李秀芝+黃斌+范弟武

摘要：關(guān)于土壤脲酶活性的測(cè)定，不同學(xué)者選用的浸提劑以及對(duì)照的設(shè)置往往大相徑庭，對(duì)于這些不同處理方式測(cè)得的脲酶活性的差異，目前還缺乏相應(yīng)的比較研究。選用1.0 mol/L KCl+0.01 mol/L HCl、2.5 mol/L KCl+0.1 mmol/L Ag2SO4、2.5 mol/L KCl、2.0 mol/L KCl以及1.0 mol/L KCl等5種不同的浸提劑，設(shè)置對(duì)照培養(yǎng)2 h與對(duì)照不培養(yǎng)2種對(duì)照方法，以洪澤湖濕地土壤為例，比較不同浸提劑及對(duì)照設(shè)置方法間土壤脲酶活性的差異。結(jié)果表明，在對(duì)照培養(yǎng)條件下，測(cè)得的脲酶活性最大達(dá)到0.098 μg/（kg·h），浸提劑1.0 mol/L KCl+0.01 mol/L HCl；脲酶活性最小為0.035 μg/（kg·h），浸提劑2.5 mol/L KCl+0.1 mmol/L Ag2SO4。與對(duì)照不培養(yǎng)組相比，對(duì)照培養(yǎng)2 h組更容易獲得較高的脲酶活性，當(dāng)浸提劑分別為2.5 mol/L KCl+0.1 mmol/L Ag2SO4、2.0 mol/L KCl、1.0 mol/L KCl+0.01 mol/L HCl 時(shí)，對(duì)照培養(yǎng)組土壤脲酶活性分別是對(duì)照不培養(yǎng)的1.6、3.0、7.5倍。對(duì)于不同的抑制劑而言，1.0 mol/L KCl+0.01 mol/L HCl 是1.0 mol/L KCl的1.58 倍，而2.5 mol/L KCl+0.1 mmol/L Ag2SO4與2.5 mol/L KCl的差異較小，差值僅為0.001 μg/（kg·h）。

關(guān)鍵詞：土壤；脲酶活性；浸提劑；對(duì)照培養(yǎng)

中圖分類號(hào)： S154.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）11-0427-03

在土壤酶中，脲酶催化土壤中尿素酰胺態(tài)氮水解為銨態(tài)氮，在土壤氮元素的循環(huán)與轉(zhuǎn)化過程中扮演重要角色[1-3]。脲酶活性是評(píng)價(jià)生態(tài)系統(tǒng)氮素轉(zhuǎn)化機(jī)制及其功能演變時(shí)最常見的酶學(xué)指標(biāo)。土壤脲酶活性的測(cè)定有比色法、擴(kuò)散法、尿素剩余量測(cè)定法、電極法、CO2量度法等[4-6]多種方法，其中比色法由于測(cè)量結(jié)果精確性較高、重現(xiàn)性較好、儀器設(shè)備簡(jiǎn)單，應(yīng)用最為廣泛。非甲苯法[7]因?yàn)闆]有甲苯的加入因而更加注重脲酶對(duì)于尿素的水解功能，是比色法中最常應(yīng)用的方法。對(duì)于非甲苯法，可以選擇不同的浸提劑，如有的學(xué)者采用 2.5 mol/L KCl+0.1 mmol/L Ag2SO4混合液或者1.0 mol/L KCl+0.01 mol/L HCl，在浸提劑加入的同時(shí)加入抑制劑阻止脲酶的進(jìn)一步水解；而有的學(xué)者直接采用2.0 mol/L KCl進(jìn)行浸提。并且對(duì)于對(duì)照的處理方法也不盡相同，有的是在土樣培養(yǎng)之后加入底物尿素[7]；有的則是與處理同步加入底物，但對(duì)照處理不進(jìn)行培養(yǎng)[8]。抑制劑是否可以有效地抑制酶的活性、這些不同的處理方式測(cè)出的脲酶活究竟會(huì)有什么差異，目前還缺乏相應(yīng)的比較與研究。本研究以洪澤湖濕地為原型區(qū)域，采集濕地沉積物樣品，采用非甲苯法并使用5種不同的浸提劑（1.0 mol/L KCl+0.01 mol/L HCl、2.5 mol/L KCl+0.1 mmol/L Ag2SO4、2.5 mol/L KCl、2.0 mol/L KCl、1.0 mol/L KCl），同時(shí)設(shè)立對(duì)照培養(yǎng)2 h與對(duì)照不培養(yǎng)2種不同的對(duì)照試驗(yàn)，對(duì)脲酶活性進(jìn)行檢測(cè)，以期明確不同浸提劑及不同對(duì)照設(shè)置對(duì)土壤脲酶活性測(cè)定的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)土壤取自于洪澤湖濕地，取0～20 cm的表層沉積物自然風(fēng)干后，碾碎，過2 cm篩，備用。供試土樣的全氮、全碳含量分別為0.675、0.1 g/kg。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 脲酶活性的測(cè)定 選用水楊酸鈉-二氯異氰尿酸鈉比色法測(cè)定脲酶活性[6-11]。（1）稱取5 g土壤樣品，置于 100 mL 的有蓋容器內(nèi)，加入2.5 mL 0.08 mol/L尿素水溶液，密封后在37 ℃下恒溫培養(yǎng)2 h。培養(yǎng)結(jié)束后，打開塞子，加入2.5 mL蒸餾水，然后加入50 mL 5種不同的浸提劑（1.0 mol/L KCl+0.01 mol/L HCl、2.5 mol/L KCl+0.1 mmol/L Ag2SO4、2.5 mol/L KCl、2.0 mol/L KCl、1.0 mol/L KCl）振蕩30 min，轉(zhuǎn)速180 r/min，將振蕩后的土壤懸濁液迅速過濾，取1.0 mL濾液于10 mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度線，搖勻，倒入25 mL小燒杯中，并依次加入 5 mL 的水楊酸鈉和2 mL的二氯異氰尿酸鈉溶液。室溫下靜置30 min，以蒸餾水為參比，用紫外可見分光光度計(jì)在 690 nm 處測(cè)吸光度。每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，比較不同浸提劑對(duì)于土壤脲酶活性的差異。

1.2.2 第1種對(duì)照的設(shè)置 稱取5 g土壤樣品置于100 mL的有蓋容器內(nèi)，加入2.5 mL蒸餾水，密封，在37 ℃下恒溫培養(yǎng)2 h。培養(yǎng)結(jié)束后，打開塞子，加入浸提劑，再加入 2.5 mL 0.08 mol/L尿素水溶液（先加浸提劑再加尿素）。之后的步驟與處理試驗(yàn)中相同。

1.2.3 第2種對(duì)照的設(shè)置 在處理試驗(yàn)與對(duì)照試驗(yàn)中，處理與對(duì)照同時(shí)按相同試驗(yàn)步驟進(jìn)行的，但對(duì)處理進(jìn)行2 h培養(yǎng)，對(duì)照不培養(yǎng)，分析不同對(duì)照的設(shè)置對(duì)脲酶活性測(cè)定結(jié)果的影響。該對(duì)照下浸提劑使用1.0 mol/L KCl+0.01 mol/L HCl、2.5 mol/L KCl+0.1 mmol/L Ag2SO4、2.0 mol/L KCl。比較不同對(duì)照對(duì)于脲酶活性的差異。

1.2.4 脲酶活性的計(jì)算 脲酶活性用1 g干土1 h水解尿素產(chǎn)生銨態(tài)氮的量表示。

U=（T-CK）×17×55/（5×2）。

式中：U表示脲酶活性，μg/（g·h）；T表示處理吸光度從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得銨態(tài)氮的濃度，μg/mL；CK表示對(duì)照組吸光度從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得的銨態(tài)氮濃度，μg/mL；17為取1.0 mL濾液共稀釋17倍；55是處理和對(duì)照濾液制備前稀釋的體積，mL；5為沉積物的干質(zhì)量，g；2為換算成1 h的系數(shù)，h。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同浸提劑對(duì)于脲酶活性的影響

由圖1表明，對(duì)照培養(yǎng)條件下當(dāng)浸提劑為1.0 mol/L KCl+0.01 mol/L HCl時(shí)，脲酶活性達(dá)到最強(qiáng)，為0.098 μg/（kg·h），2.0 mol/L KCl次之，浸提劑為 2.5 mol/L KCl+0.1 mmol/L Ag2SO4測(cè)得的脲酶活性最弱，為0.035 μg/（kg·h），最大值為最小值的2.8倍。當(dāng)浸提劑分別為 1.0 mol/L KCl、2.0 mol/L KCl、2.5 mol/L KCl時(shí)，脲酶活性分別為0.062、0.072 0、0.036 μg/（kg·h），KCl濃度從 1.0 mol/L 增至2.0 mol/L時(shí)，脲酶活性增加 0.01 μg/（kg·h）；當(dāng)濃度繼續(xù)升高至2.5 mol/L時(shí)，其脲酶活性比2.0 mol/L KCl 低 50%。比較1.0、2.0、2.5 mol/L KCl等3種不同KCl離子濃度浸提劑相應(yīng)酶活性的變化可以看出，脲酶活性與浸提劑的離子濃度并不是呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)關(guān)系，而是先增強(qiáng)后減弱，在2.0 mol/L KCl時(shí)測(cè)得的脲酶活性最強(qiáng)，這可能是因?yàn)榈蜐舛冉釀?duì)銨根離子的提取效率相對(duì)較低，但并不是濃度越高就越有利于提??；高濃度可能影響到脲酶活性的比色，進(jìn)而減弱脲酶活性。從表1可以看出，離子濃度的升高，使得脲酶活性差異顯著。不同濃度下，脲酶活性之間均差異顯著（P<0.05）。

分別對(duì)1.0 mol/L KCl+0.01 mol/L HCl與1.0 mol/L KCl、2.5 mol/L KCl+0.1 mmol/L Ag2SO4與2.5 mol/L KCl浸提劑對(duì)應(yīng)的酶活性進(jìn)行比較，結(jié)果見圖1。0.01 mol/L HCl的加入使得測(cè)定的土壤脲酶活性增強(qiáng)58%，可見HCl能有效抑制脲酶對(duì)尿素的進(jìn)一步水解，增強(qiáng)脲酶活性，特別是第1種對(duì)照處理。第1種對(duì)照是先于尿素將提取劑與抑制劑混合液加入到土壤中，測(cè)得的脲酶活性是0.098 μg/（kg·h）；第2種對(duì)照測(cè)得的脲酶活性是 0.013 μg/（kg·h）。2.5 mol/L KCl+0.1 mmol/L Ag2SO4與2.5 mol/L KCl等2種浸提劑測(cè)得的脲酶活性略有差異，分別為0.035、0.036 0 μg/（kg·h）。

由圖2表明，第2種對(duì)照中，2.0 mol/L KCl作為浸提劑測(cè)得的脲酶活性最強(qiáng)，為0.024 μg/（kg·h）；1.0 mol/L KCl+0.01 mol/L HCl作為浸提劑時(shí)測(cè)得的土壤脲酶活性最弱。1.0 mol/L KCl+0.01 mol/L HCl作為浸提劑明顯弱于2.5 mol/L KCl+0.1 mmol/L Ag2SO4與2.0 mol/L KCl。

2.2 不同對(duì)照設(shè)置對(duì)于脲酶活性的影響

分別選取1.0 mol/L KCl+0.01 mol/L HCl、2.5 mol/L KCl+0.1mmol/L Ag2SO4、2.0 mol/L KCl分別進(jìn)行不同對(duì)照處理脲酶活性測(cè)定。一組對(duì)照設(shè)置方法是在培養(yǎng)（2 h）結(jié)束后再加入底物尿素（對(duì)照培養(yǎng)），另一組對(duì)照試驗(yàn)過程與處理組同時(shí)加入底物，但是對(duì)照不進(jìn)行2 h的培養(yǎng)（對(duì)照不培養(yǎng)）。1.0 mol/L KCl+0.01 mol/L HCl、2.5 mol/L KCl+0.1 mmol/L Ag2SO4、2.0 mol/L KCl作為浸提劑時(shí)，對(duì)照培養(yǎng)組土樣脲酶活性明顯高于對(duì)照不培養(yǎng)組，當(dāng)浸提劑為 2.5 mol /L KCl、0.1 mmol/L Ag2SO4時(shí)，培養(yǎng)組脲酶活性是不培養(yǎng)組的1.6倍；當(dāng)浸提劑是2.0 mol/L KCl是，培養(yǎng)2 h的脲酶活性是不培養(yǎng)的3倍，特別是在浸提劑為1.0 mol/L KCl+0.01 mol/L HCl時(shí)，對(duì)照培養(yǎng)測(cè)得的土壤脲酶活性是對(duì)照不培養(yǎng)的7.53倍，第2種對(duì)照下3種浸提劑得到的脲酶活性均弱于第1種對(duì)照中相同浸提劑得到的脲酶活性（圖3）。

3 討論

從水解尿素的土壤脲酶發(fā)現(xiàn)以來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其來源、作用、性質(zhì)等進(jìn)行了研究，取得了許多重要進(jìn)展[1-4，12-15]。非甲苯法顧名思義是指試驗(yàn)過程中沒有甲苯的加入，甲苯在脲酶活性測(cè)定方面[2]被用作土樣的前處理試劑，它的加入可以殺死土壤中的微生物，使得水解脲酶產(chǎn)生的銨態(tài)氮全部來自于脲酶對(duì)于尿素的水解。目前，對(duì)于脲酶活性的測(cè)定許多學(xué)者選用的是添加甲苯的方法[1，9，16]，然而對(duì)于甲苯對(duì)脲酶活性影響的研究結(jié)論[7，16-19]卻大相徑庭，如Dalal等認(rèn)為甲苯能降低脲酶活性[18]，Tabatabai等卻發(fā)現(xiàn)甲苯會(huì)增大脲酶活性[19]。此外，Kandeler等的研究結(jié)果表明，甲苯作為一種外來添加物，對(duì)于脲酶活性的測(cè)定有著明顯但不確定的影響，因而非甲苯法測(cè)得的脲酶活性可能更加接近于土壤脲酶活性的真實(shí)數(shù)值[7]。

土壤脲酶活性的檢測(cè)，往往選擇2.0 mol/L KCl作為浸提劑。然而，Tabatabai等為了防止浸提過程中脲酶繼續(xù)水解樣品進(jìn)而對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生誤差，建議在浸提過程中添加HCl或者Ag2SO4等來抑制脲酶活性[7-8]。此外，對(duì)于浸提劑的濃度，也有學(xué)者使用高于或低于2.0 mol/L KCl的濃度來測(cè)定離子濃度對(duì)土壤脲酶活性的影響[10]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)于不同濃度（1.0、2.0、2.5 mol/L）KCl浸提劑而言，測(cè)得的脲酶活性與離子濃度并不是明顯的正相關(guān)關(guān)系，而是先增強(qiáng)后減弱，浸提劑的效率并非因?yàn)殡x子濃度的提高而增強(qiáng)，浸提劑離子濃度為2.0 mol/L時(shí)測(cè)得的脲酶活性最強(qiáng)。這可能是由于低濃度浸提劑對(duì)NH4+的提取效率相對(duì)較低，但并不是濃度越高就越有利于提取，高濃度可能影響到脲酶活性的比色，進(jìn)而降低脲酶活性。

對(duì)于HCl和Ag2SO4這2種抑制劑而言，HCl的加入能夠明顯增強(qiáng)脲酶活性，這可能是由于抑制劑的加入提高了浸提率，或者HCl能夠有效抑制尿素的進(jìn)一步水解，進(jìn)而提高脲酶活性。但是Ag2SO4產(chǎn)生的抑制效果不明顯，這是因?yàn)锳g2SO4對(duì)脲酶沒有抑制作用，且2.5 mol/L KCl+0.1 mmol/L Ag2SO4中浸提劑2.5 mol/L KCl的離子濃度太高，在影響比色的同時(shí)掩蓋了抑制劑的抑制效果。

對(duì)照培養(yǎng)2 h組更易于獲得較高的脲酶活性，原因在于對(duì)照培養(yǎng)后土壤留有余溫，使得尿素加入后，脲酶會(huì)借助余溫繼續(xù)水解尿素，進(jìn)而導(dǎo)致測(cè)得的脲酶活性強(qiáng)于對(duì)照不培養(yǎng)組。對(duì)于脲酶活性較弱的土樣在測(cè)定脲酶活性時(shí)建議選擇對(duì)照培養(yǎng)的處理方式。

4 結(jié)論

不同浸提劑對(duì)應(yīng)的脲酶活性具有明顯差異。對(duì)照培養(yǎng)條件下當(dāng)浸提劑為1.0 mol/L KCl+0.01 mol/L HCl時(shí)，脲酶活性達(dá)到最高，為0.098 μg/（kg·h）；浸提劑為2.5 mol/L KCl+0.1 mmol/LAg2SO4時(shí)，測(cè)得的脲酶活性最低，為 0.035 μg/（kg·h）。對(duì)照不培養(yǎng)條件下，浸提劑為2 mol/L KCl時(shí)，測(cè)得的最強(qiáng)脲酶活性為0.024 μg/（kg·h）；浸提劑1.0 mol/L KCl+0.01 mol/L HCl時(shí)，測(cè)得的最小脲酶活性為0.013 μg/（kg·h）。

對(duì)照培養(yǎng)組比對(duì)照不培養(yǎng)組更容易獲得較強(qiáng)的脲酶活性，當(dāng)浸提劑分別為2.5 mol/L KCl+0.1 mmol/L Ag2SO4、2.0 mol/L KCl、1.0 mol/L KCl+0.01 mol/L HCl 時(shí)，對(duì)照培養(yǎng)組土壤脲酶活性分別是對(duì)照不培養(yǎng)的1.6、3.0、7.5倍。對(duì)照培養(yǎng)測(cè)得的脲酶活性高于對(duì)照不培養(yǎng)組，在今后的試驗(yàn)中對(duì)于土壤脲酶活性較弱的土樣建議采用對(duì)照培養(yǎng)的方式處理。

抑制劑的加入能有效抑制脲酶進(jìn)一步水解，1.0 mol/L KCl+0.01 mol/L HCl 的脲酶活性是1.0 mol/L KCl的1.58 倍，而2.5 mol/L KCl+0.1 mmol/L Ag2SO4與2.5 mol/L KCl的差異較小，僅為0.001 μg/（kg·h）。對(duì)于2種抑制劑而言，0.01 mol/L HCl的抑制效果好于0.1 mmol/L Ag2SO4。

參考文獻(xiàn)：

[1]關(guān)松蔭. 土壤酶及其研究法[M]. 北京：農(nóng)業(yè)出版社，1986：294-312.

[2]和文祥，朱銘莪. 陜西主要土壤脲酶活性與土壤肥力關(guān)系的研究[J]. 土壤學(xué)報(bào)，1997，34（4）：392-398.

[3]王 家，趙陽陽，代 潭，等. Cu、Cd污染對(duì)土壤脲酶活性的影響研究[J]. 環(huán)境科學(xué)與管理，2014，39（11）：45-48.

[4]豐 驍，段建平，蒲小鵬，等. 土壤脲酶活性兩種測(cè)定方法的比較[J]. 草原與草坪，2008（2）：70-72.

[5]黃 娟，李 稹，張 健. 改良靛酚藍(lán)比色法測(cè)土壤脲酶活性[J]. 土木建筑與環(huán)境工程，2012（1）：102-107.

[6]和文祥，朱銘莪，張一平. 汞、鎘對(duì)土壤脲酶活性影響的研究Ⅰ.尿素濃度[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2002，13（2）：191-193.

[7]Kandeler E，Gerber H. Short-term assay of soil urease activity using colorimetric determination of ammonium [J]. Biol Fert Soils，1988，6：68-72.

[8]Singh K P，Μandal T N，Tripathi S K，et al. Patterns of restoratim of soil physicochemical properties and microbial biomass in different landslide sites In the sal forest ecosystem of Nepal Himalaya[J]. Ecological of Engineering，2001，17（4）：385-401.

[9]Tahatabai Μ A，Bremner Μ J，et al. And assay of urease activity in soil[J]. Soil Biol Biocheu，1972（4）：479-487.

[10]Singh D K，Kumar S. Nitrate reductase，arginine deaminase，urease and dehydrogenase activities in natural soil （ridges with forest） and in cotton soil after acetamiprid treatments[J]. Chemosphere，2008，71（3）：412-418.

[11]韓建剛，曹 雪.典型濱海濕地干濕交替過程氮素動(dòng)態(tài)的模擬研究[J]. 環(huán)境科學(xué)，2013，34（6）：2383-2389.

[12]Μanunza B，Deiana S，Pintore Μ，et al. The binding uechanism of urea，hydroxamic acid and N-（N-butyl）-phosphoric trioxide to the urease active site：a comparative molecular dynamics study [J]. Soil Biol & Biocheu，1999，31：789-796.

[13]Dalal R C.Distribution，salinity，kinetics and thermodynamic characteristics of urease activity in vertical profile[J]. Aust J Soil Res，1985，23（1）：49-60.

[14]Pettit N M，Smith A R，F(xiàn)reedman R B，et al. Soil urease - activity，stability and kinetic-properties[J]. Soil Biology & Biochemistry，1976，8（6）：479-484.

[15]Burns R G. Enzyme activity in soil：location and a possible role in uicrobial ecology[J]. Soil Biol & Biochem，1982，12：432-427.

[16]和文祥，蔣 新，朱茂旭，等. 甲苯對(duì)土壤脲酶活性的影響[J]. 環(huán)境科學(xué)，2001，22（6）：123-126.

[17]Zantua Μ I，Bremner J Μ. Comparison of methods of assaying urease activity in soils [J]. Soil Biol & Biocheu，1975，7：291-295

[18]Dalal R C. Efficient toluene on the energy barriers in urease activity of soils[J]. Soil Science，1975，120（4）：256-260.

[19]Tabatabai Μ I，Bremner J Μ. Assay of ureaseactivity in soils [J]. Soil Biol & Biochem，1972，4：479-487.