趙銀龍+李健+朱海霞

摘要：病毒同源重組是以同源臂為基礎(chǔ)的將目的基因整合到病毒基因組中的技術(shù)。將表達(dá)盒串聯(lián)到轉(zhuǎn)移載體，通過(guò)同源重組構(gòu)建重組病毒從而實(shí)現(xiàn)病毒基因改造、外源基因表達(dá)以及重組活載體疫苗制備等。就重組病毒的優(yōu)缺點(diǎn)、構(gòu)建原理及應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行了概述，對(duì)重組病毒構(gòu)建的難點(diǎn)進(jìn)行了分析，全面系統(tǒng)地闡述了重組病毒的構(gòu)建模式，針對(duì)基因框（啟動(dòng)子-報(bào)告基因-目的基因-調(diào)控元件-終止子）給出具體的構(gòu)建方案，同時(shí)對(duì)其未來(lái)發(fā)展前景進(jìn)行了展望，以期為今后重組病毒的構(gòu)建提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：同源重組；表達(dá)盒；轉(zhuǎn)移載體；重組病毒；病毒載體

中圖分類號(hào)： S852.65 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）11-0001-05

病毒分子生物學(xué)和免疫學(xué)的發(fā)展使得從事病毒研究的人員得以從分子水平上對(duì)微生物的基因進(jìn)行克隆和表達(dá)，對(duì)病毒進(jìn)行體外改造逐漸成為現(xiàn)代病毒分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。國(guó)內(nèi)外學(xué)者利用DNA重組技術(shù)先后開(kāi)展了包括亞單位疫苗、合成肽疫苗和核酸疫苗等新型疫苗的研究，并取得了一定的成果，但這些疫苗大多免疫原性較低。后來(lái)人們利用基因工程技術(shù)將免疫原性基因插入病毒（如腺病毒、痘病毒、偽狂犬病毒等）構(gòu)建活載體病毒，可產(chǎn)生一種具有常規(guī)弱毒疫苗和滅活苗效果的基因工程活載體疫苗。重組病毒作為疫苗可以部分模擬病毒入侵機(jī)體的過(guò)程，將病原的保護(hù)性抗原編碼基因片段或者重組多肽克隆入載體，誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性反應(yīng)，使機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的細(xì)胞免疫和體液免疫。

重組病毒的構(gòu)建是建立在體外同源重組的基礎(chǔ)上，篩選一個(gè)含親本毒株的復(fù)制非必需片段，通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)移載體與病毒基因組DNA之間的同源重組將外源基因?qū)氩《净蚪M中，既保留了親本毒株的生物學(xué)特性，又可使重組病毒得到復(fù)制增殖。目前，已有多種表達(dá)病原蛋白的重組病毒構(gòu)建成功，表達(dá)FMDV衣殼蛋白前體的P1-2A基因和蛋白酶3C基因的rPRV TK-/gE-/P1-2A-3C，能誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的中和抗體和FMDV特異的淋巴細(xì)胞反應(yīng)[1]。在國(guó)內(nèi)，郭萬(wàn)柱教授率先系統(tǒng)地開(kāi)展了偽狂犬病病毒（PRV）分子生物學(xué)研究[2]。同源重組是基因工程中常用的技術(shù)手段，在基因打靶和基因克隆方面具有重要作用。但該技術(shù)應(yīng)用于重組病毒研究又不同于反向遺傳操作技術(shù)（病毒拯救）、RNA干擾和PCR改造等，該方法避免了基因的直接體外操作，不會(huì)引入額外的DNA序列，簡(jiǎn)化了試驗(yàn)步驟。Rumenapf等利用桿狀病毒囊膜糖蛋白GP64的跨膜區(qū)域（TM）和細(xì)胞質(zhì)區(qū)域（CTD）在小鼠和豬中表達(dá)JEV的E蛋白也能誘導(dǎo)產(chǎn)生高效價(jià)的特異性抗體[3]。利用雞痘病毒成功表達(dá)了多種禽類病毒的保護(hù)性抗原基因，如IBDV的VP2基因、MDV的gB基因、AIV的HA基因、NDV的HN和F基因及REV的env基因等[4-8]。

1 轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建原理

1.1 表達(dá)盒的構(gòu)建

為了將外源基因插入親本病毒基因組，使構(gòu)建的重組病毒能真實(shí)有效地表達(dá)，必須串聯(lián)啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、標(biāo)記基因、終止子和Poly（A）等反應(yīng)元件（圖1）。其中啟動(dòng)子最為重要，決定著外源基因的表達(dá)水平。一般構(gòu)建表達(dá)盒帶有真核啟動(dòng)子CMV、T7和SV40等就能順利啟動(dòng)外源基因，也可以串聯(lián)2個(gè)啟動(dòng)子。而痘病毒應(yīng)用病毒自身的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)在胞漿內(nèi)復(fù)制，所以外源基因的表達(dá)要求使用痘病毒自身的內(nèi)源啟動(dòng)子 P7.5/11[9-12]。P7.5/11為早晚期串聯(lián)啟動(dòng)子，其結(jié)構(gòu)獨(dú)特，最重要的是P7.5/11非常保守，在痘病毒科重組病毒領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景[13]。另外，采用獨(dú)立的早晚期啟動(dòng)子分別啟動(dòng)報(bào)告基因和外源基因的表達(dá)（圖2），避免了翻譯時(shí)通讀的發(fā)生，增加了重組病毒的穩(wěn)定性。由于重組病毒表達(dá)的外源蛋白是宿主免疫反應(yīng)的目標(biāo)，因此使用病毒的晚期啟動(dòng)子表達(dá)外源基因有利于病毒逃避宿主的免疫反應(yīng)，建立持續(xù)感染[9]。

如果能在同一載體中插入來(lái)自不同病原的保護(hù)性抗原基因，實(shí)現(xiàn)多種抗原的共表達(dá)，這樣既可以同時(shí)對(duì)多種疾病進(jìn)行預(yù)防，又可以避免疫苗載體之間的相互干擾，最大限度地發(fā)揮重組病毒的效用（圖3）。重組病毒在遺傳上可能不穩(wěn)定，連續(xù)傳代后位于相同啟動(dòng)子之間的外源基因可能丟失[14]。為了降低重組病毒的遺傳不穩(wěn)定性，并克服多個(gè)相同啟動(dòng)子之間可能存在的干擾現(xiàn)象[15]，在1個(gè)MFG載體上使用了2個(gè)IRES元件，使3個(gè)外源基因同時(shí)得到有效表達(dá)。目前，研究外源基因多是B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位、抗原肽等。進(jìn)一步研究表明，應(yīng)用免疫轉(zhuǎn)移電泳法也確定了許多病毒中和抗原的主要結(jié)構(gòu)蛋白均為衣殼蛋白和糖蛋白，它們暴露于病毒粒子表面，可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體[16]。由于傳統(tǒng)滅活疫苗是外源性抗原，不能通過(guò)MHCI類抗原遞呈途徑來(lái)有效激活T淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫水平較低，因此利用病毒載體表達(dá)病原體抗原基因和適當(dāng)類型的細(xì)胞因子，通過(guò)表達(dá)細(xì)胞因子來(lái)發(fā)揮特定的免疫調(diào)節(jié)作用以提高重組病毒免疫效力，很多研究者在設(shè)計(jì)的抗原基因中增加了Th刺激因子，如2B、3ABC、3D、IFN-γ以及IL-1等部分序列[17]。

1.2 外源基因的靶向位點(diǎn)

作為良好的重組表達(dá)系統(tǒng)，親本病毒復(fù)制非必需區(qū)的克隆與篩選是先決條件。親本病毒基因組龐大，其中許多基因是病毒復(fù)制非必需的，可供作為外源基因靶向位點(diǎn)。但是，外源基因在不同的部位插入病毒基因組，可能會(huì)產(chǎn)生不同的效果。通常是構(gòu)建某段基因缺失的同源重組臂，這些基因是病毒的主要毒力基因，刪除相關(guān)的基因，使其不帶毒力或致弱毒力；但是病毒粒子仍然保持較好的抗原性，可以組裝成成熟的病毒粒子，為下一步重組病毒做準(zhǔn)備。在重組痘病毒、腺病毒、豬偽狂犬病毒和傳染性喉氣管炎病毒等研究中，廣泛采用了TK[18]、US2[19]、US10[19]、gB[20]、gD[20]、E3[21]、FL11[22]等外源基因的靶向位點(diǎn)。最初確定非必需區(qū)常常采用鳥槍法，盲目地克隆病毒基因組，再用于篩選，工作量大且繁瑣。隨著各病毒全基因組的逐漸公布，復(fù)制非必需區(qū)遺傳背景研究的深入，為確定非必需區(qū)的研究建立了豐富的理論基礎(chǔ)，可以實(shí)現(xiàn)僅用PCR技術(shù)就能獲得靶向位點(diǎn)，容易進(jìn)行遺傳操作。同源臂的長(zhǎng)短也是影響重組病毒構(gòu)建的重要因素，一般情況下在0.13～6.00 kbp之間都可以進(jìn)行有效的重組，Amano等采用 P7.5 啟動(dòng)下的lacZ作為報(bào)告基因，檢測(cè)同源臂長(zhǎng)度對(duì)于轉(zhuǎn)染效果的影響，當(dāng)片段長(zhǎng)度在0.73～4.50 kbp范圍時(shí)，獲得同源重組得到重組病毒的概率為0.073%～0.620%，說(shuō)明重組的效率主要和同源臂的長(zhǎng)度有關(guān)，和插入的基因無(wú)關(guān)[23]。

同源臂的構(gòu)建策略分為2類（圖4）。一類是外源基因靶向位點(diǎn)（TK為例）左右各延伸1段基因片段，因復(fù)制非必需區(qū)中包含酶切位點(diǎn)，單酶切后平末端需要Klenow補(bǔ)平，CIP去磷酸化，再去串聯(lián)表達(dá)盒（圖5），此方法連接效率低，影響同源重組；另一類是分別延伸靶向位點(diǎn)兩側(cè)的基因，構(gòu)建非必需區(qū)中間缺失的同源臂（圖6）。人為引入酶切位點(diǎn)，有利于連接，提高同源重組水平，為隨后的重組病毒構(gòu)建提供可靠的材料保證。

1.3 同源重組

利用PCR技術(shù)以病毒基因組為模板克隆目的基因，構(gòu)建親本病毒某段非必需區(qū)缺失的突變株，含左右同源臂。由于親本病毒一般基因組龐大，而且基因組DNA又沒(méi)有感染性，不便直接操作，通常是將轉(zhuǎn)移載體分開(kāi)構(gòu)建，既可以保證將外源基因靈活地插入轉(zhuǎn)移載體，也可以準(zhǔn)確地選擇合適的其他反應(yīng)元件，得到表達(dá)盒和同源臂2個(gè)獨(dú)立的系統(tǒng)，解決病毒構(gòu)建的前期工作。各個(gè)反應(yīng)元件都需要適合的酶切位點(diǎn)進(jìn)行串聯(lián)。最后將構(gòu)建好的含有表達(dá)盒的轉(zhuǎn)移載體和脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染病毒預(yù)先感染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，完成同源重組。基于所設(shè)計(jì)的轉(zhuǎn)移載體特性，傳統(tǒng)的同源重組方法是親本病毒感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞后再轉(zhuǎn)染。這種方法雖然可以產(chǎn)生重組病毒，但將親本病毒和重組病毒分開(kāi)較難，因?yàn)橹亟M效率本身低，重組病毒與親本病毒相比更不具有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，因而需要篩選多代才能獲得純化的重組病毒。目前常采用轉(zhuǎn)移載體和親本病毒基因組共轉(zhuǎn)染的方法，一般經(jīng)3代篩選即可獲得具有感染活性的重組子，方便以后重組病毒高效地表達(dá)外源基因[24]。

利用病毒存在廣泛的復(fù)制非必需區(qū)，構(gòu)建1個(gè)或多個(gè)不同病原體保護(hù)性基因的重組病毒。但病毒載體核酸序列較長(zhǎng)，對(duì)病毒基因進(jìn)行酶切和直接連接外源基因等遺傳操作比較困難，因此，同源重組在構(gòu)建重組病毒的研究中嶄露頭角。實(shí)際上重組病毒的效率不高，涉及諸多影響因素：（1）病毒載體的選擇。重組子表達(dá)的量依賴于親本病毒DNA的復(fù)制情況，由于病毒的復(fù)制能力具有較強(qiáng)的種類特異性，需要選擇適合的載體構(gòu)建不同的重組病毒。（2）外源基因的長(zhǎng)短。插入的目的片段太長(zhǎng)時(shí)，同源重組的效率很低，只有較短時(shí)才比較有效。（3）同源臂的長(zhǎng)短。研究表明常用的左右同源臂片段約是 1.0 kbp，過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短都會(huì)影響重組。（4）就基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理和重組活疫苗的生物安全而言，應(yīng)首選病毒自身的啟動(dòng)子，但是應(yīng)用中要選擇強(qiáng)啟動(dòng)子，才能使病毒滴度增高，外源基因在細(xì)胞中得以有效表達(dá)，并且有良好的免疫原性和遺傳穩(wěn)定性。（5）表達(dá)盒的串聯(lián)方式多種多樣，可以雙啟動(dòng)子順向連接、雙啟動(dòng)子反向連接、雙標(biāo)記基因等。如果標(biāo)記基因的啟動(dòng)子和另外一個(gè)外源基因的啟動(dòng)子是不同的，那么2個(gè)啟動(dòng)子無(wú)論相對(duì)位置如何，各自的啟動(dòng)效率和重組病毒的穩(wěn)定性都是一樣的，但如果2個(gè)啟動(dòng)子是相同的，且啟動(dòng)子的2個(gè)基因順向連接，那么重組病毒在傳代的過(guò)程中就有可能發(fā)生分子內(nèi)的啟動(dòng)子同源重組，將2個(gè)啟動(dòng)子之間的基因剪除，從而失去這一基因的表型。最終能篩選得到不帶選擇標(biāo)記的重組痘苗病毒，并具有篩選周期短、工作量小、較能準(zhǔn)確篩選重組病毒等優(yōu)點(diǎn)，非常適用于疫苗株的構(gòu)建[25]。

1.4 重組病毒的篩選

以報(bào)告基因?qū)Ρ磉_(dá)盒的功能進(jìn)行驗(yàn)證，篩選出具有高效表達(dá)蛋白能力的重組病毒。常用的途徑：（1）β-半乳糖苷酶基因（LacZ）是來(lái)自大腸桿菌乳糖操縱子中的一個(gè)基因，其最大的優(yōu)勢(shì)是易于用組織化學(xué)法檢測(cè)其原位表達(dá)，而且其表達(dá)產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞的存活和生長(zhǎng)基本無(wú)毒性作用。但由于LacZ基因組較大，約3.1 kbp，串聯(lián)它時(shí)很困難，外源基因表達(dá)盒構(gòu)建會(huì)受影響。（2）gpt（黃嘌呤鳥嘌呤磷酸轉(zhuǎn)移酶）也是常用的篩選標(biāo)記之一。由于在鳥嘌呤合成途徑中，催化IMP到XMP反應(yīng)的是IMP脫氫酶，而MPA是該酶的不可逆阻斷劑。鳥嘌呤只能通過(guò)替代途徑在gpt的參與下合成。動(dòng)物細(xì)胞本身不能合成gpt，但重組的病毒可以提供gpt從而使病毒完成核酸代謝，使細(xì)胞分裂得以生長(zhǎng)、增殖[26]。（3）GFP來(lái)源于海洋生物水母，EGFP是一種優(yōu)化的突變型GFP，它所產(chǎn)生的熒光要比野生型GFP強(qiáng)35倍，大大增強(qiáng)了該報(bào)告分子的靈敏度[27]。作為動(dòng)植物以及微生物基因工程研究上的一種選擇性標(biāo)記，它具有檢測(cè)靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、對(duì)機(jī)體毒性小且不需要任何底物或輔助因子等優(yōu)點(diǎn)[28]。（4）胸腺嘧啶脫氫核苷激酶（thymidine kinase，TK），是核苷酸合成補(bǔ)救中的一種酶，能把胸苷轉(zhuǎn)化為胸苷磷酸，保證核苷酸的順利合成。在HAT選擇培養(yǎng)基中，TK基因缺陷受體細(xì)胞不生長(zhǎng)，相反外源基因轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長(zhǎng)。這種篩選系統(tǒng)前提是單一選擇TK基因作為非必需片段構(gòu)建重組病毒，不能被廣泛采用，十分局限。

2 病毒活載體的應(yīng)用

載體是供插入目的基因并將其導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)或復(fù)制的運(yùn)載工具。近幾年，以病毒載體為基礎(chǔ)構(gòu)建的重組活載體疫苗成為疫苗研究領(lǐng)域的主要方向[29]。目前，作為載體的病毒多為哺乳動(dòng)物病毒，如腺病毒（adenovirus）、偽狂犬病毒（Pseudorabies virus）、痘病毒（Pox virus）、桿狀病毒（baculovirus）等，其中桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)也是應(yīng)用同源重組技術(shù)，是近些年研究的熱點(diǎn)。

2.1 腺病毒載體

腺病毒（adenovirus，Adv）屬于腺病毒科，線狀、無(wú)包膜的雙鏈DNA病毒，基因組大小約36 kbp，由240個(gè)六鄰體和12個(gè)五鄰體構(gòu)成二十面體病毒殼體。五鄰體位于二十面體頂角，均有1個(gè)纖維蛋白突起與其相連，纖維蛋白頭部與腺病毒的組織親合性密切相關(guān)。腺病毒感染細(xì)胞分4個(gè)階段：感染、早期事件、晚期事件和包裝。

第1代腺病毒E1/E3基因表達(dá)盒，插入外源基因的長(zhǎng)度可達(dá)8 kbp。去除E1區(qū)阻止了依賴E1區(qū)和E2區(qū)功能蛋白的轉(zhuǎn)錄與隨后病毒DNA的復(fù)制及病毒外殼蛋白的產(chǎn)生，這種方法效率很低[30]。第2代腺病毒建立在第1代基礎(chǔ)上，在E1、E3缺失的基礎(chǔ)上進(jìn)一步去除E4區(qū)，減弱病毒自身蛋白表達(dá)，降低炎癥反應(yīng)。第3代腺病毒載體又稱輔助病毒依賴型腺病毒載體（helper-dependent adenovirus，HD-Ad）[31]，表達(dá)系統(tǒng)分為3部分：（1）空殼載體；（2）腺病毒自身編碼序列；（3）輔助病毒。外源DNA的裝載容量提高，表達(dá)外源基因時(shí)間延長(zhǎng)。

2.2 豬偽狂犬病毒載體

豬偽狂犬病毒（PRV）屬于皰疹病毒科中的豬皰疹病毒型。病毒基因組為線狀雙鏈DNA，長(zhǎng)度為150 kbp，由長(zhǎng)獨(dú)特區(qū)（UL）、短獨(dú)特區(qū)（US）、US兩側(cè)的重復(fù)序列（TRS）、內(nèi)部重復(fù)序列（IRS）組成。豬偽狂犬病（PR）是由豬偽狂犬病毒（PRV）引起的急性傳染病，每年給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，多種家畜和野生動(dòng)物均可被感染[32]。對(duì)豬偽狂犬病的控制主要是使用疫苗。豬偽狂犬病毒以其特殊的基因組結(jié)構(gòu)、宿主的廣泛性和生物安全性成為研制活載體疫苗的重要載體工具。

目前，PRV基因缺失疫苗株常常是通過(guò)缺失gE、gI、gG、gC、TK等非必需基因，缺失分為單基因缺失和多基因缺失。Zhang等構(gòu)建了表達(dá)口蹄疫病毒衣殼前體肽P12A和非結(jié)果蛋白3C的偽狂犬病毒載體疫苗（PRV-P12A3 C），結(jié)果表明部分仔豬的臨床癥狀減輕，囊泡出現(xiàn)延遲[33]。

2.3 痘病毒

2.3.1 雞痘病毒載體 雞痘病毒（Fowlpox virus，F(xiàn)PV）基因組大小為288 kbp，基因組是雙鏈DNA，包括1個(gè)由相同的2個(gè)9.5 kbp大小的末端倒置重復(fù)序列包圍的核心編碼區(qū)，它含有260個(gè)開(kāi)放閱讀框，大小為260～309 kbp，比其他已報(bào)導(dǎo)的脊椎動(dòng)物的基因組都大。過(guò)去對(duì)FPV基因組的研究工作，主要是利用純組織培養(yǎng)的FPV傳代毒株，并且獲得了約1/3的病毒基因組信息，包括免疫逃避假說(shuō)和宿主范圍功能。雞痘病毒（FPV）是近些年來(lái)研究開(kāi)發(fā)并逐漸轉(zhuǎn)向?qū)嶋H應(yīng)用的一種新的病毒載體。為了設(shè)計(jì)更安全、有效、合理的FPV疫苗和以FPV為基礎(chǔ)的表達(dá)載體，要求研究者對(duì)與病毒毒力和宿主范圍有關(guān)的基因有一個(gè)全面的認(rèn)識(shí)，對(duì)這些基因在病毒致病機(jī)理、免疫逃避和宿主范圍方面的作用有深入的了解。

對(duì)于雞痘病毒載體研究的內(nèi)容主要集中在雞痘病毒載體啟動(dòng)子的優(yōu)化，提高外源基因在雞痘病毒載體中的表達(dá)需要強(qiáng)啟動(dòng)子，F(xiàn)PV自身啟動(dòng)子研究還不夠詳細(xì)、表達(dá)量偏低。目前大部分雞痘病毒載體都選用痘苗病毒（Vaccina virus，VV）的早、晚期啟動(dòng)子[34]。

2.3.2 羊痘病毒載體 羊痘病毒是痘病毒科（Poxviridae），脊索動(dòng)物痘病毒亞科（Chordopoxrinae），羊痘病毒屬（Capripox virus）成員。基因組由共價(jià)結(jié)合的雙股DNA組成，基因組呈線性，全長(zhǎng)約150 kbp，DNA無(wú)感染性，編碼至少147種基因。病毒基因組保守區(qū)的非復(fù)制區(qū)域可以整合外源DNA，羊痘病毒是繼痘苗病毒和禽痘病毒（Fowlpox virus，F(xiàn)PV）之后一種重要的動(dòng)物病毒載體，因?yàn)閷?duì)人不具有感染性，對(duì)外源基因的耐受性強(qiáng)，是一種更為理想的活病毒載體。羊痘病毒毒力有關(guān)基因如胸苷激酶基因（TK）、核苷酸還原酶基因（RR）、蛋白激酶基因（RK）和P32基因等。TK基因缺失不影響病毒的增殖，卻能顯著降低病毒毒力，TK基因缺失的羊痘病毒被廣泛地應(yīng)用于疫苗的研究中。

羊痘病毒基因組龐大復(fù)雜，不易在某一個(gè)特定的位置直接插入外源基因，所以要先利用1個(gè)質(zhì)粒載體構(gòu)建1個(gè)轉(zhuǎn)移載體。不僅可以預(yù)防羊痘的發(fā)生，還可以插入其他外源病毒保護(hù)性抗原，重組病毒所表達(dá)的外源基因隨載體病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、蛋白合成加工，誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)相應(yīng)病原的免疫應(yīng)答。Diallo 等構(gòu)建了表達(dá)小反芻獸疫病毒（Peste des petits ruminants virus，PPRV）H基因的重組山羊痘病毒，動(dòng)物試驗(yàn)中需要 10 TCID50 才能保護(hù)小反芻獸疫[35]。張強(qiáng)等構(gòu)建了 Asia1 型口蹄疫病毒P1-2A和3C基因的重組山羊痘病毒弱毒株[36]。

2.3.3 痘苗病毒載體 痘苗病毒基因組的大小約為 187 kbp，可以編碼150～200種多肽，包括早期蛋白和晚期蛋白。以侵入細(xì)胞后病毒DNA開(kāi)始復(fù)制的時(shí)間為界，人為地將病毒復(fù)制分為早期和晚期2個(gè)過(guò)程。其中應(yīng)用得最多的是早、晚期蛋白啟動(dòng)子P7.5。而痘苗病毒基因組允許插入較長(zhǎng)的外源DNA片段（25 kbp）并且不會(huì)造成病毒感染性的喪失[37]。目前有很多痘苗病毒毒株用作載體表達(dá)各種類型的外源基因，較為常用的毒株是痘苗病毒W(wǎng)R株（western reserve strain）。此外，還有很多毒株如痘苗病毒天壇株[38]、Wyeth株、Copenhagen株及NYCBH株等。

2.4 桿狀病毒載體

桿狀病毒（baculovirus）是一類具有囊膜包裹的雙鏈環(huán)狀DNA病毒，自然界中主要感染鱗翅目、膜翅目和雙翅目昆蟲。其基因組大小為80～160 kbp，位于直徑為30～60 nm、長(zhǎng) 300 nm 的桿狀核衣殼中，具有較大的柔韌性，可以容納較大片段的外源基因插入。苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒（Autographa californica multicapsid nucleo polyhedro virus，AcMNPV）是眾多桿狀病毒中研究最多的。它異于其他病毒載體，成為病毒載體研究熱點(diǎn)是因?yàn)闂U狀病毒表達(dá)載體適合翻譯后修飾和重組蛋白的高水平表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)，昆蟲桿狀病毒可以進(jìn)入多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞，并在合適的哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子控制下表達(dá)外源基因，但其基因組在細(xì)胞中不復(fù)制，且對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)明顯影響[39]。Lu等研究發(fā)現(xiàn)含有PRRSV ORF7的C端編碼區(qū)域的特異shRNA的VSV-G假型化桿狀病毒成功地抑制了PRRSV在Marc145細(xì)胞中的復(fù)制[40]。Starkey等構(gòu)建了表達(dá)乙肝病毒（Hepatitis B virus，HBV）特異的shRNA重組桿狀病毒，在體外能成功地阻斷HBV復(fù)制[41]。由于桿狀病毒具有最理想疫苗轉(zhuǎn)移載體的典型特征，所以桿狀病毒作為哺乳動(dòng)物基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體不斷發(fā)展，研究也表明桿狀病毒載體是疫苗發(fā)展過(guò)程中極其有效的工具。

3 重組病毒的優(yōu)、缺點(diǎn)

新型重組病毒不斷涌現(xiàn)，不但保持了原有病毒的優(yōu)點(diǎn)，更對(duì)許多不足之處作出了重大改進(jìn)，從而使這方面的研究有了新突破，重組病毒表達(dá)外源基因的優(yōu)點(diǎn)在于：（1）宿主范圍廣，可用于多種動(dòng)物，也包括人類。（2）有大量的非必需片段可用作插入外源基因的位點(diǎn)，方便串聯(lián)表達(dá)多個(gè)目的片段，構(gòu)建多價(jià)苗。（3）免疫期長(zhǎng)，可對(duì)機(jī)體產(chǎn)生持久的免疫力。（4）安全性好，易于被人們接收，目前常采用基因操作技術(shù)，將病原微生物中與致病性有關(guān)的毒力基因敲除或插入其他外源基因，使之成為無(wú)毒株或弱毒株。（5）重組毒易于大量生產(chǎn)、成本低、保存和使用相對(duì)比較方便。（6）誘導(dǎo)位點(diǎn)專一，免疫方式簡(jiǎn)單、易控制。但是在實(shí)際應(yīng)用中也發(fā)現(xiàn)，重組病毒目前也存在許多不可忽視的缺點(diǎn)：（1）與臨床要求相比，病毒滴度低。（2）重復(fù)給予時(shí)機(jī)體可能產(chǎn)生免疫耐受。（3）在體外獲得同源重組的效率很低，并且有可能造成外源基因的丟失而喪失感染性?？傊?，利用重組病毒可治療一些特殊疾病，同時(shí)探索病毒載體所面臨的安全性和毒性問(wèn)題[42]。但是，需要進(jìn)一步改善和開(kāi)發(fā)能高效轉(zhuǎn)移基因、表達(dá)高度組織特異性、安全可靠的重組病毒。

4 總結(jié)與展望

通過(guò)體外連接構(gòu)建重組病毒的方法，其基本過(guò)程是將含外源基因的轉(zhuǎn)移載體與經(jīng)過(guò)酶切處理的親本毒株基因組DNA臂在體外同源重組，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)染已預(yù)先感染親本病毒的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，這種嵌合的基因組在親本病毒的作用下組裝成為重組病毒粒子。這種技術(shù)可在DNA靶標(biāo)分子的任意位點(diǎn)進(jìn)行基因敲除、敲入、點(diǎn)突變等操作，利用這種方法構(gòu)建重組病毒首先要滿足一個(gè)基本條件，就是從親本病毒基因組復(fù)制非必需區(qū)內(nèi)找到一個(gè)唯一的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)或通過(guò)基因操作技術(shù)在基因內(nèi)引入適當(dāng)?shù)奈稽c(diǎn)，以供外源基因的插入。TK、gE、gI基因決定病毒的毒力，為重要的毒力因子。TK基因的缺失能顯著降低病毒毒力，但不影響病毒的增殖，是外源基因插入的首選位點(diǎn)[43]。但要在重組病毒領(lǐng)域有重大突破，還有大量的工作要做。首先對(duì)親本毒株基因組的認(rèn)識(shí)還有待進(jìn)一步深入，其次了解親本毒株各個(gè)基因的精確功能也很重要，基于感染重組病毒疫苗應(yīng)用到自然宿主以后，有可能發(fā)生毒力返強(qiáng)的現(xiàn)象。另外，重組病毒毒株在自然環(huán)境下能否與流行毒株發(fā)生基因組交換或重組，也是需要考慮的。

重組病毒可用于基因治療、活載體疫苗、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、基因功能研究等領(lǐng)域，以病毒為載體構(gòu)建重組病毒有助于蛋白的體外表達(dá)及功能研究，同時(shí)對(duì)研究病毒的致病機(jī)理和研制活載體疫苗都有積極作用[44]。近些年，科研人員對(duì)重組病毒進(jìn)行了大量的研究，重組病毒技術(shù)得以不斷成熟和完善，進(jìn)一步提高了重組病毒的安全性，優(yōu)化了不同表達(dá)盒及病毒載體。另外，多價(jià)載體疫苗將是未來(lái)疫苗開(kāi)發(fā)研究的主要方向之一，構(gòu)建一個(gè)成功而實(shí)用的重組病毒疫苗，并進(jìn)行動(dòng)物免疫試驗(yàn)，實(shí)現(xiàn)一針多效，達(dá)到免疫接種的目的，為下一步商業(yè)化疫苗奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)?？傊?，隨著病毒分子生物學(xué)研究不斷深入和研究方法不斷更新，重組病毒將取得更大的突破，有望獲得更廣泛的應(yīng)用前景。

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