陳 軍，金雪榮，王 翔，楊 靜，曹 卓，蘇海川?

1．第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院骨科(西安710038),2．第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院腫瘤科(西安 710038)

shRNA干擾COPS3基因?qū)θ顺晒侨饬黾?xì)胞的影響*

陳 軍1，金雪榮2，王 翔2，楊 靜2，曹 卓2，蘇海川2?

1．第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院骨科(西安710038),2．第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院腫瘤科(西安 710038)

目的：探究shRNA干擾COPS3基因?qū)θ顺晒侨饬黾?xì)胞基因水平、蛋白水平、增殖能力等方面的影響。方法：選擇人成骨肉瘤Saos-2細(xì)胞，感染pLKO.1-COPS3 shRNA病毒質(zhì)粒作為Saos-2 siCOPS3細(xì)胞(實(shí)驗(yàn)組)，感染pLKO.1-TRC control病毒質(zhì)粒作為Saos-2 CON細(xì)胞(對(duì)照組)，感染成功后進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，收集細(xì)胞用RT-PCR測(cè)定COPS3基因mRNA表達(dá)量，Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平，MMT測(cè)定細(xì)胞增殖能力，對(duì)裸鼠接種細(xì)胞懸液進(jìn)行裸鼠成瘤試驗(yàn)。結(jié)果：Saos-2 siCOPS3細(xì)胞中，COPS3基因mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組相比下降(P<0.05)，蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞增殖能力與對(duì)照組相比下降(P<0.05)，干擾COPS3基因與對(duì)照組相比抑制腫瘤體積、重量增加(P<0.05)。結(jié)論：COPS3調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞的增殖與骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

骨肉瘤(Osteosarcoma) 是一種起源于間葉組織的惡性腫瘤，以能產(chǎn)生骨樣組織的梭形基質(zhì)細(xì)胞為特征，又稱成骨肉瘤，占原發(fā)惡性骨腫瘤的20% ，是青少年最常見(jiàn)的原發(fā)惡性骨腫瘤，70%～80% 的患者發(fā)病年齡在1～25 歲，年發(fā)病率約為( 1～3) /100 萬(wàn)人[1]，并且骨肉瘤的轉(zhuǎn)移率較高，其惡性生物學(xué)行為使患者病死率居高不下[2]。近期研究發(fā)現(xiàn)一個(gè)與腫瘤發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移有關(guān)的基因，名為構(gòu)成型光形態(tài)建成同源亞基3(COPS3)，是構(gòu)成型光形態(tài)建成9(COP9)的第3亞單位，位于人類與惡性腫瘤發(fā)生有關(guān)聯(lián)的常見(jiàn)擴(kuò)增區(qū)域17P11.2上[3]。COPS3基因已被發(fā)現(xiàn)與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)聯(lián)。本研究旨在探究慢病毒感染后COPS3基因在及人成骨肉瘤細(xì)胞(Saos-2)中的表達(dá)情況，探討細(xì)胞水平抑制COPS3表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞作用，最后在體內(nèi)驗(yàn)證其抑制腫瘤發(fā)生的效果，以期了解COPS3基因與骨肉瘤發(fā)生的相互關(guān)系。

材料與方法

1 試劑及儀器 人成骨肉瘤Saos-2細(xì)胞來(lái)自上海細(xì)胞庫(kù)，DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Lipotinfectim 3000、Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，Polybrene購(gòu)自上海昕毓科技有限公司， M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶、M1705、dNTPs、Rnase Inhibitor購(gòu)自美國(guó)Promega公司，Oligod T購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司，SYBR Master Mixture 、購(gòu)自美國(guó)TAKARA公司，RIPA裂解液、DMSO購(gòu)自德國(guó)Millipore公司，胰蛋白酶抑制、劑嘌呤霉素購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，小鼠抗人COPS3抗體購(gòu)自Abnova公司，羊抗小鼠二抗、MTT購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

2 慢病毒包裝、感染及細(xì)胞培養(yǎng) 構(gòu)建針對(duì)COPS3的3個(gè)不同靶點(diǎn)RNAi及其對(duì)照重組質(zhì)粒，經(jīng) Wetern blot鑒定的正向序列為5’-CCG GAA CAG TGT CCG ACA GCT CTC ACT CGA GTG AGA GCT GTC GGA CAC TGT TTT TTT G -3’，反向序列為5’-AAT TCA AAA AAA CAG TGT CCG ACA GCT CTC ACT CGA GTG AGA GCT GTC GGA CAC TGT T-3’的質(zhì)?？捎行Ы档虲OPS3的表達(dá)。采用三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)進(jìn)行慢病毒包裝，常規(guī)培養(yǎng)293T細(xì)胞，細(xì)胞融合率達(dá)90%時(shí)，用脂質(zhì)體Lipotinfectim3000將病毒質(zhì)粒pLKO.1-COPS3 shRNA或?qū)φ誴LKO.1-TRC control和輔助質(zhì)粒psPAX2、pMD2.G轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞，培養(yǎng)48h后收集病毒液。培養(yǎng)Saos-2細(xì)胞(15%胎牛血清DMEM)，感染前1d以0.3×106/孔接種于6孔板，細(xì)胞融合率達(dá)20%～30%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞感染(病毒液∶培養(yǎng)液=1∶5)。感染pLKO.1-COPS3 shRNA病毒質(zhì)粒的細(xì)胞作為Saos-2 siCOPS3細(xì)胞(實(shí)驗(yàn)組)，感染pLKO.1-TRC control病毒質(zhì)粒的細(xì)胞作為Saos-2 CON細(xì)胞(對(duì)照組)，兩組細(xì)胞加入終濃度為10 μg/ml的Polybrene培養(yǎng)8 h，更換培養(yǎng)液培養(yǎng)72 h，觀察細(xì)胞熒光率，用4μg/ml嘌呤霉素篩選2周。

3 Western blot檢測(cè)Saos2細(xì)胞中COPS3蛋白表達(dá)情況 收集并裂解Saos-2 CON及Saos-2 siCOPS3細(xì)胞。樣品以12% SDS-PAGE進(jìn)行電泳(Bio-rad，美國(guó))，200mA恒流轉(zhuǎn)膜1 h，5%脫脂奶粉封閉1h，用封閉液按1∶1000比例稀釋小鼠抗人COPS3抗體，4℃孵育過(guò)夜，TBST以1∶5000稀釋羊抗鼠HRP標(biāo)記二抗，室溫孵育1h，之后進(jìn)行ECL化學(xué)發(fā)光。

4 Real-time PCR檢測(cè)COPS3基因mRNA表達(dá)情況 合成COPS3及內(nèi)參GAPDH引物(上海吉?jiǎng)P基因公司)，COPS3上游引物5’-CGCTATTCTCACAGGTTCAG-3’下游引物5’-GCATCATAGGCTCCATTCTC-3’， 307bp；內(nèi)參基因GAPDH引物上游引物5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’，下游引物5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’， 121bp。收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，Triozl法提取細(xì)胞總RNA，根據(jù)Promega公司M-MLV操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，加入2.0μg Total RNA到反應(yīng)體系中，反應(yīng)條件37℃ 5min，42℃1 h，70℃10min，cDNA合成后保存于-20℃。反應(yīng)體系見(jiàn)表1。

表1 cDNA合成反應(yīng)體系

用RT-PCR儀(Takara，美國(guó))檢測(cè)COPS-3基因表達(dá)，反應(yīng)條件：95℃5s，60℃30s，45個(gè)循環(huán)，反應(yīng)體系見(jiàn)表2。

表2 RT-PCR反應(yīng)體系

5 MMT檢測(cè)Saos-2 siCOPS3細(xì)胞增殖能力 分別將Saos-2 siCOPS3組及Saos-2 CON組細(xì)胞以2000個(gè)/孔接種至96孔板，每組設(shè)5個(gè)副孔，細(xì)胞貼壁后加入20 μl 5mg/ml MTT溶液，37 ℃孵育 4 h后棄去MTT及培養(yǎng)液，每孔加入150 μl二甲基亞砜低速震蕩10 min，用TECAN Nano Quant分光光度計(jì)測(cè)定490 nm吸光值(OD490)，連續(xù)6d，以時(shí)間為橫軸吸光值為縱軸繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

6 裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn) 選取6只4～6周雌性BABL/C裸鼠(第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物房)，隨機(jī)分為Saos-2 CON組(n=3)，Saos-2 siCOPS3組(n=3)。消化Saos-2 CON及Saos-2 siCOPS3細(xì)胞，1000r /min離心5 min，PBS洗滌2次，用PBS 重懸細(xì)胞，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將兩組細(xì)胞分別稀釋成相同濃度的細(xì)胞懸液，以2×106/只對(duì)應(yīng)接種于裸鼠右背部皮下，每3天觀察1次腫瘤形成情況，連續(xù)4周后處死裸鼠測(cè)量腫瘤大小。裸鼠在標(biāo)準(zhǔn)無(wú)菌條件下飼養(yǎng)。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19. 0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，當(dāng)P<0.05 時(shí)，認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Saos-2 siCOPS3細(xì)胞siCOPS3基因mRNA及蛋白水平表達(dá)變化 由圖1 可見(jiàn)，Saos-2 siCOPS3細(xì)胞中，COPS3基因mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組相比下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。由圖2 可見(jiàn)， Saos-2 siCOPS3組細(xì)胞中COPS3基因相關(guān)蛋白表達(dá)的條帶明顯比對(duì)照組細(xì)，其 COPS3基因蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組相比下降。

Saos-2 siCOPS3：感染pLKO.1-COPS3 shRNA病毒質(zhì)粒的人成骨肉瘤細(xì)胞；Saos-2 CON：感染pLKO.1-TRC control(對(duì)照)病毒質(zhì)粒的人成骨肉瘤細(xì)胞;*表示P<0.05

圖1 Saos-2細(xì)胞中COPS3基因mRNA相對(duì)表達(dá)量

圖2 Saos-2細(xì)胞中COPS3相關(guān)蛋白表達(dá)情況

2 Saos-2細(xì)胞增殖能力比較 由圖3 可見(jiàn)，Saos-2 siCOPS3細(xì)胞增殖能力從培養(yǎng)1 d開(kāi)始低于對(duì)照組，并在連續(xù)測(cè)定的5 d中，增殖能力均小于對(duì)照組(P均<0.05)。

圖3 Saos-2細(xì)胞增殖能力變化

3 裸鼠成瘤情況觀察 由圖4、圖5可見(jiàn)，在飼養(yǎng)期內(nèi)，小鼠背部腫瘤體積及重量的變化，接種Saos-2 siCOPS3細(xì)胞液的小鼠腫瘤體積、重量明顯小于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

*表示P<0.05

*表示P<0.01

討 論

在兒童和青少年中，骨肉瘤的發(fā)生嚴(yán)重威脅著他們的健康和生命。骨肉瘤早期發(fā)生時(shí)一般無(wú)典型臨床癥狀，僅有局部疼痛和腫脹，對(duì)于正處生長(zhǎng)發(fā)育期的兒童及青少年來(lái)說(shuō)，其表現(xiàn)容易與生長(zhǎng)痛或者外傷混淆，耽誤診療時(shí)機(jī)，并且骨肉瘤這種原發(fā)性癌癥惡性程度較高。目前臨床上骨肉瘤的治療方法仍以化療和手術(shù)為主，由于耐藥性和肺轉(zhuǎn)移發(fā)生，使骨肉瘤的治療難度進(jìn)一步增加，常規(guī)手段的療效并不理想，治療失敗的情況常存在。所以研發(fā)新的治療策略對(duì)于提高患者生活質(zhì)量以及預(yù)后具有意義重大。

近年來(lái)，隨著基因治療的概念提出，越來(lái)越多的醫(yī)務(wù)工作者嘗試從基因治療的角度上，探究從基因水平抑制骨肉瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移，為治療骨肉瘤提供新的思路。COPS3基因是一種蛋白激酶，能夠分解p53蛋白，使下游基因發(fā)生改變，從而引起基因組的突變，骨肉瘤組織中常伴有COPS3基因的高表達(dá)，它在骨肉瘤的發(fā)生中以原癌基因的形式發(fā)揮作用[4]。有研究指出，在大約50%的高度惡性骨腫瘤樣本中可以檢測(cè)到COPS3的擴(kuò)增和過(guò)表達(dá)[5]，并且在骨肉瘤細(xì)胞中，COPS3擴(kuò)增之后過(guò)表達(dá)會(huì)提高腫瘤細(xì)胞的增殖能力從而導(dǎo)致腫瘤體積的增加[6]，最終會(huì)使患者病情惡化。由于COPS3與骨肉瘤發(fā)生的密切關(guān)系，現(xiàn)在越來(lái)越多研究認(rèn)為可以將其作為骨肉瘤治療的靶基因[7]。

唐彪等[8]在原發(fā)性肝癌的相關(guān)研究中指出，COPS3在肝癌組織中表達(dá)水平和定位均發(fā)生改變，可能參與了肝癌的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程?？讘c彧等[9]肺癌細(xì)胞中以慢病毒為載體，構(gòu)建了COPS3的干擾體系，發(fā)現(xiàn)通過(guò)干擾COPS3基因表達(dá)，癌細(xì)胞增殖能力受到明顯抑制，認(rèn)為COPS3在肺癌發(fā)生發(fā)展中可能起到重要的作用。本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果一致，在基因水平上可見(jiàn)，構(gòu)建慢病毒載體感染人成骨肉瘤(Saos-2)細(xì)胞抑制COPS3基因，可以降低COPS3基因mRNA表達(dá)(P<0.05)，并且在蛋白水平上降低其相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)。湯國(guó)慶等[10]在研究基因的表達(dá)對(duì)骨肉瘤細(xì)胞系增殖和遷移能力的影響時(shí)認(rèn)為，帶有慢病毒載體的COPS3可以特異性抑制骨肉瘤細(xì)胞系中COPS3的表達(dá)，顯著降低骨肉瘤細(xì)胞的增殖和遷移能力。在本研究中，從MMT試驗(yàn)中可見(jiàn)，抑制COPS3基因表達(dá)可以降低Saos-2細(xì)胞增殖能力。曹鶴等[11]人在研究干擾COPS3基因?qū)Ψ伟┘?xì)胞的影響時(shí)認(rèn)為，抑制COPS3基因時(shí)裸小鼠體內(nèi)成瘤體積和質(zhì)量顯著減小。本研究通過(guò)裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)，在體驗(yàn)證了抑制COPS3基因表達(dá)可以明顯的抑制腫瘤的體積及重量增加，與前人研究結(jié)果一致。研究結(jié)果提示，COPS3調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞的增殖，與骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

綜上所述，本研究結(jié)果驗(yàn)證構(gòu)建慢病毒載體(shRNA)感染人成骨肉瘤(Saos-2)細(xì)胞抑制COPS3基因，可以降低COPS3基因mRNA表達(dá)，降低其相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)，降低骨肉瘤細(xì)胞增殖能力，抑制腫瘤的體積及重量增加,為進(jìn)一步探討COPS3調(diào)控骨肉瘤的發(fā)生及發(fā)展的機(jī)制提供依據(jù)。

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(收稿：2016-12-07)

Effect of shRNA interfering COPS3 gene on human osteosarcoma cell line

Chen Jun,Jin Xuerong,Wang Xiang,et al.

Institute of Osteosarcoma, Tangdu Hospital, The Fourth Military Medical University( Xi’an 710038)

Objective: This paper evaluated the effect of shRNA interference COPS3 gene on the gene, protein level and proliferation ability of human osteosarcoma cells. Methods: Human osteosarcoma Saos-2 cells were selected in this study, the cells which infected shRNA pLKO.1-COPS3 virus plasmid were siCOPS3 Saos-2(treatment), meanwhile, which infected pLKO.1-TRC control virus plasmid were CON Saos-2(control). After infection completed, cells was cultured then collected for further analyzing. RT-PCR was used to determine mRNA expression of COPS3 gene, western blot was used to determine the level of protein expression, cell proliferation ability was measured by MMT method, nude mice were inoculated with cell suspension to show tumor formation. Results: In siCOPS3 Saos-2 cells, the mRNA expression level of COPS3 was decreased (P<0.05) , The level of protein expression, cell proliferation ability decreased, the interference of COPS3 gene inhibited tumor volume and weight increase (P<0.05) compared with the control group.Conclusion: The results of this study suggest COPS3 regulates the proliferation of osteosarcoma cells, and is closely related to the occurrence and development of osteosarcoma.

Osteosarcoma/physiopathology @shRNA interfering @COPS3 gene Lentivirus infections Cell proliferation

*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31470075)

骨肉瘤/病理生理學(xué) @shRNA干擾 @COPS3基因 慢病毒感染 細(xì)胞增殖

R363

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.03.002

?通訊作者