郭曉波,姚 靜,楊 樂△,藺 京,

1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部附屬西安市中心醫(yī)院(西安710003)，2.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院(西安710004)

慢性粒細胞白血病BCR-ABL融合基因檢測及其臨床意義*

郭曉波1,姚 靜2,楊 樂1△,藺 京1,

1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部附屬西安市中心醫(yī)院(西安710003)，2.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院(西安710004)

目的：探討B(tài)CR-ABL融合基因與慢性粒細胞白血病(CML)的相關(guān)性。方法：利用實時熒光定量PCR檢測168例CML患者體內(nèi)BCR-ABL含量，并與113例非CML患者作為對照組進行比對，分析BCR-ABL基因與CML的相關(guān)性。結(jié)果：168例CML患者BCR-ABL檢測陽性156例(92.9%)，陰性12例(7.1%)。對照組113例非MCL者BCR-ABL陽性3例(2.7%)，BCR-ABL陰性110例(97.3%)。CML患者BCR-ABL陽性率明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。其中，BCR-ABL陽性組男性高于女性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；陽性組的平均年齡和白細胞平均數(shù)均高于陰性組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：BCR-ABL是診斷CML重要輔助檢查，與CML之間存在相關(guān)性。

慢性粒細胞白血病(Chronic myelogenous leukemia,CML)是一種造血干細胞惡性疾病，患者外周血白細胞數(shù)多明顯增加，重度貧血或血小板數(shù)持續(xù)增高或持續(xù)下降。其分子生物學(xué)特征是通過FISH、RT-PCR術(shù)或Southern blot方法可以檢測出BCR-ABL融合基因突變，該基因編碼的融合蛋白具有很強的酪氨酸激酶活性，從而引發(fā)大量異常細胞的惡性增殖[1-2]。BCR-ABL融合基因存在于95%以上的慢性粒細胞白血病[3]。BCR-ABL融合基因的表達水平反應(yīng)了患者體內(nèi)白血病細胞的負荷量，精確檢測BCR-ABL融合基因表達水平，對白血病的臨床分型診斷、個體化治療方案的制定、治療效果檢測、緩解后復(fù)發(fā)風險的估計和預(yù)防、干細胞移植后殘留細胞的檢測和早期干預(yù)治療等方面具有重要作用。本文對CML患者進行BCR-ABL融合基因檢測，分析其與CML的相關(guān)性，為以后對CML患者研究提供分子學(xué)依據(jù)。

資料和方法

1 一般資料 所有CML病例均為我院2012年8月至2014年6月住院病人，均經(jīng)骨髓涂片和活檢診斷證實，其中男85例,女83例，年齡14～70歲，中位年齡55歲。對照組113例,男60例，女53例,均為非MCL患者，年齡20～65歲,中位年齡39歲。所有臨床資料及標本均在取得患者知情同意后采集。

2 儀器與試劑 熒光定量PCR儀采用美國伯樂CFX96，RNAprep pure血液總RNA提取試劑盒天根生化科技有限公司，融合基因試劑盒(BCR-ABL)購自上海之江生物科技股份有限公司。

3 檢測方法 抽取患者骨髓或者靜脈血5.0ml加入裝有EDTAK2作為抗凝劑的試管中，混勻，將標本通過使用紅細胞裂解液除去血液(骨髓)中的紅細胞，獲得白細胞；用RNAprep pure血液總RNA提取試劑盒從上步獲得的白細胞沉淀中提取RNA。將核酸熒光PCR混合液分別與等人份的RT-PCR酶混合，震蕩混勻數(shù)秒，3000r/min離心5s。將上述配制好的體系置于PCR管中，然后將提取好的RNA、DEPC-H2O、對照品、標準品分別加入對應(yīng)管內(nèi)。反應(yīng)管置于熒光PCR儀上，設(shè)置循環(huán)參數(shù)：45℃×20 min→95℃×5 min，再按95 ℃×15s→58 ℃×30 s→72 ℃×45 s,循環(huán)45次；單點熒光檢測在58℃。利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標準曲線的分析對起始模板進行定量分析。整個實驗操作均嚴格按照操作規(guī)范進行，同時做內(nèi)參，陽性和陰性對照，均在控。

4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件，計數(shù)資料以百分率表示，采用t檢驗和χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 部分標本實時熒光定量PCR擴增曲線和標準曲線 見圖1。

2 CML患者BCR-ABL突變情況 168例CML患者BCR-ABL陽性156例(92.9%)，BCR-ABL陰性12例(7.1%)。對照組113例非MCL者BCR-ABL陽性3例(2.7%)，BCR-ABL陰性110例(97.3%)。CML患者BCR-ABL陽性率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

Amplification為擴增曲線，Cycles為循環(huán)數(shù)，Log Scale為對數(shù)范圍

表1 CML患者Real-time RT-PCR技術(shù)檢測BCR-ABL突變率

注：與對照組突變率比較，*P<0.01

3 BCR-ABL陽性和陰性組在臨床參數(shù)上的差異 BCR-ABL陽性組男性高于女性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；陽性組的平均年齡和白細胞平均數(shù)均高于陰性組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。CML患者臨床參數(shù)分析：CML患者臨床參數(shù)包括確診時血常規(guī)檢查、年齡、性別，見表2。

表2 BCR-ABL陽性與陰性CML患者臨床特點及血液學(xué)參數(shù)比較

注：與BCR-ABL陰性比較，*P<0.05，△P<0.01

討 論

我國1986-1988年對22個省、市、自治區(qū)的流行病學(xué)調(diào)查表明，CML年發(fā)病率為0.36/10萬，占白血病的第3位。各年齡段均可發(fā)病，發(fā)病率隨年齡增長而明顯增加，發(fā)病年齡五、六十歲。近年隨著診斷技術(shù)的提高，診斷年齡有年輕化趨勢，男性發(fā)病略高于女性。BCR-ABL融合基因存在于95%以上的慢性粒細胞白血病患者，是CML最重要特征性標志，是疾病狀態(tài)的決定性因素，對CML的診斷具有重要意義。因此，對CML與BCR-ABL融合基因之間相關(guān)性的研究也越來越重要[4]。

BCR基因由于易位與ABL基因形成BCR-ABL融合基因，該基因的表達激活了酪氨酸蛋白激酶，擾亂了正常的信號傳導(dǎo)途徑，抑制了凋亡的發(fā)生。BCR基因由于斷裂點不同分為:主要(major bcr，M-bcr)、次要(minor bcr，m-bcr)和μ(μ-bcr)[5-6]。M-bcr和m-bcr，倆者可以單獨存在或同時存在，見于絕大多數(shù)的CML；少數(shù)患者表達m-bcr，多見于ALL；更為少見的CML患者表達μ-bcr。因此，對于CML患者需要進行BCR-ABL融合基因的全面篩查，以免漏診。

基因檢測對臨床的診斷及治療發(fā)揮著越來越重要的作用，應(yīng)用實時熒光定量PCR技術(shù)，檢測BCR-ABL融合基因的表達情況，敏感性好，穩(wěn)定性高，可操作性強，對臨床檢驗具有普遍意義，值得推廣。馮術(shù)青等[7]研究證明實時熒光定量PCR是評估CML患者治療后復(fù)發(fā)情況的良好方法，通過BCR-ABL水平的動態(tài)監(jiān)測，可篩選出高復(fù)發(fā)風險的患者，配合早期干預(yù)性治療措施可以提高患者無病生存率。本研究結(jié)果表明CML患者BCR-ABL陽性率為92.9%，明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，從而提示對CML患者進行BCR-ABL檢測有重要的臨床價值，可為患者的診斷判斷提供一定幫助。本研究結(jié)果略低于其他研究者結(jié)果，可能與標本數(shù)量少，目前RNA的提取、標準品、引物等沒有統(tǒng)一的標準有關(guān)，所以才導(dǎo)致各實驗室之間的結(jié)果會有一定的差異。其中，BCR-ABL陽性組男性高于女性，陽性組的平均年齡和白細胞平均數(shù)均高于陰性組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，可為以后CML的深入研究進一步提供幫助。對于存在BCR-ABL陽性的患者給予早期的干預(yù)治療，對疾病獲得良好的結(jié)果有重要意義。

BCR-ABL融合基因可結(jié)合臨床表現(xiàn)、外周血、骨髓形態(tài)、骨髓病理、染色體等檢查，將CML分為慢性期(CP)、加速期(AP)、急變期(BP)。同時，在監(jiān)測分子靶向治療療效和異基因造血干細胞移植療效方面也有重要的作用。許蘭平等[8]分析64例造血干細胞移植的CML患者，根據(jù)BCR-ABL監(jiān)測結(jié)果，在移植后期進行了干預(yù)治療，結(jié)果顯示伊馬替尼組、免疫調(diào)節(jié)治療組、聯(lián)合治療組患者BCR-ABL融合基因轉(zhuǎn)陰率分別為86.0%、90.0%、83.9%。

[1] 黃 丹,高貝貝,李 莉,等.慢性粒細胞白血病BCR-ABL融合基因?qū)崟r定量檢測平臺的建立[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2014,36(1):13-17.

[2] Gallipoli P, Abraham SA, Holyke TL. Hurdles toward a cure for CML: the CML stem cell [J]. Hematol Oncol Clin North A , 2011, 259(5): 951-966.

[3] 張 艾，胡 群，張柳清，等.bcr-abl融合基因陽性兒童急性淋巴細胞白血病臨床分析[J].白血病·淋巴瘤，2014,23(3):160-162.

[4] Wang QF. MLL fusion proteins preferentially regulate a subset of wild-type MLL target fenes in the leukemic genome [J]. Blood, 2011, 117(25): 6895-6905.

[5] 蔡文治，何雪峰，陳蘇寧，等.Ph/BCR-ABL陽性急性髓系白血病12例臨床及實驗室特征分析[J].中華血液學(xué)雜志，2015,36(5):398-402.

[6] 桂曉敏，潘金蘭，仇惠英，等.伴不典型BCR-ABL融合基因的慢性髓性白血病的臨床和實驗研究[J].中華血液學(xué)雜志，2014,35(3):210-214.

[7] 馮術(shù)青，宋旭東，高 峰，等.實時定量PCR技術(shù)監(jiān)測BCR-ABL水平在異基因造血干細胞移植治療慢性粒細胞白血病中的應(yīng)用[J].中華移植雜志，2014,8(4)：196-200.

[8] 許蘭平，劉代紅，劉開彥，等.慢性粒細胞白血病患者異基因造血干細胞移植后不同干預(yù)方案療效的比較研究[J].中華血液學(xué)雜志，2010,31(11)：758-762.

(收稿：2015-12-15)

*陜西省自然科學(xué)研究計劃項目(2014JM2-8182)

白血病，粒細胞，慢性/免疫學(xué) @BCR-ABL基因 基因融合 聚合酶鏈式反應(yīng)

R733

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.03.039

△通訊作者