn)孢量影響 稱25 g菜籽餅基質(zhì)裝入150 mL三角瓶，加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)混勻，按基質(zhì)體積百分比分別加 10%、20%、30%、40%、50%、60%、80%、100%蒸餾水[6]，培養(yǎng)基滅菌后接種對(duì)應(yīng)的菌株，在恒溫培養(yǎng)箱25 ℃培養(yǎng)菌落，觀察菌絲生長(zhǎng)狀況，第7天測(cè)孢子懸浮液的OD值，結(jié)合菌絲生長(zhǎng)狀況，得出適合該菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基含水量范圍。每個(gè)處理重復(fù)3個(gè)。

1.2.5 培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)孢量的影響 稱取25 g菜籽餅作為基質(zhì)裝入150 mL三角瓶，加入各菌對(duì)應(yīng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基 II營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)混勻，按基質(zhì)體積百分比加水40 mL，滅菌接入相應(yīng)的菌種后，分別在恒溫箱中以15、20、25、30、35 ℃恒溫培養(yǎng)，7 d后測(cè)孢子懸浮液的OD值，結(jié)合菌絲生長(zhǎng)狀況，得出適合該菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)溫度范圍[3]。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.6 二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì) 通過(guò)單因素試驗(yàn)篩選出培養(yǎng)基含水量和培養(yǎng)溫度，再結(jié)合培養(yǎng)時(shí)間這3個(gè)量作為因素，分別取5個(gè)水平，采用二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)，在三角瓶中進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定3株菌的最優(yōu)培養(yǎng)條件[7]。每個(gè)處理重復(fù)3個(gè)。HZ-31培養(yǎng)條件二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)變量水平及編碼見表1。

表1 HZ-31培養(yǎng)條件二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)變量水平及編碼Table 1 Table of orthogonal test of culture conditions of HZ-31

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均采用DPS 6.50進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 HZ-31菌株碳氮源篩選

用血球計(jì)數(shù)法和分光光度計(jì)法測(cè)產(chǎn)孢量及其OD值。對(duì)HZ-31在不同碳氮源培養(yǎng)基的產(chǎn)孢量進(jìn)行計(jì)數(shù)并對(duì)菌懸液的OD值進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表2。由表2可以看出，HZ-31在PDA培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量為6.17×108mL-1；在C2培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量最高(3.03×109mL-1)，孢子懸浮液的OD值與其他碳源之間存在極顯著性差異；在N4培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量最高達(dá)7.53×108mL-1，且其OD值與其他氮源OD值之間存在極顯著性差異；將C2和N4結(jié)合制成最佳培養(yǎng)基，產(chǎn)孢量達(dá)到4.45×109mL-1，最適碳氮源培養(yǎng)基的產(chǎn)孢量和OD值與其他單一碳氮源之間存在顯著性差異。

結(jié)合菌落形態(tài)、菌絲生長(zhǎng)情況、產(chǎn)孢量和OD值，最終篩選結(jié)果：HZ-31最適碳源為小麥粉；最適氮源為(NH4)2SO4。

2.2 HZ-31菌株固態(tài)基質(zhì)篩選

在不同的固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)中加入適量的無(wú)菌水，用小噴壺將過(guò)濾的菌種發(fā)酵液均勻噴灑在基質(zhì)上拌勻，用保鮮膜封口，25 ℃培養(yǎng)。觀察菌落生長(zhǎng)情況，使用分光光度計(jì)法測(cè)定過(guò)濾孢子懸浮液OD值，確定不同基質(zhì)的產(chǎn)孢量。結(jié)果分析可知，HZ-31在麥稈糠上生長(zhǎng)較好，菌落較大，菌絲生長(zhǎng)旺盛。為進(jìn)一步驗(yàn)證該菌在米糠中生長(zhǎng)優(yōu)于其他條件，設(shè)計(jì)試驗(yàn)見表3。

表2 HZ-31在不同碳氮源培養(yǎng)基的產(chǎn)孢數(shù)量及菌懸液OD值Table 2 Spore production quantity and OD of HZ-31 on culture medium of different carbon and nitrogen sources

注：不同大寫字母表示在0.01 水平上差異顯著，不同小寫字母表示在 0.05水平上差異顯著，下表同。

Note:Different uppercase letters in column indicate very significant difference(P<0.01), the different lowercase letters in column indicate significant difference(P<0.05),the same as below.

結(jié)合前面孢子懸浮液孢子濃度和分光光度值存在正比關(guān)系，由表3可以看出：HZ-31生長(zhǎng)較好的固態(tài)基質(zhì)為麥稈糠>珍珠巖>麥麩>羊糞>菜籽餅>蛭石；麥稈糠和其他基質(zhì)之間存在極顯著性差異，羊糞和珍珠巖、菜籽餅、蛭石之間存在顯著性差異，菜籽餅和蛭石之間也存在極顯著性差異。HZ-31最適產(chǎn)孢的固態(tài)基質(zhì)為麥稈糠(圖1，圖2)。

2.3 HZ-31菌株發(fā)酵最適接菌量

由表4可以看出，HZ-31在接種量約為體積分?jǐn)?shù)為40%時(shí)，產(chǎn)孢子量達(dá)到108，過(guò)高或過(guò)低的接種量均導(dǎo)致產(chǎn)孢量下降，菌落長(zhǎng)勢(shì)不好。由此得知，HZ-31的最適接種量約為體積分?jǐn)?shù)為40%。接種量過(guò)低，基質(zhì)中孢子含量太少，菌體生長(zhǎng)菌落少，不能鋪滿基質(zhì)，容易導(dǎo)致污染，且會(huì)延長(zhǎng)其生長(zhǎng)時(shí)間，培養(yǎng)基容易被雜菌污染；而接種量過(guò)多則會(huì)造成固體基質(zhì)含水量過(guò)多，含水量多容易引起細(xì)菌污染，且對(duì)于好氧菌來(lái)說(shuō)，基質(zhì)透氣性變差，這樣會(huì)阻礙菌體在固體發(fā)酵基質(zhì)中的生長(zhǎng)。

表3 菌株在不同固態(tài)基質(zhì)的孢子液吸光值差異顯著性分析Table 3 Analysis of significant difference on spore liquid absorbance value in different solid substrates

圖1 不同底物基質(zhì)的篩選過(guò)程Fig.1 Selection of different solid substrates

接種量Inoculationdose10%20%40%60%80%100%產(chǎn)孢量/(g/mL)Sporeproduction1．31×1061．53×1072．14×1083．27×1071．84×1064．38×105

2.4 HZ-31菌株培養(yǎng)條件正交優(yōu)化試驗(yàn)

固態(tài)基質(zhì)含水量對(duì)產(chǎn)孢量影響的試驗(yàn)結(jié)果表明，HZ-31菌株在培養(yǎng)基含水量60%～100%，菌落長(zhǎng)勢(shì)較好。

該菌的生長(zhǎng)溫度范圍均在20～35 ℃。為下一步的正交試驗(yàn)提供最低和最高溫度標(biāo)準(zhǔn)。培養(yǎng)時(shí)間范圍為3～14 d，14 d后生長(zhǎng)基本處于很緩慢的狀態(tài)。

通過(guò)單因素試驗(yàn)篩選出培養(yǎng)基含水量和培養(yǎng)溫度后結(jié)合培養(yǎng)時(shí)間作為3個(gè)因素，分別取5個(gè)水平，在150 mL三角瓶中加入適合的基質(zhì)進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定該菌株的最優(yōu)培養(yǎng)條件。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

在DPS 6.50數(shù)理統(tǒng)計(jì)分析軟件上進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析，利用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)建立二次回歸模型并對(duì)其進(jìn)行方差分析，進(jìn)而通過(guò)數(shù)據(jù)優(yōu)化程序?qū)ζ涔虘B(tài)發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化。

利用DPS 6.50數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果(表5)進(jìn)行分析，得到HZ-31菌株的培養(yǎng)基含水量(X1)、培養(yǎng)溫度(X2)、培養(yǎng)時(shí)間(X3)與菌株產(chǎn)孢量(Y)的數(shù)學(xué)模型回歸方程為:

Y=8.829 54-1.434 51X1-1.228 82X2-0.018 97X3-0.408 61X12-0.267 19X22-0.779 84X32-0.062 50X1X+20.587 50X1X3+0.412 50X2X3

從回歸方程可看出，培養(yǎng)基含水量(X1)均系數(shù)較大，對(duì)HZ-31產(chǎn)孢量Y值的影響較大，起主要效應(yīng)作用；培養(yǎng)時(shí)間(X3)系數(shù)最小對(duì)產(chǎn)孢量Y值的影響最??；3因素的頻率分布95%分布區(qū)間均在一定范圍內(nèi)呈正態(tài)分布；分析X1X2、X1X3和X2X3的互作效應(yīng)可忽略不計(jì)。

根據(jù)DPS上的處理結(jié)果得固態(tài)發(fā)酵的最適培養(yǎng)條件，HZ-31最適培養(yǎng)基質(zhì)含水量為37%；最適培養(yǎng)溫度為23 ℃；最佳培養(yǎng)時(shí)間為8 d。

3 討 論

從青海省獨(dú)特的氣候生態(tài)條件下篩選出具有強(qiáng)除草活性的生防菌株HZ-31，前期研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)禾本科及幾種闊葉雜草具有較強(qiáng)致病性，本研究采用單因素法篩選出合適的碳氮源、適宜的固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)及最適接種量，同時(shí)運(yùn)用正交試驗(yàn)開展菌株培養(yǎng)條件的優(yōu)化試驗(yàn)，確定該菌株各項(xiàng)技術(shù)工藝參數(shù)指標(biāo)，旨在獲得一株發(fā)酵時(shí)間適中、產(chǎn)孢量高的優(yōu)良菌種，為該菌株的規(guī)?；a(chǎn)發(fā)展提供依據(jù)。

研究表明，碳氮源、發(fā)酵時(shí)間、接種量、培養(yǎng)時(shí)間等因素對(duì)菌株HZ-31分生孢子的生產(chǎn)均有明顯的影響。HZ-31最適碳源為小麥粉，最適氮源為(NH4)2SO4，在PDA培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量達(dá)到6.17×108mL-1時(shí)，最適碳源培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量達(dá)到3.03×109mL，最適氮源培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量達(dá)到7.53×108mL-1。小麥粉和(NH4)2SO4分別作為補(bǔ)充碳氮源，優(yōu)化了固態(tài)培養(yǎng)基，促進(jìn)了菌株的產(chǎn)孢量。固態(tài)發(fā)酵需要有合適的接種量，而發(fā)酵液接種量的多少與菌株的生長(zhǎng)周期有關(guān)。本研究中HZ-31最適宜的接種量是體積分?jǐn)?shù)為40%。如果接種量過(guò)大，菌體生長(zhǎng)過(guò)快，就會(huì)造成溶解氧不足或者營(yíng)養(yǎng)成分的過(guò)度消耗，不利于發(fā)酵產(chǎn)物的累積。如果接種量過(guò)小，則會(huì)延長(zhǎng)培養(yǎng)周期，產(chǎn)孢量減少，雜菌污染的可能性也更大。另外，通過(guò)正交試驗(yàn)篩選出該菌株最適培養(yǎng)基質(zhì)含水量均為37%，最適培養(yǎng)溫度為23 ℃，最佳培養(yǎng)時(shí)間為8 d。對(duì)于菌株HZ-31的發(fā)酵生產(chǎn)工藝來(lái)說(shuō),明確各因素與菌株發(fā)酵生產(chǎn)之間的關(guān)系, 將為該菌的規(guī)?；a(chǎn)和劑型研究提供理論依據(jù)。

表5 正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 5 Scheme and results of design experiment of quadratic orthogonal rotation

生防菌的固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)的選取一般都是價(jià)格低廉、容易獲得的農(nóng)副產(chǎn)品下腳料，既節(jié)約了生產(chǎn)成本，又符合現(xiàn)代可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略[8]。本研究中篩選出的生防菌株HZ-31最適產(chǎn)孢固態(tài)基質(zhì)麥稈糠，更適用于大批量生產(chǎn)，方便菌劑儲(chǔ)存和運(yùn)輸。除了以上生防菌劑固態(tài)發(fā)酵的影響因素之外，適宜的助劑在很大程度上也影響制劑的生物活性和穩(wěn)定性，因此，下一步有必要對(duì)該菌的載體助劑進(jìn)行篩選，為該菌株劑型的制備提供基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯：史亞歌 Responsible editor:SHI Yage)

Study on Culture Conditions ofTrichodermapolysporumHZ-31

ZHU Haixia, MA Yongqiang,WEI Youhai and GUO Qingyun

(Qinghai Academy of Agricultural and Forestry Sciences/Scientific Observing and Experimental Station of Crop Pest in Xining, Ministry of Agriculture of P.R.China/Key Laboratory of Agricultural Integrated Pest Management in Qinghai Province,Xining 810016，China)

The potential bioherbicide strainsTrichodermapolysporumHZ-31 can cause high virulence to weeds, we selectedTrichodermapolysporumHZ-31 as potential strain to study the optimum carbon, nitrogen sources, optimum solid substrate, optimization of culture conditions.The results showed that the optimal carbon is wheat flour,the optimum nitrogen is (NH4)2SO4for HZ-31,the number of spore production on optimum carbon and nitrogen culture medium was 4.45×109mL-1, and was 6.17 ×108mL-1on PDA . The optimum substrate was wheat bran,the optimum inoculum was 40% volume fraction,the orthogonal test showed that the optimum initial moisture content of HZ-31 was 37%, the optimal temperature was 23 ℃ and the optimal cultural time was 8 d.

TrichodermapolysporumHZ-31;Soild substrate;Soild-liquid culture conditions

ZHU Haixia,female, associate research fellow.Research area:biological control of weeds. E-mail：zhuhaixia0101@163.com

GUO Qingyun, female, research fellow. Research area:integrated management of farmland weeds. E-mail：guoqingyunqh@163.com

2015-07-22

2015-08-27

國(guó)家自然科學(xué)基金(31560518)；青海省農(nóng)科院“高原特色作物生物技術(shù)育種”團(tuán)隊(duì)創(chuàng)新能力提升專項(xiàng)(2014- NKY-206)。

朱海霞，女，副研究員，主要從事雜草生物防治研究。E-mail：zhuhaixia0101@163.com

郭青云，女，研究員，主要從事農(nóng)田雜草綜合治理研究。E-mail：guoqingyunqh@163.com

日期：2016-12-20

S451.1

A

1004-1389(2017)01-0132-05

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20161220.1645.032.html

Received 2015-07-22 Returned 2015-08-27

Foundation item National Natural Science Foundation of China(No.31560518);Special Fund for Innovation Promotion of Research Team in “Biotechnology Breeding for Special Crops in Tibet and Qinghai Plateau” ，Qinghai Academy of Agricultural and Forest Sciences (No.2014- NKY-206).