宋慧+王毓洪+張香琴

摘要：以耐濕澇瓠瓜類型砧木材料JZS與不耐濕澇材料T2002為遺傳作圖雙親，利用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（random amplification polymorphic DNA，簡稱RAPD）法與瓠瓜及其他近源瓜類簡單重復(fù)序列（simple sequence repeat，簡稱SSR）進(jìn)行多態(tài)性分析。從供試1 678個(gè)RAPD、SSR標(biāo)記中共篩選到26個(gè)多態(tài)性引物，其中包括14個(gè)RAPD、4個(gè)瓠瓜SSR、2個(gè)甜瓜SSR、5個(gè)黃瓜SSR、1個(gè)南瓜SSR，擴(kuò)增出28個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。幾種標(biāo)記多態(tài)性檢測效率不同，瓠瓜SSR引物揭示，雙親多態(tài)性比例最高（0.47%），其次是RAPD（0.38%），近源瓜類SSR選擇效率最低，僅有0.14%～0.15%。結(jié)果表明，盡管瓠瓜作圖親本表型差異大，但分子標(biāo)記結(jié)果顯示親本遺傳背景相近；甜瓜、黃瓜和南瓜與瓠瓜親緣關(guān)系遠(yuǎn)，具有種屬特異性的SSR引物在瓠瓜親本JZS、T2002多態(tài)性分析中通用性不高。為了提高分子標(biāo)記多態(tài)性分析效率，繪制高密度遺傳圖譜，下一步應(yīng)盡快開展基于基因組測序技術(shù)檢測單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，簡稱SNP）位點(diǎn)的研究。

關(guān)鍵詞：瓠瓜；砧木；多態(tài)性分析；耐濕澇

中圖分類號： S184 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）11-0048-03

我國約有2/3的國土面積存在不同程度的濕澇脅迫，嚴(yán)重影響黃瓜、西瓜和甜瓜等瓜類作物種植生產(chǎn)[1]。瓠瓜[Lagenaria siceraria （Molina） Standl.]根部發(fā)達(dá)，用作瓜類嫁接砧木，能夠增強(qiáng)接穗耐逆性，提高產(chǎn)量[2]。耐濕澇瓠瓜砧木的選育已成為瓠瓜育種的重要目標(biāo)之一。

瓠瓜耐濕澇特性是由多基因控制的數(shù)量遺傳性狀[3]。前期筆者通過集團(tuán)混合分離分析法（bulked segregation analysis，簡稱BSA），以不定根數(shù)作為鑒定指標(biāo)，篩選到簡單重復(fù)序列（simple sequence repeat，簡稱SSR）引物S87/88與瓠瓜耐濕澇性狀相關(guān)性為0.78，這與瓠瓜耐濕澇特性目的基因尚存在較大遺傳距離[4]，影響分子輔助選擇的正確性，亟須通過遺傳圖譜構(gòu)建和耐濕澇數(shù)量性狀基因座（quantitative trait locus，簡稱QTL）定位等手段為瓠瓜耐濕澇分子育種提供緊密連鎖分子標(biāo)記。

SSR引物具有種屬特異性，瓠瓜基因組研究相對于黃瓜、西瓜和甜瓜等瓜類作物相對薄弱，僅有浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院李國景研究員所在課題組的相關(guān)報(bào)道[5]，瓠瓜SSR開發(fā)數(shù)目有限。為此，筆者所在課題組利用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（random amplification polymorphic DNA，簡稱RAPD）、瓠瓜SSR及其他近源瓜類SSR，對瓠瓜類型砧木遺傳作圖雙親（耐濕澇材料JZS與不耐濕澇材料T2002）進(jìn)行多態(tài)性分子標(biāo)記分析，以期為瓠瓜遺傳圖譜構(gòu)建和耐濕澇QTL定位研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

所用材料為瓠瓜類型砧木耐濕澇材料JZS、不耐濕澇材料T2002及其F1代。將種子播種于32孔穴盤中，按常規(guī)方法進(jìn)行田間管理。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取 材料播種后，待植株長至5～6張真葉時(shí)，每份樣品各取10張單株的混合葉片，每株采集1 g嫩葉，于-80 ℃保存。參照CTAB法，提取新鮮葉片總基因組DNA。

1.2.2 分子標(biāo)記分析 甜瓜SSR引物序列由美國威斯康星大學(xué)園藝系翁益群教授提供，瓠瓜SSR引物序列由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所李國景研究員提供。RAPD、SSR的混樣體系為20μL，包括3.24 μL dNTP（1.25 mmol/L）、1.5 μL 10×buffer、2.43 μL MgCl2（25 mmol/L）、1.35 μL引物（5 mmol/L）、5 μL DNA（10 ng/μL）、0.05 μL Taq DNA聚合酶（1 U）。RAPD、SSR的PCR產(chǎn)物分別用2%瓊脂糖凝膠和高分辨率MS-6瓊脂糖凝膠（TaKaRa，上海）水平電泳檢測。

1.3 數(shù)據(jù)記錄與連鎖分析

根據(jù)相同遷移率位置表現(xiàn)出的差異帶型，確定在雙親中顯示差異的分子標(biāo)記，用于多態(tài)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 RAPD引物在雙親中的擴(kuò)增和多態(tài)性篩選

600對RAPD引物分別在雙親JZS、T2002中擴(kuò)增出4 188、4 197個(gè)條帶，平均每個(gè)引物產(chǎn)生6.99個(gè)條帶（表1）。篩選到14個(gè)RAPD引物（分別編號為P21、P38、P77、P79、P80、P86、P184、P214、P237、P284、P289、P366、P421、P589），共擴(kuò)增出16個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)（圖1）。RAPD引物揭示雙親的多態(tài)性比例為0.38%。

2.2 瓠瓜SSR在雙親中的擴(kuò)增和多態(tài)性篩選

100對瓠瓜SSR引物分別在雙親JZS、T2002中擴(kuò)增出852、854個(gè)條帶，平均每個(gè)引物產(chǎn)生8.53個(gè)條帶（表1）。篩選到4對引物（分別為S35/36、S45/46、S49/50、S87/88），共擴(kuò)增出4個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)（圖2）。瓠瓜SSR引物擴(kuò)增結(jié)果顯示，親本材料的多態(tài)性比例為0.47%，高于RAPD揭示的多態(tài)性比例（0.38%）。

2.3 甜瓜SSR、黃瓜SSR和南瓜SSR在雙親中的擴(kuò)增和多態(tài)性篩選

分別使用251對甜瓜SSR、595對黃瓜SSR和132對南瓜SSR對雙親JZS、T2002進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果篩選到2對甜瓜SSR（T35/36、T193/194）、5對黃瓜SSR（H37/38、H41/42、H49/50、H61/62、H241/242）和1對南瓜SSR（N15/16）（圖3），3種SSR引物揭示雙親多態(tài)性比例分別為0.14%、0.15%、0.14%，低于RAPD引物（0.38%）、瓠瓜SSR（0.47%）揭示的多態(tài)性比例。

3 討論

作物耐濕澇特性是較為復(fù)雜的數(shù)量性狀，國內(nèi)外有關(guān)耐濕澇的研究多集中在小麥[6]、大麥[7]、玉米[8]等大田經(jīng)濟(jì)作物，葫蘆科作物中除了模式作物黃瓜有少量報(bào)道[9]以外，鮮有報(bào)道提及其他瓜類作物的耐濕澇研究。瓠瓜根系發(fā)達(dá)，耐濕澇特性突出，是瓜類作物耐濕澇性狀改良的重要基因庫。盡管眾多葫蘆科作物很早就被用來開展利用分子遺傳圖譜定位重要農(nóng)藝性狀的研究[10-11]，但是針對瓠瓜耐濕澇特性QTL定位的研究未見開展，從而制約了進(jìn)一步利用分子手段改良瓜類作物耐濕澇特性的研究進(jìn)程。

瓠瓜表型變異大，但從分子標(biāo)記研究結(jié)果來看，瓠瓜遺傳背景狹窄。在本研究中，幾種標(biāo)記多態(tài)性檢測效率不同，瓠瓜SSR、RAPD揭示耐濕澇親本JZS和不耐濕澇親本T2002的多態(tài)性比例分別只有0.47%、0.38%，而選用的近源瓜類SSR選擇效率更低，多態(tài)性比例僅為0.14%～0.15%，一方面表明作圖親本JZS和T2002親緣關(guān)系近，另一方面表明甜瓜、黃瓜、南瓜與瓠瓜親緣關(guān)系遠(yuǎn)，基于種屬特異性的SSR引物在JZS、T2002多態(tài)性分析中通用性不高。

Neuhausen認(rèn)為，葫蘆科作物的基因組變化主要源于點(diǎn)突變[12]，因此RAPD、SSR這類基于擴(kuò)增片段多態(tài)性的分子標(biāo)記能夠檢測的多態(tài)性較低，有必要進(jìn)一步開展基于測序技術(shù)檢測單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)（SNP）的多態(tài)性研究，提高分子標(biāo)記分辨率，為繪制高密度遺傳圖譜奠定良好基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

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