趙 靜，吳俊清，李慶飛，張 靜，張魯剛

(1.西北農(nóng)林科技大學 園藝學院，農(nóng)業(yè)部西北地區(qū)園藝作物生物學與種質(zhì)資源創(chuàng)新重點實驗室，陜西楊凌 712100；2.山西農(nóng)業(yè)大學 園藝學院，山西太古 030800)

基于真空滲入法的轉(zhuǎn)基因大白菜植株的獲得

趙 靜1，吳俊清1，李慶飛1，張 靜2，張魯剛1

(1.西北農(nóng)林科技大學 園藝學院，農(nóng)業(yè)部西北地區(qū)園藝作物生物學與種質(zhì)資源創(chuàng)新重點實驗室，陜西楊凌 712100；2.山西農(nóng)業(yè)大學 園藝學院，山西太古 030800)

采用真空滲入法，將蘿卜 VPE1基因的干擾載體pRNAi- RsVPE1轉(zhuǎn)入大白菜中，共收獲2 414粒種子，在質(zhì)量濃度為30 mg/L的卡那霉素篩選下獲得抗性株297株，其中9株經(jīng)PCR檢測呈陽性，轉(zhuǎn)化率為0.37%。Real-time PCR檢測結(jié)果表明，pRNAi- RsVPE1的轉(zhuǎn)入導致轉(zhuǎn)基因大白菜葉片中同源的BraVPE在RNA水平上的表達量下降，驗證了轉(zhuǎn)基因植株的可靠性，為進一步深入研究BraVPE基因功能奠定了基礎。

真空滲入法；大白菜；BraVPE轉(zhuǎn)基因；RNAi載體

大白菜[BrassicacampestrisL．spp．pekinensis(Lour.) Olsson](AA，2n=20) 屬于十字花科蕓薹屬白菜種，原產(chǎn)中國，有著悠久的栽培歷史[1]。因其產(chǎn)量高、營養(yǎng)豐富及其食用方法的多樣性深受中國及世界人民的喜愛。近年來，利用轉(zhuǎn)基因技術，將外源目的基因轉(zhuǎn)入到植物體內(nèi)可以更快、更直接地進行目標性狀的改良。轉(zhuǎn)基因技術與常規(guī)育種技術相結(jié)合，不僅可以縮短育種周期、穩(wěn)定后代選擇，而且可以增強育種目的性，提高育種效率。隨著生物技術的飛速發(fā)展與運用，已出現(xiàn)多種植物轉(zhuǎn)基因技術[2]，且其在植物育種方面的應用也日益廣泛，并取得很大進展[3]。

目前，在大白菜上研究較多的遺傳轉(zhuǎn)化是基于組織培養(yǎng)技術的葉盤轉(zhuǎn)化法，雖然許多研究者用此方法得到了轉(zhuǎn)基因植株[4-6]，但由于大白菜的脫分化與再分化較困難、轉(zhuǎn)化率低、農(nóng)桿菌感染效果差、感染后不易分化且受基因型的影響較大等缺點限制了該技術的普及[7-9]。因此，探索不依賴于組織培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化方法一直是相關領域的研究重點以及熱點。非組織培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因技術是對活體植株的受體細胞直接進行基因轉(zhuǎn)化，然后經(jīng)植株正常的生長發(fā)育，最終獲得轉(zhuǎn)基因植株[10]。植株原位真空滲入法避開了組織培養(yǎng)的過程，具有操作簡單，實用性強的優(yōu)點，目前該法已在擬南芥[11]、油菜[12]、甘藍型油菜[13]、芥菜[14]和不結(jié)球白菜[15]上進行了嘗試，并獲得了成功。

大白菜基因組測序工作于2011年完成，后基因組學時代急需建立簡單高效的轉(zhuǎn)基因技術體系，以此來探索基因的功能。本研究旨在利用真空滲入法將RNA干擾載體pRNAi- RsVPE1轉(zhuǎn)入大白菜，通過卡那霉素篩選以及PCR的進一步檢測獲得轉(zhuǎn)基因植株,以此建立基于真空滲入法的大白菜原位轉(zhuǎn)化體系,為進行大白菜的遺傳改良好基因功能驗證提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 本試驗所用的大白菜轉(zhuǎn)化受體為92S105純系和雄性不育系94C9，由西北農(nóng)林科技大學園藝學院大白菜課題組提供。

1.1.2 菌株與載體 根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株為GV3101，由旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室保存并提供。RNA干擾載體pRNAi- RsVPE1(含NPT基因)由西北農(nóng)林科技大學園藝學院大白菜課題組構(gòu)建保存。

1.1.3 培養(yǎng)基 用于培養(yǎng)農(nóng)桿菌以及大腸桿菌的LB 培養(yǎng)基：酵母提取物5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，調(diào)至pH為7.0，如果是固體培養(yǎng)基，1 L的體積中還應加入瓊脂15 g。

1.1.4 試劑 RNA提取試劑盒，卡那霉素(Kanamycin)、利福平(Rifampicin)、硫酸慶大霉素(Gentamicin)、乙酰丁香酮(Acetosyringone)為OMEGA公司產(chǎn)品；PrimeScriptTM一鏈cDNA合成試劑盒和SYBR GREEN I染料為TaKaRa公司產(chǎn)品；大腸桿菌感受態(tài)Top10為天根生化科技有限公司；DNA Marker DL2000由西安沃爾森生物技術公司進口分裝，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方 法

1.2.1 大白菜的遺傳轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)化植株的準備：大白菜種子浸種、催芽之后待培養(yǎng)皿中2/3的種子露白時，在培養(yǎng)皿中加入4～5 mL質(zhì)量分數(shù)為20%的聚乙二醇，將培養(yǎng)皿置于4 ℃冰箱。光照培養(yǎng)30 d后，播種于西北農(nóng)林科技大學科研溫室，待其開始抽薹開花時即可進行遺傳轉(zhuǎn)化。

轉(zhuǎn)化液的制備：挑取含有目的基因載體的農(nóng)桿菌GV3101單個菌落，接種于2 mL含有50 mg/L利福平(Rif)，50 mg/L硫酸慶大霉素(Gen)和50 mg/L卡那霉素(Kan)的LB液體培養(yǎng)基中，于28 ℃ 180 r/min下培養(yǎng)過夜。將培養(yǎng)過夜的農(nóng)桿菌菌液以1∶100稀釋于500 mL大瓶培養(yǎng)基中，再在28 ℃ 180 r/min條件下培養(yǎng)至OD600約為0.8。然后在4 ℃ 5 000 r/min離心3 min，收集菌體，將菌體懸浮于當天配制的轉(zhuǎn)化緩沖液中。轉(zhuǎn)化緩沖液配置如下：MS粉2.236 g，蔗糖50.0 g，Silwet L-77 1 mL，乙酰丁香酮(As) 1 mL，將以上試劑混勻。用1 mol/L的NaOH調(diào)至pH約為5.8，定容至1 L。

遺傳轉(zhuǎn)化：先將配置好的轉(zhuǎn)化緩沖溶液置于冰上3～4 h。因為轉(zhuǎn)化緩沖液中加入As的作用原理是：As可誘導農(nóng)桿菌Vir基因活化，從而促進外源基因的整合[16]。在轉(zhuǎn)化進行的當天盡量使轉(zhuǎn)化植株處于失水萎蔫的狀態(tài)，轉(zhuǎn)化前必須去掉轉(zhuǎn)化植株上的果莢和當天開的花，用已消毒的鑷子對當天長至最終大小的花蕾進行剝蕾，用保鮮膜固定好營養(yǎng)缽中的基質(zhì)，以防其松散落入轉(zhuǎn)化液中。將轉(zhuǎn)化液倒入真空干燥器中(20 L)，然后將處理好的轉(zhuǎn)化植株倒置放入真空干燥器，盡可能使更多的花序浸入到轉(zhuǎn)化液中，進行真空滲入處理。對轉(zhuǎn)化植株進行真空滲入處理可以增加植株的轉(zhuǎn)化率[17-19]。

試驗采用的真空滲入轉(zhuǎn)化參數(shù)為：0.07 MPa、7 min +5 min，抽真空后觀察到植株葉片表面呈現(xiàn)水漬狀。由于濕潤的柱頭不利于花粉的萌發(fā)以及花粉管的伸長，因此必須立即將吹風機調(diào)至冷風擋將花蕾柱頭吹干，然后對其進行授粉。將植株置于黑暗條件下[11]生長2 d之后移至正常環(huán)境生長，直到正常結(jié)籽。

1.2.2 抗卡那霉素質(zhì)量濃度篩選 首先對大白菜種子進行消毒，具體的做法是：用體積分數(shù)為70%的酒精浸泡30 s,用蒸餾水沖洗1遍，體積分數(shù)為12.5%的次氯酸鈉沖洗10 min，蒸餾水沖洗3～5遍，然后將消毒的種子放到質(zhì)量濃度分別為0、10、20、30、40和50 mg/L的帶有卡那霉素溶液的培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿中20粒種子，每個處理重復3次。置于12 h的光照培養(yǎng)間，第7天時，根據(jù)幼苗子葉的顏色以及新葉的生長狀況，確定適宜的卡那霉素質(zhì)量濃度。將真空滲入處理得到的T0種子消毒后播種于卡那霉素溶液中，萌發(fā)后觀察子葉顏色及新葉生長狀況，進行抗性篩選。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測 將經(jīng)過卡那霉素抗性篩選得到的植株種植于溫室，待植株長至7～8片葉，用改良的CTAB法[20]分別提取轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因植株的總DNA，以未轉(zhuǎn)基因植株的DNA為陰性對照，質(zhì)粒DNA 檢測為陽性的為陽性對照，并以其為模板進行PCR擴增。RNA干擾載體pRNAi- RsVPE1序列引物(F:5′- GGGATTGGCTGAGACGAAA -3′和R:5′- CGAGATTTTCAGGAGCTAAGGA -3′)和篩選標記基因NPTⅡ引物(F：5′-GGCGATACCGTAAAGCAC-3′和R：5′-GACCACCAAG-CGAAACAT-3′)由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。PCR擴增體系：基因組DNA 1 μL,2×TaqMasterMix 5 μL,Primer 0.5 μL，ddH2O 3.5 μL。PCR 反應程序：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s(NPTⅡ：58 ℃)，72 ℃延伸1 min，28 次循環(huán)(NPTⅡ：32)；72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物用質(zhì)量濃度為15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因植株的Real-time PCR檢測 分別以轉(zhuǎn)基因植株(Tr)及未轉(zhuǎn)基因植株(CK)的葉片為材料。采用Bioflux公司Biozol試劑提取總RNA；反轉(zhuǎn)錄用Takara公司的 PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit；熒光定量PCR按照Takara公司的SYBR○RPremix ExTaqTMI熒光染料說明書進行。以大白菜 EF-1-α基因(GO479260)為內(nèi)參基因，分析了與 RsVPE1基因同源性最高的基因BraVPE的表達水平。 EF-1-α內(nèi)參基因引物(F:5′- ATACCAGGCTTGAGCATACCG-3′,R:5′- GCCAAAGAGGC-CA TCAGACAA-3′)；目的基因熒光定量引物為(BraVPEF:5′- GACTGCTGGTGGTGCG-TCTGCT-3′,BraVPER:5′- GGTGCCTTTCGGTACTTATCCC-3′)。擴增條件為：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，62 ℃退火并延伸30 s，40個循環(huán)。每個樣品設3次生物學重復。用 2-△△CT法獲得目標基因的相對表達量。

2 結(jié)果與分析

2.1 卡那霉素抗性質(zhì)量濃度篩選

利用標記基因?qū)Υ罅哭D(zhuǎn)基因后代進行鑒定、篩選,是一種經(jīng)濟簡便的方法[21]。本試驗所用的載體中含有卡那霉素抗性的標記基因，因此試驗中需要篩選適宜的卡那霉素質(zhì)量濃度，以此來對轉(zhuǎn)基因得到的種子進行篩選。在預試驗中將卡那霉素的質(zhì)量濃度設置為0、50、100、150、200和250 mg/L時，結(jié)果只有0 mg/L的條件下的幼苗為綠色，其余質(zhì)量濃度下幼苗全部黃化。因此在正式試驗時，將抗生素質(zhì)量濃度梯度設置為0、10、20、30、40和50 mg/L(圖1)，處理第7天時，大白菜幼苗的子葉顏色、生長點和根的伸長等都表現(xiàn)不同程度抑制，具體表現(xiàn)為，隨著卡那霉素質(zhì)量濃度的遞增，大白菜幼苗子葉的顏色從綠色到淺綠、黃綠、黃色，直至白化。當培養(yǎng)基中無卡那霉素時，子葉顏色為正常的綠色，當卡那霉素質(zhì)量濃度為10 mg/L 時，部分幼苗子葉開始變成淺綠色或黃色；當卡那霉素質(zhì)量濃度為20 mg/L 時，大部分幼苗子葉顏色黃化，部分子葉開始白化；卡那霉素增加至 30 mg/L 以上時，幼苗表現(xiàn)相似，大約3/4的幼苗子葉白化，幼苗生長點無新葉長出。因此該試驗中將卡那霉素30 mg/L設定為篩選轉(zhuǎn)基因大白菜種子的適宜質(zhì)量濃度。

取單個幼苗進一步觀察發(fā)現(xiàn)，卡那霉素對幼苗生長點也有明顯的影響，具體表現(xiàn)為生長點發(fā)紫，且無新葉長出。另外，由于卡那霉素的作用，幼苗根的生長也受到抑制，在0 mg/L的卡那霉素溶液中，大白菜幼苗的主根較長，且須根多；而在30 mg/L的卡那霉素溶液中，幼苗主根短且須根少，如圖2。

2.2 轉(zhuǎn)基因植株的獲得以及PCR檢測

對轉(zhuǎn)化得到的種子進行卡那霉素抗性篩選，具體做法是先對種子進行消毒，然后置于30 mg/L 的卡那霉素溶液，7 d后生長健壯且存活的植株即為抗性植株。本試驗中經(jīng)轉(zhuǎn)化共得到2 414粒種子，卡那霉素抗性篩選得到297株。將經(jīng)過卡那霉素抗性篩選存活的植株移栽至溫室，待其長至7～8片葉，取其葉片提取DNA進行PCR檢測。以未轉(zhuǎn)基因植株的DNA為陰性對照，以檢測為陽性的質(zhì)粒DNA 為陽性對照，結(jié)果共有9株在目的基因pRNAi- RsVPE1和篩選標記基因NPTⅡ2個位點均表現(xiàn)陽性，因此將其確認為轉(zhuǎn)基因植株，其轉(zhuǎn)化效率為0.37%，檢測結(jié)果如圖3所示。

A、B、C、D、E和F 分別代表0 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L、40 mg/L和50 mg/L的卡那霉素。

A，B，C，D，E and F:Kanamycin mass concentration of 0 mg/L,10 mg/L,20 mg/L,30 mg/L,40 mg/L and 50 mg/L.

圖1 抗性卡那霉素適宜質(zhì)量濃度的篩選
Fig.1 Screening of suitable mass concentration of kanamycin with resistance

A，B分別代表在0 mg/L 和30 mg/L的卡那霉素作用下幼苗的生長狀況。

A and B :Growth condition of seedlings under kanamycin mass concentration of 0 mg/L and 30 mg/L.

圖2 卡那霉素對大白菜幼苗的影響
Fig.2 Effect of kanamycin on Chinese cabbage seedlings

2.3 轉(zhuǎn)基因植株的VPE基因表達分析

以轉(zhuǎn)基因植株和未轉(zhuǎn)基因植株葉片的cDNA為模板，進行real-time PCR分析，檢測了與 RsVPE1基因同源性最高的白菜基因BraVPE(Bra011398)的表達水平。由于pRNAi- RsVPE1通過真空滲入法轉(zhuǎn)入大白菜，干擾了大白菜中與其同源的BraVPE基因的表達，從而導致轉(zhuǎn)基因植株中BraVPE基因表達量的下降，其表達量僅為對照植株中表達量的1/10(圖4)。此結(jié)果表明，pRNAi- RsVPE1在轉(zhuǎn)基因植株RNA水平上得到了表達，再次驗證了該試驗中得到的轉(zhuǎn)基因植株的可靠性。

A.NPTⅡ引物檢測 Indentification ofNPTⅡ primers; B.pRNAi- RsVPE1引物檢測 Identification of pRNAi- RsVPE1 primers;M.100 bp Marker;W.模板為水 DNA template is water; -.陰性對照 Negative control;+.陽性對照 Positive control;1～9.獨立的轉(zhuǎn)基因植株 1 to 9.Independent transgenic plants

圖3 轉(zhuǎn)基因植株PCR檢測
Fig.3 Identification of positive transgenic plants by PCR

CK.未轉(zhuǎn)基因植株CK Non-transgenic plants；Tr.pRNAi- RsVPE1 大白菜轉(zhuǎn)基因植株Tr Transgenic plants

圖4 轉(zhuǎn)基因大白菜葉片中BraVPE表達水平
Fig.4 Expression level ofBraVPEin transgenic Chinese cabbage

3 結(jié)論與討論

本試驗利用真空滲入法對已抽薹的大白菜植株進行原位轉(zhuǎn)化，將蘿卜的RNA干擾載體pRNAi- RsVPE1轉(zhuǎn)入大白菜受體植株，經(jīng)過卡那霉素抗性篩選、DNA以及RNA分子水平的檢測，證明pRNAi- RsVPE1載體已經(jīng)成功整合到大白菜的基因組，為進一步深入研究BraVPE基因功能奠定了基礎。

近年來，各國科研工作者對大白菜的遺傳轉(zhuǎn)化進行了一系列的探究，研究最多的是組織培養(yǎng)法[22]，但是該法轉(zhuǎn)化率較低，為0.35%～1.13%，并且影響轉(zhuǎn)化率的各種因素還有待進一步的優(yōu)化[7]。真空滲入法的原理是利用真空處理使受體植株受傷，直接促進農(nóng)桿菌的侵染，不需要組織培養(yǎng)，簡單易行，有效地縮短了培養(yǎng)周期。自Clough等[23]首次在擬南芥上用蘸花法取得成功嘗試之后，該法已在蘿卜[24]、甘藍型油菜[25]以及苜蓿[26]上取得成功。Bechtold等[27]最早將該法運用在蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)上，Trieu等[28]用該法在豆科植物百脈根中獲得2.9%～76%的轉(zhuǎn)化率，Xu等[29]在小白菜上也得到了0.39%的轉(zhuǎn)化率,芥菜的轉(zhuǎn)化率為0.56%[30]，油菜的轉(zhuǎn)化率為11.2%[12]。但在大白菜上應用真空滲入法成功進行遺傳轉(zhuǎn)化的報道很少，本研究獲得9株PCR陽性轉(zhuǎn)基因植株，其轉(zhuǎn)化效率為0.37%，說明應用真空滲入法進行大白菜遺傳轉(zhuǎn)化是可行的。

目前，通過真空滲入法獲得的轉(zhuǎn)化植株的遺傳穩(wěn)定性的研究還不夠，用該方法得到轉(zhuǎn)基因植株的檢測都在基因整合階段，報道最多的就是PCR、PCR- Southern以及Southern。此外基因沉默的發(fā)生在轉(zhuǎn)基因過程中很常見，因此，在轉(zhuǎn)錄以及翻譯水平上的檢測顯得至關重要[9]。

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(責任編輯：潘學燕 Responsible editor:PAN Xueyan)

Obtaining Transgenic Plants of Chinese Cabbage Based on Vacuum Infiltration

ZHAO Jing1,WU Junqing1,LI Qingfei1,ZHANG Jing2and ZHANG Lugang1

(1.College of Horticulture,Northwest A&F University；Key Laboratory of Horticulture Plant Biology and Germplasm Innovation in Northwest China，Ministry of Agriculture of P.R.China，Yangling Shaanxi 712100,China; 2.College of Horticulture,Shanxi Agricultural University,Taigu Shanxi 030800,China)

The vector pRNAi- RsVPE1 was transformed into Chinese cabbage by vacuum infiltration method and total 2 414 seeds were obtained.The kanamycin concentration 30 mg/L was determined to be the most suitable for selecting transgenic plants.297 transgenic plants resistant to kanamycin were obtained,of which 9 positive transgenic plants were verified by PCR detection,and the transgenic rate was 0.37%.RT-PCR detection showed that the expression level ofBraVPEin transgenic plants decreased significantly,reliability of transgenic plants was verified.Therefore ,the above results laid a foundation for further study inBraVPEgene functions.

Vacuum infiltration; Chinese cabbage;BraVPE; Genetic transformation; RNAi vector

ZHAO Jing,female,master.Research area:vegetable genetics and breeding,biotechnology.E-mail:ZhaoJing7_16@126.com

ZHANG Lugang,male,professor,Ph.D,doctoral supervisor.Research area:biotechnology of vegetable genetic breeding.E-mail:lugangzh@163.com

日期：2016-12-29

網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20161229.1008.026.html

2016-03-28

2016-04-25

國家科技支撐計劃(2012BAD02B015)；西北農(nóng)林科技大學唐仲英育種基金；陜西省蔬菜產(chǎn)業(yè)體系。

趙 靜，女，碩士，研究方向為蔬菜遺傳育種與生物技術。E-mail:ZhaoJing7_16@126.com

張魯剛，男，教授，博士，博士生導師，主要從事蔬菜生物技術與遺傳育種研究。E-mail:lugangzh@163.com

S634.1

A

1004-1389(2017)02-0248-07

Received 2016-03-28 Returned 2016-04-25

Foundation item National Science and Technology Support Program (No.2012BAD02B015);Cyrus Tang Breeding Foundation of Northwest A&F University；Vegetable Industry System of Shaanxi Province.