劉倩，吳雪，祁磊，何俊儒，劉彬，黃占波

(遼寧科技學(xué)院 生物醫(yī)藥與化學(xué)工程學(xué)院，遼寧 本溪 117000)

遼寧產(chǎn)山里紅中總黃酮的含量測定

劉倩，吳雪，祁磊，何俊儒，劉彬，黃占波

(遼寧科技學(xué)院 生物醫(yī)藥與化學(xué)工程學(xué)院，遼寧 本溪 117000)

〔目的〕測定遼寧產(chǎn)山里紅中總黃酮的含量?！卜椒ā巢捎梅止夤舛确?，以蘆丁為對照品，應(yīng)用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉進(jìn)行顯色反應(yīng)，在510nm波長處測定鮮品山里紅中總黃酮的含量?！步Y(jié)果〕不同產(chǎn)地山里紅新鮮果實(shí)樣品中總黃酮含量為0.40% ～ 1.81%，含水量為72% ～ 76%?！步Y(jié)論〕該研究可用于山里紅的質(zhì)量控制，為山里紅資源的綜合應(yīng)用提供參考。

山里紅；總黃酮；可見分光光度法；含量測定

山里紅Crataegus pinnatifida Bge. Var. major N.E.Br.為薔薇科山楂屬果樹的果實(shí)，又稱北山楂，是中國藥典收載的山楂藥材兩個(gè)來源品種之一〔1〕，被稱為仙果，在我國北方廣泛栽培，是天然的綠色、有機(jī)食品，是重要的藥食同源植物。整個(gè)遼寧地區(qū)分布有大量的野生和栽培的山里紅植物資源，被譽(yù)為東北野果中的珍品，其特點(diǎn)是個(gè)頭小，果肉薄，發(fā)紅發(fā)軟，表面鮮紅色至紫紅色，有光澤，口味甜酸略帶苦，口感優(yōu)于山楂，野生居多〔2〕。山里紅含有多種生物活性物質(zhì)，其中，黃酮類化合物是其發(fā)揮有效作用的主要活性成分，含量較高，具有抗氧化、預(yù)防心腦血管疾病、降脂、消炎、防衰老、抗癌等生物活性〔3〕，有較高的藥用和保健價(jià)值。遼寧地區(qū)山楂種植面積和野生山里紅的產(chǎn)量比較大，除了具有食用價(jià)值外，可以廣泛用于醫(yī)藥和保健領(lǐng)域。為了明確遼寧地區(qū)山里紅中黃酮類化合物含量及其品質(zhì)、更好地綜合利用山里紅植物資源，逐漸拓寬其深加工途徑，本試驗(yàn)以遼寧地區(qū)山里紅為研究對象，采用可見分光光度法，對不同來源山里紅中總黃酮的含量進(jìn)行了測定，旨在為深入開發(fā)山里紅產(chǎn)品提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)和技術(shù)支持。

1 儀器與材料

1.1 儀器

T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)；KQ-300VBD型三頻數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；CPA225D微量電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)；RE52-99型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；SHZ-CB型循環(huán)水式多用真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)。

1.2 材料

蘆丁對照品(批號：16091901)購自天津月牙湖科技有限公司；乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁均為國產(chǎn)分析純，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

山里紅樣品均于2016年10～11月果實(shí)成熟期采集自遼寧東部地區(qū)，4℃冷藏，實(shí)驗(yàn)前去核，果肉搗碎備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

取新鮮山里紅，去核，果肉打碎，稱取2.0g，置于100mL錐形瓶中，加60%乙醇40mL，300W超聲提取2次，每次30min，過濾，合并濾液，減壓濃縮，以60%乙醇溶解并定容至25mL，作為供試品溶液。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取蘆丁對照品5mg，用60%乙醇溶解并定容至50mL，制得濃度為0.1mg/mL的對照品溶液。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL蘆丁對照品溶液，分別置于10mL容量瓶中，加60%乙醇至5ml，各加5%亞硝酸鈉溶液0.3mL，搖勻，放置6min后再各加10%硝酸鋁溶液0.3mL，搖勻，放置6min后再加4%氫氧化鈉溶液4.0mL，最后加60%乙醇至刻度，搖勻，放置15min；以蒸餾水做空白，在510nm波長處測定吸光度值〔4〕。以對照品溶液濃度(mg/mL)與吸光度(A)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程A=12.29C+0.001，R2=0.9993，結(jié)果表明蘆丁在0.01～0.05mg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 方法學(xué)考察

（14）這興旺的景色使人聯(lián)想到，喀麥隆政府在強(qiáng)調(diào)以農(nóng)業(yè)為基礎(chǔ)，執(zhí)行“綠色革命”政策中取得的可喜成就。（1978·《人民日報(bào)》）

1)精密度試驗(yàn)

精密吸取同一對照品溶液，按2.3項(xiàng)下方法顯色后重復(fù)測定6次，計(jì)算RSD值，考察其精密度。結(jié)果顯示，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.01%，表明儀器精密度良好。

2)穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，按2.3項(xiàng)下方法顯色后，分別在5、10、15、30、60、90min測定吸光度，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果顯示吸光度隨時(shí)間呈逐漸減弱趨勢，在30min內(nèi)樣品溶液吸光度降低不顯著，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值為1.57%，到60min時(shí)樣品吸光度值的RSD為3.1%，并且隨著時(shí)間延長持續(xù)降低。結(jié)果表明，供試品溶液充分顯色后在30min內(nèi)較為穩(wěn)定，因此要在反應(yīng)結(jié)束后30min內(nèi)完成測定，以免結(jié)果不準(zhǔn)確。

3)重復(fù)性試驗(yàn)

取同一份樣品，按2.1項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，按2.3項(xiàng)下方法顯色后測定吸光度。計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為2.5%，結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

4)加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取9份已知總黃酮含量的山里紅樣品，按2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別按高、中、低的比例加入一定量的蘆丁對照品，按2.3項(xiàng)下方法顯色后測定吸光度，計(jì)算回收率。結(jié)果平均加樣回收率為102.6%，RSD為2.18%，表明方法的準(zhǔn)確率較高，適用于山里紅總黃酮含量的測定。

2.5 總黃酮的含量測定

精密吸取供試品溶液1.0mL，按2.2項(xiàng)下方法顯色后測定吸光度，按下式計(jì)算不同來源山里紅樣品中總黃酮的含量，結(jié)果見表1。

山里紅總黃酮含量(%)=C×V×D× 10-3/W*100%

式中：C為供試品溶液中總黃酮的濃度(mg/mL)；V為供試品溶液的體積(mL)；D為供試品溶液的稀釋倍數(shù)；W為樣品的取樣量(g)。

表1 山里紅鮮品中總黃酮的含量(%)

由表1可知，采集的不同產(chǎn)地山里紅鮮品中總黃酮含量約為0.40% ～ 1.81%，平均含量為0.83%?？傸S酮含量最高的是采集自本溪石橋子鎮(zhèn)的樣品，達(dá)到1.81%，該樣品果實(shí)直徑較大、果皮顏色深紅、果肉較厚、顏色鮮黃；總黃酮含量最低的是本溪小市鎮(zhèn)荒山的樣品，僅為0.40%，該樣品果實(shí)直徑小、果肉很薄。不同來源山里紅中總黃酮含量存在較大差異，可能是與山里紅的品種和生長環(huán)境有關(guān)，山里紅分為栽培類型和非栽培類型，沒有經(jīng)過栽培的野生山里紅總黃酮含量相對較低，經(jīng)過栽培之后任其自然生長的山里紅總黃酮含量相對較高；同時(shí)，生長在土質(zhì)肥沃環(huán)境的山里紅其果肉較厚、顏色較深，總黃酮含量相對較高；反之，總黃酮含量相對較低。

另外，本實(shí)驗(yàn)采用中國藥典中的烘箱法測定新鮮山里紅中的水分，不同來源山里紅的含水量在72～76%范圍內(nèi)。

3 討論

本研究首先通過預(yù)實(shí)驗(yàn)考察了山里紅總黃酮供試品溶液的制備工藝，采用單因素實(shí)驗(yàn)考察了提取方法以及提取溶劑、溶劑用量、提取時(shí)間等影響測定結(jié)果的因素，最終確定采用超聲提取法，用60%乙醇為提取溶劑提取30min，此條件下測得的總黃酮含量較高。

采用分光光度法測定山里紅總黃酮的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，顯色反應(yīng)完成后，供試品溶液的吸光度值會隨顯色時(shí)間的變化而呈逐漸降低趨勢，15min內(nèi)變化不顯著，吸光度值較為穩(wěn)定，30min后供試品溶液的吸光度值下降明顯，因此應(yīng)嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，盡量在顯色反應(yīng)完成后15min內(nèi)測定供試品溶液的吸光度值，以免影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

〔1〕 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典一部〔S〕.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：29.

〔2〕 劉波.野生山里紅與山楂復(fù)合果酒的優(yōu)化工藝〔J〕.食品研究與開發(fā)，2015，36(8)：61-64.

〔3〕 沈燕琳，董文軒，李鮮，等.山楂酚類物質(zhì)及其生物活性研究進(jìn)展〔J〕.園藝學(xué)報(bào)，2013，40(9)：1691-1700.

〔4〕 黃優(yōu)生，謝明勇，張中偉，等.山楂總黃酮的測定〔J〕.南昌大學(xué)學(xué)報(bào)(理科版)，2006,30(5)：473-477.

Determining the Total Content of Ketone in Crataegus pinnatifida at Liaoning Provincial

LIU Qian; WU Xue; QI Lei; HE Jun-ru; LIU Bin; HUANG Zhan-bo

(SchoolofBiomedicineandChemicalEngineering,LiaoningInstituteofScienceandTechnology,Benxi,Liaoning, 117004,China)

[Purpose]: To determine the total content of ketone in crataegus pinnatifida;[Method]: To use the spectrophotometry, take rutin as the contrast material,and use sodium nitrite-aluminium nitrate-sodium hydroxide to make developing reaction, and to determine the total content of ketone at wave length 510 mm; [Result〗; Total content of ketone in various sample of new crataegus pinnatilida is within 0.40%～1.81%, water content is within 72%～76%; [Conclusion]:The results can be used to control the quality of crataegus pinnatifida, and provide reference for comprehensive utilization of crataegus pinnatifida.

Crataegus pinnatifida；Total ketone；Visible spectrophotometry； Content determining

10.3969/j.issn.1008-3723.2017.01.008

(j)cnki 1008-3723 2017.01.008

2016-12-03

項(xiàng)目來源：遼寧省大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目(201611430016).

劉倩(1993-)，女，遼寧撫順人，遼寧科技學(xué)院生物醫(yī)藥與化學(xué)工程學(xué)院學(xué)生.

R284

A