楊玉雙++甘霖++覃碧++劉實(shí)忠

摘 要 以橡膠草根尖和嫩葉為材料，對(duì)其染色體制片技術(shù)的取樣時(shí)間、預(yù)處理試劑、解離方法及解離時(shí)間進(jìn)行比較研究。結(jié)果表明：橡膠草根尖和嫩葉取樣最佳時(shí)間均為上午8：00～10：00；2 mmol/L 8-羥基喹啉溶液室溫預(yù)處理4 h效果最好；根尖和嫩葉用1 mol/L鹽酸于60℃下分別酸解10和12 min效果良好。

關(guān)鍵詞 橡膠草 ；根尖 ；嫩葉 ；染色體制片技術(shù)

中圖分類號(hào) S576 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2017.02.008

Development of Technique for Chromosome Squashing

of Taraxacum kok-saghyz Rodin

Yang Yushuang1） Gan Lin1） Qin Bi1） Liu Shizhong2）

（1 Rubber Research Institute，CATAS，Danzhou，Hainan 571737 China；

2 Guangzhou Experimental Station，CATAS，Guangzhou，Guangdong 510140 China）

Abstract The root tips and young leaves of Taraxacum kok-saghyz Rodin were used for chromosome squashing to compare the differences in chromosome squashing through sampling time， pretreatment chemical solution， hydrolysing methods and time of chromosome squashing. The results showed that the root tips and young leaves were best sampled at about 8：00～10：00 am， pretreated in 2 mmol/L 8-hydroxyquinoline solution at a room temperature for 4 hours and hydrolysed with 1 mol/L HCl at 60℃ for 10 and 12 min respectively for chromosome squashing.

Keywords Taraxacum kok-saghyz Rodin ； Root tip； Young leaf ； Chromosome squashing technique

橡膠草（Taraxacum kok-saghyz Rodin）為菊科蒲公英屬大角蒲公英組多年生草本植物。原產(chǎn)于哈薩克斯坦、歐洲以及中國(guó)新疆等地，其染色體數(shù)目為2n=2x=16[1-2]。因其根部橡膠含量高、品質(zhì)優(yōu)良、適應(yīng)性強(qiáng)等諸多優(yōu)點(diǎn)，成為具有發(fā)展前途的巴西橡膠樹(shù)橡膠替代作物之一[3-5]。簡(jiǎn)捷穩(wěn)定的染色體制片技術(shù)對(duì)于遺傳育種和種質(zhì)資源分析具有重要意義[6]。至今尚未見(jiàn)橡膠草染色體制片相關(guān)研究報(bào)道。壓片法因操作步驟較少、操作簡(jiǎn)便、容易掌握等特點(diǎn)，在植物染色體制片中被廣泛使用[7-10]。大量研究顯示，制片材料的選取時(shí)間、預(yù)處理、解離等步驟對(duì)制片成功率及制片效果至關(guān)重要，不同植物及取材部位的最優(yōu)處理?xiàng)l件也往往存在差異[11-15]。本研究以橡膠草根尖和嫩葉為材料，對(duì)其取樣時(shí)間，預(yù)處理試劑和處理時(shí)間、解離方法及解離時(shí)間進(jìn)行了比較研究，以期篩選出一套高效、穩(wěn)定的染色體制片技術(shù)，為橡膠草倍性育種、種間雜交及種質(zhì)資源分析等研究提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為橡膠草（Taraxacum kok-saghyz Rodin）的幼根和嫩葉。

幼根：種子用滅菌靈浸泡24 h后，分散置于培養(yǎng)皿中室溫培養(yǎng)（25℃），待根長(zhǎng)至1～2 cm左右，取根尖0.5～1 cm。

嫩葉：生長(zhǎng)旺盛植株未展開(kāi)的嫩葉（長(zhǎng)約1.5～2 cm）。

1.2 方法

1.2.1 取樣時(shí)間

橡膠草根尖和嫩葉分別于8：00、10：00、12：00和14：00，4個(gè)不同時(shí)間取樣，比較不同取樣時(shí)間獲得的中期分裂相細(xì)胞情況，篩選最適取樣時(shí)間。

1.2.2 預(yù)處理

選用2種預(yù)處理試劑：（1）1%秋水仙素（Biodee公司）室溫處理，處理時(shí)間分別為2、3和4 h；（2）2 mmol/L 8-羥基喹啉（Sigma）室溫處理，處理時(shí)間分別為2、3和4 h。之后，轉(zhuǎn)入卡諾氏固定液（V酒精∶V乙酸=3∶1）于 4℃冰箱固定24 h。

1.2.3 解離

選用2種解離方法，（1）酸解法：固定好的材料用ddH2O清洗2次，每次10 min，然后放入1 mol/ L鹽酸中于60 ℃恒溫下分別處理8、10、12和16 min；（2）酶解法（參照陸坤等[16]的方法并稍作改動(dòng)）：固定好的材料用ddH2O浸洗2次，每次10 min，加A+B 緩沖液（終濃度：4 mmol/L 檸檬酸、6 mmol/L 檸檬酸鈉）浸洗2次，每次10 min。然后，轉(zhuǎn)入2.5%果膠酶（Solarbio）和2.5%纖維素酶（Sigma）混合溶液于37℃下酶解，處理時(shí)間分別為30、40、50、60 min。之后，用ddH2O清洗3次，每次5 min。

1.2.4 染色、制片和鏡檢

采用改良苯酚品紅染液（Solarbio）染色，常規(guī)壓片法制片。用Leica DMLB顯微鏡鏡檢，Leica DFC500攝像頭拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 取樣時(shí)間分析

對(duì)橡膠草根尖和嫩葉的取樣時(shí)間進(jìn)行比較分析（表1）。結(jié)果表明，無(wú)論是橡膠草根尖還是嫩葉，其最佳取樣時(shí)間均為上午8：00～10：00。在此時(shí)間段取到的樣品的中期分裂相細(xì)胞所占比例較多，容易找到分散較好的染色體分裂相，而其它時(shí)間獲得的中期分裂相相對(duì)較少。

2.2 預(yù)處理試劑和處理時(shí)間對(duì)制片效果的影響

對(duì)2種預(yù)處理試劑及處理時(shí)間的制片效果進(jìn)行比較分析（表2）。結(jié)果表明，用2 mmol/L 8-羥基喹啉處理的染色體濃縮程度適宜，形態(tài)清晰，效果最好（圖1-C和1-D）；0.1%秋水仙素處理的染色體濃縮程度適宜，形態(tài)較清晰，但是染色背景顏色較深，效果次之（圖1-A和1-B）。不同預(yù)處理時(shí)間的比較結(jié)果顯示，2 mmol/L 8-羥基喹啉和0.1 %秋水仙素處理4 h的染色體濃縮程度和清晰度均好于2和3 h處理的效果。綜上分析，用2 mmol/L 8-羥基喹啉處理4 h的制片效果最好。

2.3 解離方法和解離時(shí)間對(duì)解離效果的影響

對(duì)2種解離方法及解離時(shí)間的制片效果進(jìn)行比較分析，結(jié)果（表3）顯示，橡膠草根尖酸解10 min和酶解40 min時(shí)，細(xì)胞壁解離充分，壓片后細(xì)胞分散程度好，染色體分辨清晰，制片效果最好。葉片的最佳酸解和酶解時(shí)間分別為12 和50 min。解離時(shí)間不足時(shí)，細(xì)胞存在重疊現(xiàn)象，難以壓散，染色體重疊嚴(yán)重，分辨不清，無(wú)法計(jì)數(shù)（圖1-E和1-F）。解離時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞破碎，染色體缺失或混雜，染色變淺，影響觀測(cè)效果（1-G和1-H）。

3 討論與結(jié)論

3.1 取樣部位與時(shí)間

根尖的分生組織有絲分裂旺盛，細(xì)胞壁薄，且取材容易，操作簡(jiǎn)便，因此，植物細(xì)胞染色體標(biāo)本的制備多以根尖為材料。但是，對(duì)于大田生長(zhǎng)植物的倍性鑒定等工作，利用幼嫩葉片為材料進(jìn)行染色體制片顯得更加方便快捷。張健[12]和高和瓊等[17]分別對(duì)橡膠樹(shù)和木薯葉片的染色體制片技術(shù)進(jìn)行了摸索和優(yōu)化，取得了不錯(cuò)的效果。本研究分別對(duì)橡膠草的根尖和嫩葉組織的染色體制片技術(shù)進(jìn)行摸索，結(jié)果顯示，雖然嫩葉的細(xì)胞中期分裂相要少于根尖的細(xì)胞中期分裂相，但是對(duì)制片效果并沒(méi)有太大影響，均能有效用于細(xì)胞染色體觀察試驗(yàn)。制片要獲得較多的分裂相，需保證取樣時(shí)組織細(xì)胞處于旺盛的分裂期，取材時(shí)間非常重要。本研究結(jié)果顯示，無(wú)論是橡膠草根尖還是嫩葉，其最佳取樣時(shí)間均為上午8：00～10：00，此時(shí)間段取到樣品的中期分裂相細(xì)胞所占比例較多，容易找到分散較好的分裂相。這與許多蒲公英屬植物的最佳取材時(shí)間基本一致[18-20]，說(shuō)明橡膠草在這一時(shí)間段處于生長(zhǎng)旺盛期。

3.2 預(yù)處理

預(yù)處理的主要目的就是通過(guò)阻斷、抑制和破壞紡錘絲的形成使細(xì)胞分裂停滯在中期，進(jìn)而獲得更多的中期分裂相細(xì)胞，以便于壓片和觀察。因此，預(yù)處理是染色體制片中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究比較了2種預(yù)處理試劑的制片效果。2 mmol/L 8-羥基喹啉處理的染色體濃縮程度適宜，形態(tài)清晰，效果很好。張健[18]和鐘淑梅[20]在普通蒲公英染色體制片中用8-羥基喹啉預(yù)處理也獲得了不錯(cuò)的效果；0.1%秋水仙素處理的染色體濃縮程度適宜，形態(tài)較清晰，但是染色背景顏色較深，效果次之。預(yù)處理時(shí)間對(duì)制片效果也非常重要，處理時(shí)間過(guò)短和過(guò)長(zhǎng)都會(huì)影響制片效果。本研究結(jié)果顯示，2 mmol/L 8-羥基喹啉和0.1%秋水仙素處理4 h的染色體濃縮程度和形態(tài)清晰度最佳。2 和3 h預(yù)處理時(shí)間不足，導(dǎo)致染色體濃縮程度不到位，染色體形態(tài)模糊、拖尾，很難進(jìn)行核型分析等后續(xù)研究。

3.3 解離

解離目的是使細(xì)胞分離，軟化細(xì)胞壁和降解部分細(xì)胞質(zhì)，便于染色體分散和展平，便于染色體觀察，在染色體制片過(guò)程中非常關(guān)鍵。本研究表明，橡膠草根尖酸解10和酶解40 min時(shí)，細(xì)胞壁解離充分，壓片后細(xì)胞分散程度好，染色體分辨清晰，制片效果最好。嫩葉的最佳酸解和酶解時(shí)間分別為12 和50 min。無(wú)論是根尖還是嫩葉，解離時(shí)間不足時(shí)，細(xì)胞壁解離不充分，細(xì)胞存在重疊現(xiàn)象，難以壓散，染色體重疊嚴(yán)重，分辨不清，無(wú)法計(jì)數(shù)。解離時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞破碎，染色體缺失或混雜，而且染色體著色困難，影響觀測(cè)效果，這在大量植物的染色體制片研究中已得到證實(shí)[11-14，17]。本研究對(duì)酸解法和酶解法在橡膠草中的使用效果進(jìn)行了比較分析：（1）酸解法的解離時(shí)間更短。橡膠草根尖和嫩葉的酸解解離時(shí)間均明顯短于其酶解解離時(shí)間；（2）酸解法操作更加簡(jiǎn)便穩(wěn)定，容易掌握。雖然酶解法解離更加充分，細(xì)胞分散更好，但其操作過(guò)程相對(duì)繁瑣，且酶解后的材料松軟、易碎，分生組織容易丟失，從而導(dǎo)致制片效率較低；（3）在染色體的分散程度、形態(tài)清晰度方面，酸解法與酶解法之間沒(méi)有明顯差別。綜上所述，對(duì)于橡膠草根尖和嫩葉的染色體制片技術(shù)，采用酸解法會(huì)更加簡(jiǎn)便快捷、操作穩(wěn)定、易于掌握。

染色體制片效果受多種因素影響。其中，采樣時(shí)間、預(yù)處理和解離是影響制片效果的關(guān)鍵步驟。本研究以橡膠草根尖和嫩葉為材料，對(duì)取樣時(shí)間、預(yù)處理和解離進(jìn)行了比較研究，結(jié)果表明，橡膠草根尖和嫩葉的最佳取樣時(shí)間均為上午8：00～10：00；2 mmol/L 8-羥基喹啉處理4 h的染色體濃縮程度適宜，形態(tài)清晰，效果最好；對(duì)于橡膠草根尖和嫩葉的染色體制片技術(shù)，采用酸解法會(huì)更加簡(jiǎn)捷、穩(wěn)定和易于掌握。橡膠草根尖最佳酸解時(shí)間為10 min，嫩葉的最佳酸解時(shí)間為12 min。

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① 基金項(xiàng)目：橡膠研究所省部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室及科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站開(kāi)放課題“新型產(chǎn)膠作物橡膠草優(yōu)異種質(zhì)篩選及配套栽培技術(shù)研究與示范”（No.RRI-KLOF201604）；橡膠研究所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)“重要產(chǎn)膠替代植物種質(zhì)資源收集與鑒定”（No.1630022015005）。

收稿日期：2016-10-13；責(zé)任編輯/葉慶亮；編輯部E-mail： rdnk@163.com。

② 楊玉雙（1983～），男，博士，助理研究員，主要從事橡膠草種質(zhì)篩選與分子標(biāo)記輔助育種。

③ 通訊作者。E-mail： sz_liu@126.com。