陳秋霞，趙蘇瑛

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬江蘇省中醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 南京 210029)

鮑曼不動(dòng)桿菌中耐消毒劑基因qacEΔ1-sul1和Ⅰ類(lèi)整合酶的攜帶情況調(diào)查

陳秋霞，趙蘇瑛

(南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬江蘇省中醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 南京 210029)

目的 調(diào)查分析我院臨床分離的鮑曼不動(dòng)桿菌菌株中耐藥基因的分布情況及部分多重耐藥株的流行病學(xué)特點(diǎn)。方法收集2016年1～6月我院院內(nèi)分離的150株鮑曼不動(dòng)桿菌，MIC法測(cè)定其對(duì)抗生素的敏感性；將對(duì)三類(lèi)以上抗生素耐藥的菌株定義為多重耐藥菌，運(yùn)用PCR法檢測(cè)qacEΔ1-sul1和intI 1基因在所分離菌株中的分布，并用PFGE法對(duì)其中多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌進(jìn)行分子分型。結(jié)果鮑曼不動(dòng)桿菌敏感率排行前三的藥物為妥布霉素(50.0%)、慶大霉素(44.2%)和亞胺培南(42.4%)；84株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌中排行前三的藥物為美羅培南(33.3%)、頭孢哌酮(33.3%)和左氧氟沙星(13.1%)；qacEΔ1-sul1和intI 1在鮑曼不動(dòng)桿菌中的攜帶率為46.2% (85/150)和58.0%(88/150)；在多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌中的攜帶率為59.5%(49/84)和83.4%(70/84)。多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌經(jīng)PFGE分型可分為14個(gè)克隆，其中A克隆最多見(jiàn)，在ICU、呼吸科和急診病房均存在集中流行，神經(jīng)內(nèi)科和老年科以C克隆多見(jiàn)，其余均為散在流行。結(jié)論qacEΔ1-sul1和intI 1在鮑曼不動(dòng)桿菌中的攜帶率很高，在多重耐藥株中更高，說(shuō)明I類(lèi)整合子是鮑曼不動(dòng)桿菌產(chǎn)生耐藥的原因之一，研發(fā)新的消毒劑以消除鮑曼不動(dòng)桿菌在院內(nèi)的流行迫在眉睫，此外同一克隆株在同一病區(qū)的集中流行和在病區(qū)間的交叉流行提示應(yīng)采取進(jìn)一步的感染控制和隔離措施。

鮑曼不動(dòng)桿菌；qacEΔ1-sul1；Ⅰ類(lèi)整合酶

鮑曼不動(dòng)桿菌是一類(lèi)在外界環(huán)境中普遍存在的常見(jiàn)條件致病菌，主要可引起呼吸道感染、泌尿生殖道感染和血流感染等[1]。近年來(lái)，鮑曼不動(dòng)桿菌在引起醫(yī)院感染的病原菌中呈逐年上升的趨勢(shì)。由于其易形成對(duì)抗生素的多重耐藥和泛耐藥并且能在物體表面存活數(shù)周至數(shù)月，并對(duì)院內(nèi)常用的消毒劑產(chǎn)生耐藥，因此極易在院內(nèi)播散造成大面積流行，使臨床抗感染治療面臨巨大挑戰(zhàn)[2]。本研究擬對(duì)本院2016年上半年所分離的鮑曼不動(dòng)桿菌進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查研究，分析耐消毒劑基因qacEΔ1-sul1和整合酶基因intI 1在臨床菌株中的攜帶情況，為治療和預(yù)防鮑曼不動(dòng)桿菌在醫(yī)院內(nèi)的流行提供理論指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 菌株來(lái)源于我院2016年1～6月臨床分離的150株鮑曼不動(dòng)桿菌，其中剔除同一患者相同部位分離出的重復(fù)菌株，所有臨床菌株的分離培養(yǎng)和鑒定按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》進(jìn)行[3]。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑 PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司，電泳儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，PCR試劑、DNA Marker均購(gòu)自南京天為生物科技有限公司，VITEK 2 compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏儀購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 藥物敏感性試驗(yàn) 鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)常用抗生素的敏感性測(cè)定采用MIC法，結(jié)果判定參照2015年CLSI標(biāo)準(zhǔn)[4]，質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853以及金黃色葡萄球菌ATCC29213[3]。

1.3.2 PCR擴(kuò)增耐藥基因鮑曼不動(dòng)桿菌的DNA采用煮沸法提取[5]，擴(kuò)增引物由上海英濰捷基生物有限公司合成，具體序列如表1所示，16S rRNA基因作為PCR內(nèi)參。反應(yīng)采用20 μL體系，具體為10 μL Taq Mix(天為生物)，1 μL DNA模板，上下游引物各1 μL，和7 μL無(wú)菌蒸餾水。擴(kuò)增條件設(shè)置為：94℃預(yù)變性5 min，94℃30 s，55℃60 s，72℃60 s擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后用EB染色后在紫外凝膠成像儀下觀察目的條帶。

1.3.3 脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)分子分型 純化后的細(xì)菌基因組DNA經(jīng)ApaI限制性?xún)?nèi)切酶(TaKaRa)消化過(guò)夜后在脈沖場(chǎng)凝膠電泳儀上電泳20 h[6]，具體參數(shù)為電壓5 V/cm，轉(zhuǎn)換時(shí)間5～20 s，電場(chǎng)夾角120°，電泳分子量標(biāo)準(zhǔn)為沙門(mén)菌(Braenderup)H9812菌株[7]。電泳后凝膠用EB染色后觀察，結(jié)果判讀采用Tenover等的方法[8]。所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用EpiData3.1軟件建立數(shù)據(jù)庫(kù)，使用BioNumerics(Applied Maths，Kortrijk，Belgium)軟件進(jìn)行相似性分析，各型之間的親緣關(guān)系使用聚類(lèi)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 本試驗(yàn)所用的引物序列及擴(kuò)增片斷大小

2 結(jié) 果

2.1 鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)常用抗生素的藥敏結(jié)果 鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)妥布霉素敏感率最高，為50.0%，其次為慶大霉素和亞胺培南，分別為44.2%和42.4%；多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)藥物的敏感率更低，最高的為美羅培南和頭孢哌酮，均為33.3%，其次為左氧氟沙星，為13.1%，其余藥物的敏感性均在10%及以下(見(jiàn)表2)，常用藥物中除氨芐西林、氨曲南和美羅培南外，其他受試藥物在鮑曼不動(dòng)桿菌組群中的敏感性與多重耐藥菌株比較差異均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

表2 鮑曼不動(dòng)桿菌及其多重耐藥株對(duì)常用抗生素的敏感率分布（%）

2.2 耐藥基因在菌株中的分布 150株鮑曼不動(dòng)桿菌中有88株檢出intl 1，攜帶率為58.7%，85株檢出qacΔE 1-sul1，攜帶率約為56.7%，84株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌中共有70株檢出intl 1，攜帶率為83.3%，49株檢出qacΔE 1-sul1，檢出率約為58.3%，intl 1的攜帶率在兩組間差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=14.94，P＜0.01)，而耐消毒劑基因qacΔE 1-sul1的攜帶率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.0611，P＞0.05)。

2.3 多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的分子分型及病區(qū)分布 84株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌經(jīng)PFGE檢測(cè)后共可分成14個(gè)克隆，其中以A克隆最為常見(jiàn)，共40株，占47.6%，包括A1亞型29株及A2亞型11株；B克隆10株；C克隆18株，其中C1亞型14株，C2亞型4株，其余均為散發(fā)克隆。各克隆株在病區(qū)的分布見(jiàn)表3，各病房?jī)?nèi)均存在同一克隆株流行；其中ICU，呼吸科和急診病房?jī)?nèi)以A克隆為主，神經(jīng)內(nèi)科和老年科以C克隆為主。

表3 多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌各克隆株在病區(qū)的分布(株)

3 討 論

鮑曼不動(dòng)桿菌是近年來(lái)院內(nèi)感染的常見(jiàn)病原菌，由于其在外界的生存能力強(qiáng)且易產(chǎn)生耐藥性，因此鮑曼不動(dòng)桿菌的感染一直是臨床治療上的難題。本試驗(yàn)中我們的研究對(duì)象為我院2016年上半年自臨床患者中分離的150株鮑曼不動(dòng)桿菌，其中84株是多重耐藥株。鮑曼不動(dòng)桿菌總體而言對(duì)大多數(shù)常用抗生素耐藥率偏高，尤其是多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌，敏感率最高的左氧氟沙星耐藥率也在50%以上，亞胺培南、頭孢吡肟、頭孢他啶、頭孢哌酮、氨曲南及環(huán)丙沙星等的耐藥率均在90%左右。

qacΔE1基因編碼的是一種跨膜蛋白，位于Ⅰ類(lèi)整合子的保守序列，該產(chǎn)物對(duì)季胺鹽類(lèi)消毒劑能產(chǎn)生耐藥[9]，季胺鹽類(lèi)化合物是院內(nèi)常用的消毒劑，如苯扎溴胺、新潔爾滅等。Sul1基因編碼的是對(duì)磺胺類(lèi)藥物具有抗性的二氫葉酸合成酶，該基因也位于Ⅰ類(lèi)整合子3'端的保守序列上[10]，由于qacEΔ1和sul1基因相連，因此我們本試驗(yàn)中所設(shè)計(jì)的引物橫跨qacEΔ1和sul1，稱(chēng)做qacΔE1-sul1。IntI 1編碼的是I類(lèi)整合酶，屬于Ⅰ類(lèi)整合子的一部分，細(xì)菌通過(guò)整合酶表達(dá)各種耐藥組分，并在細(xì)菌間傳播。本試驗(yàn)中qacΔE1-sul1在150株鮑曼不動(dòng)桿菌中的檢出率為46.2%，IntI1的檢出率為58.0%，而在84株多重耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌中qacΔ E1-sul1的檢出率為59.5%，稍高于群體內(nèi)的平均水平，IntI1的檢出率為83.4%，遠(yuǎn)高于群體水平，兩者之間差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這說(shuō)明鮑曼不動(dòng)桿菌中很大一部分?jǐn)y帶耐季胺類(lèi)消毒劑的基因，在多重耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌中該基因的攜帶率更高，這類(lèi)菌能耐受醫(yī)院內(nèi)平時(shí)常用的皮膚黏膜消毒劑或是地面空氣消毒劑，因此在環(huán)境中能長(zhǎng)期存在，不易殺滅，是引起院內(nèi)感染的危險(xiǎn)因素，因此開(kāi)發(fā)新的消毒劑迫在眉睫。IntI1在多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌中的攜帶率高達(dá)83.4%，這一現(xiàn)象恰好說(shuō)明I類(lèi)整合子在細(xì)菌的耐藥中扮演了重要角色，是鮑曼不動(dòng)桿菌產(chǎn)生耐藥的原因之一。

對(duì)多重耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌進(jìn)行分型后發(fā)現(xiàn)，不同病區(qū)內(nèi)有同一克隆株的流行，說(shuō)明院內(nèi)存在交叉感染，同一病區(qū)內(nèi)流行多個(gè)克隆株但以某一克隆株為主，說(shuō)明同一病區(qū)內(nèi)經(jīng)常是多個(gè)型別的多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌同時(shí)流行且多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌有集中流行的特點(diǎn)，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)這類(lèi)菌株的產(chǎn)生并及時(shí)采取措施阻止其進(jìn)一步擴(kuò)散是很必要的。

本研究結(jié)果顯示，院內(nèi)鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)常用抗生素的耐藥情況十分嚴(yán)重，尤其是多重耐藥株的出現(xiàn)，使臨床的治療更加困難。qacΔE1-sul1基因在鮑曼不動(dòng)桿菌中的廣泛存在使其在院內(nèi)長(zhǎng)期生存并引發(fā)機(jī)會(huì)感染。鮑曼的耐藥是多個(gè)基因協(xié)同作用的結(jié)果，其中Ⅰ類(lèi)整合子起了重要作用，它把多個(gè)耐藥盒整合在一起在細(xì)菌間傳播從而引起多重耐藥。因此對(duì)這類(lèi)細(xì)菌進(jìn)行感染監(jiān)控和采取預(yù)防措施是阻止其在院內(nèi)發(fā)生感染爆發(fā)流行的最好方式。

[1]Zhang HZ,Zhang JS,Qiao L.The Acinetobacter baumannii group:a systemic review[J].World J Emerg Med,2013,4(3):169-174.

[2]Karaiskkos I,Giamarellou H.Multidrug-resistant and extensively drug-resistant Gram-negative pathogens:current and emerging therapeutic approaches[J].Expert Opin Pharmacother,2014,15(10): 1351-1370.

[3]葉應(yīng)嫵,王毓三,申子瑜.全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程[M].3版.南京:東南大學(xué)出版社,2006:890-912.

[4]Clinical and Laboratory Standard Institute.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing:seventeenth informational supplement M100-S25[S].Wayne,PA:CLSI,2015.

[5]Juhasz E,Krizsan G,Lengyel G,et al.Infection and colonizationby Stenotrophomonas maltophilia:antimicrobial susceptibility and clinical background of strains isolated at a tertiary care centre in Hungary [J].Ann Clin MicrobiolAntimicrob,2014,13:333.

[6]Kaufmann ME,Pitt TL.Pulsed-field gel electrophoresis of bacterial DNA[M]//Methods in practical laboratory bacteriology.CRC Press: Boca Raton,FL,1994:83-92.

[7]金輝,徐小敏,糜祖煌.鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥基因分型與脈沖場(chǎng)凝膠電泳分型的比較[J].環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué),2010,27(4):219-225.

[8]Tenover FC,Arbeit RD,Goering RV,et al.Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis:criteria for bacterial strain typing[J].J Clin Microbiol,1995,33 (9):2233-2239.

[9]Liaw SJ,Lee YL,Hsueh PR.Multidrug resistance in clinical isolates of stenotrophomonas maltophilia:roles of integrons,efflux pumps, phosphoglucomutase(SpgM),and melanin and biofilm formation[J]. Int JAntimicrobAgents,2010,35(35):126-130.

[10]Hu LF,Chang X,Ye Y,et al.Stenotrophomonas maltophilia resistance to trimethoprim/sulfamethoxazole mediated by acquisition of sul and dfrA genes in a plasmid-mediated class 1 integron[J].Int J AntimicrobAgents,2011,37(3):230-234.

Investigation of antibiotic resistance genes qacEΔ1-sul1 and intI 1 in Acinetobacter baumannii.

CHEN Qiu-xia, ZHAO Su-ying.Department of Clinical Laboratory,Jiangsu Province Hospital of TCM,Affiliated Hospital of Nanjing University of TCM,Nanjing 210029,Jiangsu,CHINA

ObjectiveTo investigate the profiles of antibiotic resistance genes and molecular typing of Acinetobacter baumannii isolates collected from clinical specimens in our hospital.MethodsThis study included 150 A.baumannii isolates collected from Jan.2016 to Jun.2016.Antibiotic susceptibility test was determined by minimum inhibitory concentration(MIC).A.baumannii isolates that were resistant to three or more antibiotics were identified as multidrug resistant.qacEΔ1-sul1 and intI 1 genes were analyzed by PCR,and molecular typing for 84 multidrug resistant A.baumannii isolates was performed by PFGE.ResultsThe most susceptible antibiotics for A.baumannii were Tobramycin (50.0%),Gentamicin(44.2%)and Imipenem(42.4%),while in the 84 multidrug resistant A.baumannii,the most susceptible antibiotics were Meropenem(33.3%),Cefoperazone(33.3%)and Levofloxacin(13.1%).Among 150 A.baumannii isolates,85(46.2%)harbored qacEΔ1-sul1 and 88(58.0%)for intI l,while in 84 multidrug resistant A.baumannii,49 (59.5%)for qacEΔ1-sul1 and 70(83.4%)for intI 1.Multidrug resistant A.baumannii isolates belonged to 14 clones according to the PFGE,with A clone as the main type,which was prevalent in ICU,Respiration Department and Emergency Ward.C clone was prevalent in Neurology Department and Geriatrics Department.ConclusionqacEΔ1-sul1 and intI 1 genes were common in A.baumannii,and the carriage rate of intI l was especially high in multidrug resistant A.baumannii isolates,which provides the evidence that intI l was responsible for the drug resistance of A.baumannii.Clonal dissemination provides evidence for the prevalence of multidrug-resistant A.baumannii among clinical isolates.It is suggested that there is an urgent need for new antibiotics.

Acinetobacter baumannii;qacEΔ1-sul1;intI 1

R37

A

1003—6350（2017）03—0426—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.03.027

2016-07-15)

趙蘇瑛。E-mail：43315349@qq.com