祝浩明，王娟娟，舒 夢(mèng)，陳 溪，孫 強(qiáng)，王 君，胡霞敏，程 靜

褐藻提取物鵝掌萊酚（Eckol）抗腫瘤作用的初步探究

祝浩明，王娟娟，舒 夢(mèng)，陳 溪，孫 強(qiáng)，王 君，胡霞敏，程 靜*

（武漢科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430065）

目的 初步探究褐藻提取物鵝掌萊酚（Eckol）的抗腫瘤作用。方法 觀察Eckol對(duì)小鼠艾氏腹水瘤、S180肉瘤和離體胃癌SGC7901細(xì)胞的影響，通過計(jì)算胸腺指數(shù)、脾指數(shù)了解Eckol對(duì)小鼠免疫器官的作用。結(jié)果 艾氏腹水瘤模型中，Eckol可明顯延長小鼠生存時(shí)間（P＜0.05）。與對(duì)照組（生理鹽水組）相比，Eckol對(duì)S180肉瘤小鼠腫瘤的形成和發(fā)展有明顯的抑制作用，可顯著降低肉瘤組織重量，改善其惡變程度。其中低劑量組（Eckol濃度為0.25 mg/L）的抗腫瘤功效最為明顯（P＜0.01），抑瘤率達(dá)48.49%。與對(duì)照組相比，Eckol對(duì)動(dòng)物胸腺指數(shù)和脾指數(shù)影響不大。體外研究結(jié)果顯示，Eckol對(duì)SGC7901細(xì)胞的分裂增殖有明顯抑制作用（P＜0.01），且抑制作用呈劑量依賴性。結(jié)論 褐藻提取物Eckol具有明顯的抗腫瘤作用。

褐藻；鵝掌萊酚；抗腫瘤

褐藻是重要的藥用和食用資源。褐藻門約有250屬，1 500種以上，是海藻中比較高級(jí)的一大類群，具有分布廣、藻體大和生長快等特點(diǎn)，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高[1]。褐藻多酚（Phlorotannin）是從Ecklonia cava、Ecklonia maxima、Eckloniastolonifera等褐藻中提取分離得到的多酚類物質(zhì)，其基本結(jié)構(gòu)單元為間苯三酚。鵝掌萊酚（Eckol）是間苯三酚的三聚體，因其獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)而具有較多的生物學(xué)活性，如抗氧化、抗菌、抗病毒、抗炎[2，3]、預(yù)防骨質(zhì)疏松[4]，但其抗腫瘤作用還未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采取體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)方法，觀察Eckol對(duì)小鼠艾氏腹水瘤、S180肉瘤和體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞的作用，初步探究其抗腫瘤作用。

1 材料和試劑

1.1 試劑和藥品

Eckol由武漢南泰科技開發(fā)有限公司提供，為黃褐色粉末，難溶于水。羥基喜樹堿由成都普瑞法有限公司生產(chǎn)。Ⅳ型膠原酶、噻唑藍(lán)（MTT）、放線菌素D、脂多糖（LPS）均來自Sigma公司。RPMI-1640培養(yǎng)基、新生牛血清（NBS）購于GIBCO公司。

1.2 動(dòng)物及分組

昆明種小鼠（購于湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），SPF級(jí)，雄性，4～5月齡，體重23～25 g。

艾氏腹水瘤實(shí)驗(yàn)：將小鼠按體重平行隨機(jī)分為對(duì)照組（生理鹽水組）和Eckol低、中、高劑量組（藥物濃度分別為0.25 mg/L、0.50 mg/L、1.0 mg/L），共4組，每組10只，并用苦味酸進(jìn)行編號(hào)。

S180肉瘤實(shí)驗(yàn)：將小鼠按體重平行隨機(jī)分為對(duì)照組（生理鹽水組）和Eckol低、中、高劑量組（藥物濃度分別為0.25 mg/L、0.50 mg/L、1.0 mg/L）以及羥基喜樹堿陽性對(duì)照組（藥物濃度為1.0 mg/L），共5組，每組10只，并用苦味酸進(jìn)行編號(hào)。

1.3 儀器和設(shè)備

倒置生物顯微鏡（德國徠卡）、Bio-Tek酶標(biāo)儀、CO2培養(yǎng)箱（美國3111）、721分光光度計(jì)、分析天平（美國奧豪斯）。

2 方法

2.1 體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)

2.1.1 褐藻提取物Eckol對(duì)艾氏腹水瘤的抑制作用 對(duì)各組小鼠進(jìn)行預(yù)防灌胃給藥，給藥量均為0.2 ml/10 g，1次/d，共7 d。第7 d灌胃給藥1 h后，取艾氏腹水瘤瘤株已傳代10 d的保種小鼠，無菌條件下抽取腹水，顯微鏡下計(jì)數(shù)，以無菌生理鹽水按1∶5比例稀釋腫瘤細(xì)胞，混勻后，在無菌條件下，按0.5 ml/只接種至實(shí)驗(yàn)小鼠腹腔中。接種后按上述方法再連續(xù)給藥15 d，觀察小鼠的活動(dòng)狀況并記錄小鼠生存時(shí)間，超過15 d的按15 d算。按以下公式計(jì)算生命延長率：

生命延長率（%）=（劑量組平均生存天數(shù)-對(duì)照組平均生存天數(shù)）/對(duì)照組平均生存天數(shù)×100%

劑量組：Eckol低、中、高劑量組。

2.1.2 Eckol對(duì)S180肉瘤的抑制作用 對(duì)各組小鼠采用預(yù)防灌胃給藥，給藥量均為0.2 ml/10 g，1次/d，共7 d。第7 d灌胃給藥1 h后，取S180肉瘤瘤株已傳代10 d的保種小鼠，無菌條件下抽取腹水，顯微鏡下計(jì)數(shù)，以無菌生理鹽水調(diào)整腫瘤細(xì)胞數(shù)至2.5×107，混勻后，每只小鼠右腋下接種腫瘤細(xì)胞懸液0.4 ml。接種24 h后，對(duì)照組以及Eckol低、中、高劑量組按上述方法給藥，羥基喜樹堿陽性對(duì)照組腹腔注射給藥，給藥量為0.2 ml/10 g，各組連續(xù)給藥10 d，最后一次給藥24 h后記錄小鼠體重，頸椎脫臼法處死小鼠，剝?nèi)「鹘M小鼠皮下瘤組織，取胸腺和脾臟，分別稱取濕重并記錄，按下列公式計(jì)算抑瘤率、胸腺指數(shù)和脾指數(shù)。此外，每組選取一例瘤組織進(jìn)行組織切片HE染色，觀察腫瘤細(xì)胞形態(tài)。

抑瘤率（%）=（對(duì)照組瘤重-劑量組瘤重）／對(duì)照組瘤重× 100%

脾指數(shù)=小鼠脾重（mg）／小鼠體重（g）

胸腺指數(shù)=小鼠胸腺重（mg）／小鼠體重（g）

2.2 體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)

Eckol對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞株生長增殖抑制作用實(shí)驗(yàn)：采用MTT法，用10%RPMI-1640生長培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，用2%RPMI-1640維持培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度，除空白調(diào)零孔外，每孔均勻接種約1×104個(gè)細(xì)胞，200 μl到96孔板中?？瞻渍{(diào)零孔僅加入10%RPMI-1640培養(yǎng)液180 μl，于37℃、飽和蒸汽、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，倒置顯微鏡下觀察。除空白調(diào)零孔及正常對(duì)照孔外，每孔分別加入濃度為0.125 mg/L、0.25 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L的20 μl Eckol提取液，每種濃度各設(shè)5個(gè)復(fù)孔。正常對(duì)照孔僅加入PBS 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。棄去孔內(nèi)液體，每孔加入5 mg/ml MTT 20 μl，于37℃、飽和蒸汽、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h，1 000 r/min平板離心機(jī)離心后，棄上清，晾干，加入200 μl DMSO，在搖床上低速震蕩10 min，使結(jié)晶完全溶解后，用酶標(biāo)儀560 nm測每孔光密度值（OD值），按以下公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率：

細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-藥物處理組OD值/正常培養(yǎng)液對(duì)照組OD值）×100%

藥物處理組：指不同濃度的Eckol提取液組；

正常培養(yǎng)液組：指與藥物處理組同條件下的PBS組。

3 結(jié)果

3.1 Eckol對(duì)艾氏腹水瘤的抑制作用

如表1所示，與對(duì)照組相比，Eckol中、高劑量組小鼠生存時(shí)間分別為（11.3±2.1）d、（11.3±3.0）d，差異有顯著性（P＜0.05），說明Eckol在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)腫瘤的生長和發(fā)展有顯著的抑制作用，并能延長腹水瘤小鼠生存時(shí)間。

表1 Eckol對(duì)艾氏腹水瘤小鼠生存時(shí)間的影響

3.2 Eckol對(duì)S180肉瘤的抑制作用

如表2所示，相對(duì)于對(duì)照組的腫瘤生長良好，Eckol低、中、高劑量組腫瘤的生長均受到抑制，抑瘤率分別為48.49%、36.96%和36.65%，其中以低劑量組抑瘤效果最為明顯，抑瘤率明顯高于羥基喜樹堿陽性對(duì)照組。說明Eckol對(duì)S180肉瘤的體內(nèi)增殖具有良好的抑制活性。圖1顯示，S180肉瘤經(jīng)HE染色后，用高倍鏡進(jìn)行觀察，對(duì)照組的癌細(xì)胞大小和形態(tài)完全不一致，細(xì)胞核變大，核染色較深，細(xì)胞核和細(xì)胞漿之間的比例增大，核的大小、形狀、染色不一，多處可見核分裂相，不對(duì)稱性、多極性、頓挫性等病理性分裂相增多。羥基喜樹堿陽性對(duì)照組可見大片細(xì)胞死亡，殘存的瘤細(xì)胞大小和形態(tài)趨近一致。Eckol低、中、高劑量組的死亡細(xì)胞數(shù)呈劑量依賴性，尤其高劑量組呈大面積的索式死亡區(qū)，瘤細(xì)胞大小和形態(tài)較均一，經(jīng)Eckol劑量處理后細(xì)胞大小和形態(tài)都發(fā)生了變化。與對(duì)照組比較，羥基喜樹堿陽性對(duì)照組中羥基喜樹堿能明顯降低小鼠的胸腺指數(shù)和脾指數(shù)。而Eckol低、中、高劑量組小鼠胸腺指數(shù)分別為對(duì)照組的76.32%、87.72%和93.05%，差異無顯著性。

表2 Eckol對(duì)小鼠S180實(shí)體瘤重量的影響

圖1 Eckol對(duì)腫瘤組織形態(tài)學(xué)的影響

3.3 Eckol對(duì)體外培養(yǎng)的SGC7901細(xì)胞的影響

如表3所示，Eckol可能并非通過免疫調(diào)節(jié)作用發(fā)揮間接抗腫瘤效應(yīng)，而是通過直接細(xì)胞毒性發(fā)揮效應(yīng)。為了解Eckol對(duì)腫瘤細(xì)胞的直接作用，我們利用經(jīng)典MTT法對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。如圖2所示，Eckol對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞的增值抑制作用呈劑量依賴性，隨著劑量的增加，細(xì)胞生存率不斷下降，即增殖抑制率呈上升趨勢。且與對(duì)照組比較，各劑量組均存在顯著性差異，說明Eckol對(duì)SGC7901細(xì)胞的體外增殖具有明顯的抑制作用。

表3 Eckol對(duì)小鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)的影響（±s，mg/g）

表3 Eckol對(duì)小鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)的影響（±s，mg/g）

注：與對(duì)照組比較，無顯著性差異

組別 胸腺指數(shù) 脾指數(shù)對(duì)照組Eckol低劑量組Eckol中劑量組Eckol高劑量組羥基喜樹堿陽性對(duì)照組3.754±1.100 2.865±0.740 3.293±0.510 3.493±0.790 2.111±0.650 8.145±1.920 5.628±1.010 6.835±1.370 6.303±1.230 4.848±1.850

圖2 Eckol對(duì)細(xì)胞生存率的影響（24 h）

4 討論

如今癌癥已成為威脅人類健康、致人死亡的重要病因。目前臨床上治療癌癥的化療藥物具有選擇性低、對(duì)正常組織傷害性大的特點(diǎn)。大量研究表明，從海藻中提取的很多活性成分具有抗腫瘤作用。魏玉西等[5]發(fā)現(xiàn)鼠尾藻多酚類化合物具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，對(duì)離體人肺腺A-549細(xì)胞、人肝癌BEL-7402細(xì)胞的增殖具有很強(qiáng)的抑制作用。史大華等[6]在低分子量的巖藻多糖的研究中也證實(shí)巖藻多糖具有抗腫瘤作用。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在一定濃度范圍內(nèi)，Eckol能延長艾氏腹水瘤小鼠生存時(shí)間；Eckol劑量組的小鼠毛發(fā)普遍要比對(duì)照組的有光澤，行動(dòng)也更活躍；在S180移植性實(shí)體瘤實(shí)驗(yàn)中，Eckol劑量組的平均瘤重比對(duì)照組輕，說明Eckol具有明顯的抑制肉瘤生長的作用。在與羥基喜樹堿陽性對(duì)照組比較時(shí)發(fā)現(xiàn)，羥基喜樹堿陽性對(duì)照組小鼠的胸腺指數(shù)和脾指數(shù)顯著降低，而給予Eckol的高、中、低劑量組與陽性對(duì)照組相比，其胸腺指數(shù)均呈上升趨勢，且胸腺指數(shù)的上升為劑量依賴性，高劑量組的胸腺指數(shù)最大，與陽性對(duì)照組相比差異有顯著性。高劑量組的S180小鼠脾指數(shù)顯著高于陽性對(duì)照組，差異有顯著性。而劑量組小鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)明顯低于對(duì)照組，但不存在顯著性差異。說明羥基喜樹堿的組織毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于Eckol，羥基喜樹堿能致免疫器官胸腺和脾臟萎縮。在MTT法體外實(shí)驗(yàn)中，離體的人胃癌細(xì)胞株SGC7901細(xì)胞經(jīng)Eckol處理24 h，隨著Eckol濃度的增加，存活細(xì)胞數(shù)顯著下降，且除低劑量組外，細(xì)胞增殖抑制率與對(duì)照組比較有顯著性差異，說明一定劑量范圍的Eckol對(duì)離體分離的人癌細(xì)胞具有抑制作用。多項(xiàng)研究表明，Eckol類化合物在一些細(xì)胞信號(hào)通路中起著重要作用[7，8]。而Lee S H[9]發(fā)現(xiàn)從褐藻Ecklonia Cave中分離提取的褐藻多酚通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，對(duì)人MCF-7肺癌細(xì)胞株的體外增殖具有顯著的抑制作用。本實(shí)驗(yàn)只是對(duì)Eckol抗腫瘤作用做初步研究，詳細(xì)的抗腫瘤機(jī)制以及可能涉及分子水平的信號(hào)通路還有待深入研究。

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（*通訊作者：程靜）

R285.6

A

1671-1246（2017）05-0093-03

注：本文系武漢科技大學(xué)大學(xué)生科技創(chuàng)新基金研究項(xiàng)目（15ZRA164）