楊秀榮+王慶容+劉惠茹

摘要：以黃顙魚肝臟為試驗(yàn)材料，用TRIzol法提取肝臟組織總RNA，將試驗(yàn)樣品置于不同溫度下保存，在1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測RNA的質(zhì)量。結(jié)果顯示：在低溫沒有密封儲存的情況下，RNA保存較長時間，完整性好；-70 ℃下RNA可以保存8個月，-20 ℃下RNA可以保存4個月；在其他溫度條件下，若密封保存，4 ℃下可保存2周，10 ℃下可保存4 d以上，20 ℃下保存3 d時條帶清晰，保存4 d時條帶模糊，30 ℃下保存2.5 d時條帶變得模糊，到3 d時全部降解，40 ℃下保存1 d條帶清晰，保存2 d條帶變得模糊，保存2.5 d時完全降解。此外應(yīng)注意的是，RNA如果暴露于空氣中，5 h內(nèi)所有試驗(yàn)組的RNA大多數(shù)降解。

關(guān)鍵詞：黃顙魚；肝臟總RNA；保存溫度；RNA完整性

中圖分類號：S917 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）11-0258-03

近年來，分子生物學(xué)各項(xiàng)技術(shù)無論在醫(yī)學(xué)方面還是生物學(xué)方面的各個領(lǐng)域均得到廣泛應(yīng)用，高質(zhì)量的RNA則是其他后續(xù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)。如Northern bolt及雜交分析、寡聚（dT）纖維素選擇分離mRNA、cDNA文庫的構(gòu)建、逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reversetranscriptase-polymerase chain reaction，簡稱RT-PCR）、RNA原位雜交、轉(zhuǎn)基因材料鑒定、基因克隆及其表達(dá)等試驗(yàn)的成敗，在很大程度上取決于RNA的質(zhì)量[1]，對于RNA的質(zhì)量評價(jià)，完整性和均一性是其關(guān)鍵因素[2]。RNA特殊的單鏈結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其自身結(jié)構(gòu)極不穩(wěn)定，加上周圍環(huán)境中廣泛分布RNA酶（RNase）并且難以滅活，導(dǎo)致RNA很容易降解。有些試驗(yàn)過程中使用RNA的時間跨越度較大，因此確定RNA在不同溫度下能保存的最長時間就尤其重要。關(guān)于不同溫度對RNA質(zhì)量的影響及不同保存溫度下RNA能夠保存的最長時間方面的研究，目前相關(guān)報(bào)道較少。本試驗(yàn)以黃顙魚肝組織RNA為試驗(yàn)材料，研究不同保存溫度對RNA質(zhì)量的影響，以期為分子生物學(xué)研究者日后如何保存RNA提供可行性參考。

1 材料與方法

1.1 試劑配制

0.5×TBE的配制。將10.8 g Tris、5.5 g硼酸、0.744 g EDTA-Na2溶解于經(jīng)高溫滅菌的2 000 mL蒸餾水中，充分搖勻，調(diào)節(jié)pH值至8.0。

瓊脂糖凝膠的制備。取0.7 g瓊脂糖溶解于盛有70 mL 0.5×TBE溶液的藍(lán)蓋瓶中，將其放入微波爐中反復(fù)加熱3～4次，直至瓊脂糖完全溶解；待膠液冷卻至60 ℃，向其中加入7 μL GoldViewⅠ型核酸染色劑（其中瓊脂糖的比例為1%，核酸染料的比例為0.01%），將膠液倒入事先已清洗干凈、晾干且插入制膠梳子的膠槽之中，等到膠塊冷卻凝固后，即可將梳子拔出，完成用于電泳的瓊脂糖膠塊制作。

1.2 RNA的提取與檢測

1.2.1 TRIzol法提取總RNA[3] 取健康黃顙魚，用剪刀鈍處猛擊其頭部使其昏厥，立即由瀉殖孔剪至鰓蓋后緣，迅速取肝臟組織（50 mg），將所取組織塊放入1.5 mL EP管內(nèi)并迅速置于液氮中速凍。

向提前滅菌的研缽中倒入液氮以預(yù)冷研缽、研缽棒，采用液氮冷凍組織的方法，將組織置于液氮中充分研磨5 min（在研磨過程中要注意及時補(bǔ)充液氮），最終將組織研磨至粉狀。用經(jīng)高溫消毒的小鑰匙將粉末集中，加入2 000 μL TRIzol試劑以充分破碎細(xì)胞組織（按每100 mg組織加入4 000 μL計(jì)算），待解凍后轉(zhuǎn)入2個1.5 mL EP管內(nèi)，離心5 min（13 000 g，4 ℃）。取900 μL上清液轉(zhuǎn)至新的1.5 mL EP管中，加入400 μL三氯甲烷，用力振蕩搖勻，室溫靜置5 min，離心15 min（13 000 g，4 ℃）。將上清液合并于新的1.5 mL EP管中，加入400 μL三氯甲烷，用力振蕩搖勻，室溫靜置2～3 min，離心15 min（13 000 g，4 ℃）。取上清液于另1支EP管中，加入等體積異丙醇，輕輕搖勻，冰上靜置15 min，離心15 min（13 000 g，4 ℃）。棄上清，向白色沉淀中加入用 1 000 μL DEPC水配制的75%乙醇清洗沉淀（輕搖混勻），離心5 min（13 000 g，4 ℃），倒掉上清液。真空干燥RNA沉淀，溶解于30 μL DEPC水中。整個總RNA提取過程均在冰上進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)臺經(jīng)70%乙醇消毒，鐵制試驗(yàn)器具經(jīng)200 ℃高溫消毒300 min，塑料器具置于DEPC水中浸泡過夜后高溫滅菌 40 min，試驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照規(guī)范操作，以防RNA酶污染。

1.2.2 RNA質(zhì)量檢測 通過瓊脂糖凝膠電泳的方法對各組RNA進(jìn)行檢測：將膠板沒于0.5×TBE的電泳液中，取5 μL RNA樣品與1 μL 6×載樣緩沖液（loading buffer）混勻后加至點(diǎn)樣孔中，130 V 電壓電泳20 min，此時條帶已接近膠塊中央[4]，將膠塊置于凝膠成像分析儀下觀察并拍照記錄試驗(yàn)結(jié)果。

1.3 RNA的保存

黃顙魚肝組織總RNA保存條件見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA的提取

所提RNA通過瓊脂糖凝膠電泳后于凝膠成像分析儀下觀察，圖1顯示，所提RNA均出現(xiàn)28S、18S條帶，條帶清晰無拖尾，且28S灰度值 ∶18S灰度值>1 ∶1，接近2 ∶1，說明所提RNA的完整性好。

2.2 不同保存溫度對RNA質(zhì)量的影響

將不同溫度下保存的RNA樣品通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行完整性檢測，電泳結(jié)果顯示：儲存在-70 ℃且未放入消毒袋中保存的RNA，8個月后，RNA樣品具有清晰的18S、28S條帶，且28S灰度值 ∶18S灰度值>1 ∶1，說明RNA的完整性良好，降解程度低（圖2-A）。儲存于-20 ℃且未放置于消毒袋中的RNA，即直接與周圍環(huán)境接觸，4個月后，RNA樣品具有較為清晰的18S、28S條帶，且28S灰度值 ∶18S灰度值>1 ∶1，證明RNA較完整（圖2-B）。保存于4 ℃下的RNA樣品如果直接與空氣接觸，儲存5 h后，RNA18S、28S條帶幾乎完全消失；如果保存于消毒袋中，14 d后，從圖2-C中可以看到18S、28S條帶，證明RNA完整性較好。10 ℃下儲存的RNA樣品，如果沒有放于消毒袋中，1 h后條帶幾乎全部降解；如果儲存于消毒袋中，經(jīng)過1、2、3、4、5 h的保存，條帶沒有發(fā)生明顯變化，儲存1 d的RNA樣品具有清晰的18S、28S條帶且28S灰度值 ∶18S灰度值>1 ∶1，儲存 3 d 的18S、28S條帶灰度值的比值減小，即已部分發(fā)生降解，當(dāng)儲存5 d時，條帶變得非常模糊，說明RNA大部分已經(jīng)降解（圖3）。在20、30、40 ℃溫度條件下，RNA如果暴露于空氣之中，儲存1 h后，幾乎不能觀察到條帶，如果保存于消毒袋中，20 ℃保存的RNA在經(jīng)歷1、2、3、4、5 h后，條帶沒有發(fā)生變化，仍具有清晰的18S、28S條帶，保存1、3 d后，條帶仍較為清晰，保存4 d后，RNA條帶開始模糊，即開始發(fā)生降解（圖4）。30 ℃ 下保存的RNA在經(jīng)過1、2、3、4、5 h時，條帶沒有發(fā)生明顯變化，保存1 d后條帶較為清晰，保存 2.5 d 時條帶開始模糊，保存3 d時，18S、28S條帶全部消失（圖5）。在40 ℃條件下，RNA在保存1 d時，條帶亮度明顯低于其他溫度下保存的RNA樣品；保存2 d后，18S、28S條帶全部消失（圖6）。

3 討論

3.1 RNA質(zhì)量的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

RNA的濃度、純度、完整性是評價(jià)RNA質(zhì)量的主要標(biāo)準(zhǔn)[5]。此外，通過比較RT-PCR產(chǎn)物也可以對RNA的質(zhì)量進(jìn)行評價(jià)，分子雜交放射自顯影檢測也可以對RNA質(zhì)量進(jìn)行評價(jià)[6]，實(shí)時定量PCR法也是RNA質(zhì)量檢測的方法之一?？赏ㄟ^核酸蛋白測定儀檢測RNA質(zhì)量濃度及RNA的D260 nm/D280 nm值以確定RNA樣品的純度[7]，如果D260 nm/D280 nm 值在1.8～2.0之間則說明RNA的純度較高；采用RT-PCR法檢驗(yàn)RNA的質(zhì)量，因多糖等雜質(zhì)的污染會在很大程度上抑制RNA的逆轉(zhuǎn)錄，當(dāng)RNA不純時，就會導(dǎo)致RNA逆轉(zhuǎn)錄的失敗，如果RNA的完整性不高，即使有微量的降解也會使mRNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA長度大大減小，導(dǎo)致RT-PCR的失敗[8]。RNA完整性的測定可通過瓊脂糖凝膠電泳的方法，通過在凝膠成像分析儀下進(jìn)行分析來完成對RNA完整性的分析鑒定，若RNA具有清晰的18S、28S條帶，且條帶均一無拖尾現(xiàn)象[9]、28S灰度值 ∶18S灰度值>1 ∶1，提示無明顯降解[10]，說明RNA完整性好。本試驗(yàn)采用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性的方法來評價(jià)RNA的質(zhì)量，如果電泳結(jié)果顯示RNA樣品具有18S、28S條帶，且條帶清晰無拖尾，此外28S灰度值 ∶18S灰度值>1 ∶1，則說明RNA的完整性好，即降解少。本試驗(yàn)所采取的瓊脂糖凝膠電泳來檢測RNA質(zhì)量的方法基本上可以實(shí)現(xiàn)對RNA完整性的分析，但是由于試驗(yàn)過程中專門用于拍攝電泳圖片的相機(jī)出現(xiàn)故障，為了記錄試驗(yàn)結(jié)果，采取普通相機(jī)拍攝的方法，最終導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果所顯示的圖片顏色不一致，出現(xiàn)一定的色差。

3.2 影響RNA質(zhì)量的因素

影響RNA質(zhì)量的最大因素是RNA本身的單鏈結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其很容易被降解，另外RNA酶分布廣泛，難以滅活，從而極易導(dǎo)致RNA的降解。所以在試驗(yàn)過程中提高RNA質(zhì)量最重要的措施就是避免RNA酶的污染[11-12]。本試驗(yàn)顯示，溫度也是影響RNA質(zhì)量的1個關(guān)鍵因素，不同溫度下儲存RNA的時間相同，溫度越低，RNA的質(zhì)量變化越緩慢。相同溫度下RNA儲存不同時間，時間越長，RNA的完整性也越低，即隨著時間的增長，RNA也在逐步被降解。

3.3 對分子生物學(xué)試驗(yàn)者的建議

由本研究初步得出結(jié)論：儲存RNA時，最重要的是選擇能夠降低RNA酶活性或者除去RNA酶的手段，如果對RNA需要進(jìn)行長時間的儲存，應(yīng)選擇-20、-70 ℃的溫度進(jìn)行保存，如果保存RNA在1周以內(nèi)，且能夠保證RNA得到良好的密封時，可以選擇于4 ℃進(jìn)行保存。

參考文獻(xiàn)：

[1]李 萍，熊 凡，富 青，等. 一種簡便的RNA完整性檢測方法[J]. 湖北中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，7（3）：39-40.

[2]李維凱，霍韜光，暢 蓓，等. 保存條件對大鼠海馬組織總RNA質(zhì)量的影響[J]. 化學(xué)研究，2012，23（5）：93-96.

[3]李冬民，任吳超，王 璇，等. 利用TRIzol試劑和液氮提取大鼠胰腺高質(zhì)量總RNA[J]. 西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2009，30（5）：639-642.

[4]梁婧嫻，陳志成，賀慶華，等. 檢測總RNA質(zhì)量的兩種方法比較研究[J]. 西南民族大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2012，38（1）：69-72.

[5]史紅鴿，戚元成，申進(jìn)文. 一種從平菇菌絲中提取總RNA的方法[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2014（8）：68-70.

[6]洪 敏，周曉萍，劉劍凱. 冷酚法提取RNA及質(zhì)量鑒定[J]. 吉林大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，1992，18（2）：105-107.

[7]張 杰，武晶晶，趙飛飛，等. 不同溫度和不同放置時間對總RNA提取濃度和純度的影響[J]. 實(shí)驗(yàn)技術(shù)與管理，2013（11）：79-82，86.

[8]江 莎，孟 凡，周振雷，等. 熒光Real-time PCR鑒定雞胸骨總RNA質(zhì)量[J]. 生物學(xué)雜志，2012，29（5）：92-95.

[9]徐 航，劉仁祥，徐如宏，等. 煙草RNA提取方法的優(yōu)化及冰盒儲存時間的探討[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014（3）：495-500.

[10]路俊鋒，陳 宏，吳勁松，等. 不同保存方法對腦膠質(zhì)瘤和其周邊組織RNA保存的研究[J]. 中國臨床神經(jīng)科學(xué)，2010，18（2）：199-202.

[11]吳旭東，侯玉霞，張文吉. 黃河鲇不同組織中RNA提取純化方法研究[J]. 淡水漁業(yè)，2006，36（2）：24-26.

[12]楊 佳，吳詩杰，王淑萍，等. 發(fā)菜總RNA提取方法的比較與優(yōu)化[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（9）：58-60.