薛運(yùn)昕,寧 欣,倪 楠, 郭天聰,蔡昕姝

遼寧省金秋醫(yī)院呼吸科(沈陽(yáng)110016)

紅景天苷對(duì)野百合堿誘導(dǎo)肺動(dòng)脈高壓大鼠Nrf-2及NF-κB信號(hào)通路的影響*

薛運(yùn)昕,寧 欣,倪 楠, 郭天聰,蔡昕姝

遼寧省金秋醫(yī)院呼吸科(沈陽(yáng)110016)

目的：探討紅景天苷對(duì)肺動(dòng)脈高壓大鼠的肺組織病理與Nrf-2及NF-κB信號(hào)通路的影響。方法：將6～8周齡雄性SD大鼠隨機(jī)分為五組，每組6只。正常對(duì)照組注射對(duì)照溶劑，模型對(duì)照組及藥物干預(yù)組(低、中、高)皮下注射60 mg/kg野百合堿后，于2～28 d后分別給予低、中、高濃度組注射50、100、200 mg/(kg·d)紅景天苷，其余組別分別注射生理鹽水；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，分別檢測(cè)各組大鼠右心室收縮壓(RVSP)及右心室肥厚指數(shù)；組織病理學(xué)檢測(cè)大鼠肺組織細(xì)小動(dòng)脈病理變化，RT-PCR檢測(cè)肺組織HO-1 、TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)水平，Western blot檢測(cè)肺組織核蛋白Nrf-2、NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組RVSP及右心室肥厚指數(shù)顯著上升，肺組織表現(xiàn)明顯炎癥浸潤(rùn)，肺組織核蛋白Nrf-2及NF-κB均出現(xiàn)上調(diào)，HO-1 及TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)上調(diào)(P<0.05)；經(jīng)過(guò)不同濃度紅景天苷干預(yù)后，各組大鼠RVSP及右心室肥厚指數(shù)出現(xiàn)變化，高濃度組顯著下調(diào)(P<0.05)；Nrf-2核蛋白水平及HO-1 mRNA表達(dá)進(jìn)一步上升，NF-κB p65水平及TNF- α、IL-6 mRNA表達(dá)逐漸下調(diào)，呈濃度依賴(lài)(P<0.05)。結(jié)論：紅景天苷能夠減緩野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺動(dòng)脈高壓，可能與Nrf-2活化以及抑制NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。

肺動(dòng)脈高壓(Pulmonary artery hypertension，PAH)是一類(lèi)由于肺動(dòng)脈血壓升高、右心室衰竭為特征的病理生理過(guò)程，主要表現(xiàn)為肺動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞受損、平滑肌細(xì)胞異常增殖以及肺血管重構(gòu)，確切發(fā)病機(jī)制目前尚未完全闡明[1]。近年來(lái)研究表明，氧化應(yīng)激可能參與了PAH過(guò)程中的肺血管重構(gòu)[2]。核因子E2相關(guān)因子2(Nuclear factor E2-related factor 2，Nrf-2)是一種氧化應(yīng)激重要的轉(zhuǎn)錄激活因子，參與體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)[3]；核因子-kappa B(Nuclear factor -kappa B，NF-κB)也參與了氧化應(yīng)激以及炎癥反應(yīng)的調(diào)控過(guò)程，并可能與Nrf-2信號(hào)通路存在相互拮抗作用[4]。紅景天苷是草本植物中藥紅景天的主要成分之一，部分研究表明紅景天具有抗氧化應(yīng)激、抗衰老、抗輻射、抗缺氧、抗腫瘤、抗病毒、保護(hù)心腦血管等疾病的作用。紅景天苷能夠抑制百草枯誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的紅細(xì)胞毒性，恢復(fù)了乳酸脫氫酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX-PX)的表達(dá)和活力，提示紅景天苷可能是通過(guò)氧化應(yīng)激酶發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[5]。但關(guān)于紅景天對(duì)于PAH的干預(yù)效果還少見(jiàn)報(bào)道。為此我們通過(guò)建立野百合堿誘導(dǎo)的PAH大鼠模型，觀察紅景天苷對(duì)大鼠肺組織病理以及Nrf-2/NF-κB信號(hào)通路的影響。

材料及方法

1 主要材料及試劑 6～8周齡雄性SD大鼠；野百合堿、紅景天苷均購(gòu)自大連美侖；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、高純總RNA快速提取試劑盒購(gòu)自Bioteke(北京)；抗Nrf2、NFκ-B p65兔多克隆抗體購(gòu)自萬(wàn)類(lèi)生物(沈陽(yáng))；抗LaminA小鼠多克隆抗體購(gòu)自Abcam(英國(guó))；羊抗兔及羊抗小鼠辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記二抗購(gòu)自碧云天(海門(mén))；細(xì)胞核蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)自萬(wàn)類(lèi)生物(沈陽(yáng))；生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟)。

2 動(dòng)物建模及分組 將SD大鼠隨機(jī)分為如下五組：正常對(duì)照組，模型對(duì)照組，低濃度組、中濃度組、高濃度組，每組6只；其中，正常對(duì)照注射等量溶劑(無(wú)水乙醇與生理鹽水以2∶8稀釋)，模型及藥物處理組大鼠皮下注射60 mg/kg 野百合堿(溶于生理鹽水稀釋的無(wú)水乙醇中)。低濃度組、中濃度組、高濃度組在注射野百合堿第2～28天繼續(xù)腹腔注射低(50 mg/kg)、中(100 mg/kg)、高(200 mg/kg)濃度紅景天苷干預(yù)，其他組注射等體積生理鹽水。第28天，檢測(cè)大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，處死所有大鼠并取材，部分固定于4%多聚甲醛溶液中，部分液氮速凍轉(zhuǎn)至-70℃冰箱中保存。

3 血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組大鼠經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛(3.5 ml/kg)麻醉后，分別仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，將頸部去毛并消毒，利用手術(shù)剪剪開(kāi)皮膚，使右側(cè)頸外靜脈分離，經(jīng)頸外靜脈插管至右心室，接通壓力換能器并連接生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，記錄大鼠右心室收縮壓(RVSP)。

4 組織病理學(xué)觀察 大鼠測(cè)壓后將其處死，開(kāi)胸取出心臟，切除左右心房及大血管，進(jìn)一步分離右心室游離壁組織(RV)以及左心室和室間隔組織(LV+S)，仔細(xì)沖洗去除殘留血栓，并用濾紙吸凈表面水分，稱(chēng)重并計(jì)算右心室肥厚指數(shù)[RV/(LV+S)]；分離氣管并結(jié)扎左肺葉，多聚甲醛灌注右肺進(jìn)行固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色，觀察肺組織細(xì)小動(dòng)脈病理改變情況。

5 RT-PCR檢測(cè)肺組織HO-1、TNF-α及IL-6 mRNA表達(dá) 收集各組大鼠肺組織樣本，參照總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取大鼠肺組織RNA樣本，并利用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)合成cDNA第一鏈模板，加入相應(yīng)檢測(cè)引物進(jìn)行PCR檢測(cè)肺組織HO-1 、TNF-α、IL-6基因mRNA表達(dá)水平，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)提供的目標(biāo)基因序列信息，HO-1上游引物序列：5’- CTGGAATGGAAGGAGATGCC -3’，下游引物序列：5’- TCAGAACAGC CGCCTCTACCG -3’，片段長(zhǎng)度132 bp； TNF α上游引物序列：5’- GCCACCACGCTCTTCTGTC -3’；下游引物序列： 5’- GCTACGGGCTTGT CACTCG -3’， 片段長(zhǎng)度149 bp； IL6上游引物序列：5’- AGTTGTGCAATGGC AATTCTG -3’，下游引物序列： 5’- ATGACTCTGGCTT TGTCTTTC -3’， 片段長(zhǎng)度223bp；內(nèi)參為β-actin上游引物序列： 5’- GGAGATTACTGCCCTGGCC CTAGC -3’；下游引物序列： 5’-GGCCGGACTCATCGT ACTCCTGCTT -3’， 片段長(zhǎng)度155 bp；PCR反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性40 s；56℃退火40 s；72℃延伸30 s；30次擴(kuò)增循環(huán)，72 ℃終末延伸3 min。吸取5 μl PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，分析掃描光密度數(shù)值，以β-actin為內(nèi)參照，計(jì)算HO-1 、TNF- α、IL-6 基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

6 Western blot檢測(cè)肺組織核蛋白中Nrf-2、NF-κB p65的表達(dá)水平 對(duì)各組大鼠肺組織樣本利用細(xì)胞核蛋白提取試劑盒勻漿裂解，提取核蛋白，BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒進(jìn)行蛋白定量，并調(diào)整蛋白濃度，每組樣本以20 μl進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)法低溫轉(zhuǎn)印，一抗(Nrf2、NF-κB P65均1∶500稀釋)4℃孵育過(guò)夜，TBST充分洗滌，加入HRP標(biāo)記羊抗兔二抗(1∶5000稀釋)于37 ℃孵育45 min，經(jīng)TBST充分洗滌，灑入ECL發(fā)光液適量，反應(yīng)約5 min，放于暗室中對(duì)膠片進(jìn)行曝光、顯影、定影，掃描膠片采集灰度值，以β-actin做為內(nèi)參進(jìn)行校正，以正常對(duì)照組條帶灰度值為1，其他組別條帶灰度值與之進(jìn)行比較，所得數(shù)值即為目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)量。

結(jié) 果

1 右心室收縮壓(RVSP)及右心室肥厚指數(shù)變化 與正常對(duì)照組比較，造模28 d后，模型對(duì)照組RVSP明顯升高，提示造模成功；不同濃度梯度紅景天苷干預(yù)后，中、低濃度組大鼠RVSP變化并不明顯，但高濃度組降低程度顯著，與模型組比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；正常對(duì)照組及模型對(duì)照組大鼠RV/(LV+S)分別為(0.23±0.07)及(0.44±0.10)，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，不同濃度梯度紅景天苷干預(yù)后，中、低濃度組大鼠RV/(LV+S)變化并不明顯，但高濃度組降低程度顯著，與模型組比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2 大鼠肺組織病理學(xué)變化 正常對(duì)照組大鼠細(xì)小肺動(dòng)脈內(nèi)膜結(jié)構(gòu)平滑完整， 平滑肌層無(wú)增厚現(xiàn)象，細(xì)胞與胞核排列規(guī)則，無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；而模型對(duì)照組大鼠肺組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，血管周?chē)嬖诖罅苛馨图?xì)胞與中性粒細(xì)胞，平滑肌全層增厚，細(xì)胞排列紊亂；不同濃度梯度紅景天苷干預(yù)后，各組大鼠肺組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度逐漸減弱，肺細(xì)小血管重塑情況得到改善，高濃度組變化最為明顯(圖1)。

表1 各組大鼠血流動(dòng)力學(xué)及病理學(xué)指標(biāo)比較

注：與正常對(duì)照組比較,*P<0.05；與模型對(duì)照組比較,?P<0.05

A：正常對(duì)照組；B：模型對(duì)照組；C：低濃度組；D：中濃度組；E：高濃度組

3 RT-PCR檢測(cè)肺組織HO-1 、TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá) 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠肺組織HO-1 、TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05)；不同濃度梯度紅景天苷干預(yù)后，各組大鼠肺組織HO-1 、TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)水平逐漸降低，與模型對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2)。

A：RT-PCR檢測(cè)肺組織HO-1 、TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)；B：肺組織HO-1 、TNF-α、IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)量；a：與正常對(duì)照組比較， P<0.05；b:與模型對(duì)照組比較， P<0.05

4 Western blot檢測(cè)肺組織Nrf-2、NF-κB p65在核蛋白中的表達(dá)水平 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠肺組織核蛋白中Nrf-2表達(dá)水平有所上升，而NF-κB p65表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)；不同濃度梯度紅景天苷干預(yù)后，各組大鼠肺組織核蛋白中Nrf-2表達(dá)水平進(jìn)一步上升，而NF-κB p65水平逐漸下降，呈濃度梯度依賴(lài)，與模型對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3)。

A：Western blot檢測(cè)肺組織核蛋白中Nrf-2、NF-κB p65蛋白表達(dá)情況；B：肺組織核蛋白中Nrf-2、NF-κB p65相對(duì)表達(dá)量；a:與正常對(duì)照組比較， P<0.05；b:與模型對(duì)照組比較， P<0.05

討 論

PAH是一種血管重構(gòu)性疾病，近年來(lái)發(fā)病趨于老齡化，病死率居高不下[6]。平滑肌細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞增殖分化是PAH發(fā)生的主要病理基礎(chǔ)，氧化應(yīng)激在肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷及平滑肌細(xì)胞增殖活化過(guò)程的作用逐漸引起重視[7]。紅景天苷是藏藥紅景天的主要有效成分，具有保護(hù)心腦血管系統(tǒng)，抗疲勞、抗腫瘤等多重藥理作用，具有較為廣泛的應(yīng)用前景[8]。

大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，引起血管重塑的主要因素包括炎癥、剪切應(yīng)力以及低氧，上述因素均能夠?qū)е禄钚匝?ROS)增加，NF-κB作為重要的炎癥介質(zhì)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，而Nrf-2是細(xì)胞防御多種氧化應(yīng)激損傷的核心轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，具有抗炎癥、抗氧化損傷等作用，能夠拮抗NF-κB活性[9]。

缺氧性肺動(dòng)脈高壓是眾多心肺疾病發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)，已有研究表明，與正常人比較，嚴(yán)重肺動(dòng)脈高壓患者肺組織中血紅素氧合酶-1(HO-1)表達(dá)明顯降低，上調(diào)HO-1有助于減緩肺動(dòng)脈高壓的進(jìn)展[10]。Ping Z等指出紅景天苷能夠通過(guò)增強(qiáng)Nrf-1/Nrf-2信號(hào)及線(xiàn)粒體呼吸功能改善過(guò)度運(yùn)動(dòng)引起的心肌細(xì)胞損傷[11]。本實(shí)驗(yàn)中，與正常對(duì)照大鼠相比，在模型對(duì)照組大鼠中，RVSP及右心室肥厚指數(shù)顯著增加，提示造模成功；肺組織核蛋白NF-κB p65的水平顯著上升，同時(shí)其下游靶基因TNF- α、IL-6 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，提示大鼠肺組織中炎癥反應(yīng)激活，組織病理學(xué)染色結(jié)果顯示模型對(duì)照組肺組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，平滑肌層增厚，細(xì)胞及胞核排列紊亂，也印證了這一點(diǎn)； 與此同時(shí)，Nrf-2在核蛋白中的水平出現(xiàn)上調(diào)，推測(cè)大鼠肺組織的氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)引起了機(jī)體的保護(hù)性應(yīng)激反應(yīng)，刺激了Nrf-2的活化，引起其下游靶基因HO-1 mRNA表達(dá)上升；給予紅景天苷干預(yù)后，各組大鼠Nrf-2及HO-1水平繼續(xù)上調(diào)， NF-κB在核蛋白水平降低，活化受到抑制，從而抑制炎癥因子TNF-α、IL-6的轉(zhuǎn)錄，并呈濃度梯度依賴(lài)。提示紅景天苷干預(yù)下，Nrf-2活性進(jìn)一步激活，調(diào)控HO-1表達(dá)升高，啟動(dòng)機(jī)體抗炎抗氧化反應(yīng)，并拮抗NF-κB信號(hào)通路，抑制其下游靶基因TNF-α、IL-6等表達(dá)，調(diào)控炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激。

本研究結(jié)果證明，紅景天苷具有抗炎及抗氧化功能，對(duì)野百合堿誘導(dǎo)的PAH大鼠模型具有一定的抑制或緩解作用，能夠促進(jìn)PAH模型中Nrf-2的活化，進(jìn)而激活其信號(hào)通路，抑制NF-κB的活性及其下游炎癥因子的表達(dá)，在一定程度上能夠改善PAH大鼠肺組織臨床病理形態(tài)變化。

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(收稿：2016-08-18)

Effect of Salidroside on the Nrf-2 and NF-κB signal pathway in monocrotaline -induced pulmonary hypertension in rats

Xue Yunxin,Nin Xin,Ni Nan,et al. Jin Qiu Hospital of Liaoning Province(Shenyang110016)

Objective: To investigate the effect of salidroside on Nrf-2/NFκB signaling pathway on lung tissue pathology in rats with pulmonary hypertension.Methods: 6-8 week male SD rats were randomly divided into 5 groups, with 6 rats in each group. Normal control group was injected with control solvent, model control group and drug intervention group (low, middle, high) subcutaneous injection of 60 mg/kg monocrotaline. The low, medium and high concentration groups were given 50, 100 and 200 mg/(kg·d) of salidroside in 2-28 day. The other groups were injected with normal saline. At the end of the experiment, the right ventricular systolic pressure (RVSP) and the right ventricular hypertrophy index were detected in each group. Histopathological examination of the pathological changes of pulmonary tissue in rats. The mRNA expression level of HO-1,TNF-α,and IL-6 in lung tissue was detected by RT-PCR. The protein expression level of Nrf-2 and NF-κB p65 in lung tissue nuclear protein was detected by Western blot. Results: Compared with the normal control group, the RVSP and the right ventricular hypertrophy index of the model group increased significantly, and the lung tissue showed significant inflammatory infiltration. The expression of Nrf-2 and NF-κB in lung tissue nuclear protein was up-regulated, and the expression of HO-1, TNF, and IL6 mRNA was up-regulated (P< 0.05). After treatment with different concentrations of salidroside, RVSP and right ventricular hypertrophy index began to change, and which in the high concentration group was significantly decreased (P< 0.05). The level of Nrf-2 protein and the expression of HO-1 mRNA were further increased, the levels of NF-κB p65 and the expression of TNF-α and IL-6 mRNA were decreased gradually, and showed a concentration dependence (P< 0.05).Conclusion: Salidroside may alleviate the pulmonary hypertension induced by monocrotaline, which may be related to the activation of Nrf-2 and the inhibition of NF-κB signaling pathway.

Pulmonary hypertension/physiopatology Rhodioloside/pharmcology Activating transcription factors Nuclear factor -kappa B Monocrotaline Rats

*遼寧省直醫(yī)院改革重點(diǎn)臨床科室診斷能力建設(shè)項(xiàng)目青年項(xiàng)目(LNCCC-D37-2015)

肺動(dòng)脈高壓/病理生理學(xué) 紅景天苷/藥理學(xué) 轉(zhuǎn)錄激活因子 核因子-kappa B 野百合堿 大鼠

R392.5

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.03.004